專利名稱：帶標記物雙引物聚合酶鏈反應測定方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種帶標記物雙引物PCR測定方法，特別是一種帶熒光素或地高辛標記物的雙引物PCR測定方法。
PCR是英文“Polymerese ChainReaction”的縮寫，中文名稱為聚合酶鏈反應，是近幾年來發(fā)展起來的一種在體外模擬自然DNA復制過程、即它以待擴增的兩條DNA鏈為模板，由引物介導的、DNA聚合酶作用下的、特定DNA片段的快速擴增法，由于PCR技術經(jīng)過變性、復性和延伸約30個循環(huán)就可在2小時內(nèi)將靶DNA擴增數(shù)百萬倍，又具有操作簡單、快速、特異和靈敏的特點，目前已廣泛應用于生物科學的各個領域。其中，有PCR的核酸檢測，但實驗方案的選擇對PCR檢測的成功與否有很大的影響，但PCR過程中往往非特異性的擴增，為了消除假陽性，國外采用了PCR-ELISA方法，但這些方法需在PCR反應后，再加入探針雜交，加抗體酶進行酶聯(lián)免疫反應，其中，僅加探針雜交這一步驟就需2個多小時。
本發(fā)明的目的是提供一種PCR測定方法，該方法操作方便，快速，特異性強，靈敏度高。
為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采取以下設計方案PCR測定方法包括模板DNA的制備，PCR擴增，護增產(chǎn)物的分析，所述的PCR擴增采用雙引物，即內(nèi)引物和外引物，其中生物素標記在內(nèi)引物上或標記在外引物上，熒光素或地高辛標記在內(nèi)引物上，將兩對引物同時加入PCR反應液中，第一次為二步法，即變性90-95℃,20秒；復性延伸68-72℃、40-90秒，進行10-20循環(huán)；第二次為三步法，即變性90-95℃、20秒，復性37-65℃、20-30秒、延伸72℃20-30秒、進行1-10個循環(huán)。
帶標記物的雙引物PCR測定方法的工作原理是兩對引物擴增片段位于同一位置，但外引物較內(nèi)引物擴增片段長，且為內(nèi)引物擴增片段的延伸，在兩步法的條件下，由于內(nèi)引物的堿基序列中G、C含量較低，在68-72℃退火條件下，全都不能復性，結(jié)合到它們的DNA模板上，所以內(nèi)引物完全不工作，而外引物以靶序列為模板，特異地擴增出足夠量的DNA作為第二次擴增的模板，第二次擴增采用三步法，這時外引物所剩無幾，用熒光素或地高辛標記的內(nèi)引物以第一次二步法擴增出的DNA為模板，使DNA數(shù)量大量增值。
下面結(jié)合附圖及實施例對本發(fā)明作進一步說明。
圖1為已有PCR-ELISA檢測示意2a為本發(fā)明帶熒光素標記物的雙引物檢測示意圖(實施例1)圖2a為本發(fā)明帶熒光素標記物的雙引物檢測示意圖(實施例2)圖中R為熒光素或地高辛，B為生物素圖3為檢測試樣HBV、CT、UU的瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果表1檢測試樣HBV·UU的免疫定量測定結(jié)果表2檢測試樣HBV·UU的免疫定量測定結(jié)果。
實施例1對乙型肝炎病毒(HBV)檢測將HBV特異的雙引物(深圳匹基(P·G)生物工程公司制造)及其它復制DNA所需的聚合酶、堿基進行PCR擴增(使用PE2400擴增儀)。
擴增條件二步法 變性 94℃ 20秒 退火延伸 68℃ 90秒 進行20個循環(huán)三步法 變性 94℃ 20秒 退火 60℃ 20秒 延伸 72℃ 20秒 進行10循環(huán)內(nèi)引物量取常規(guī)量，外引物按常規(guī)量稀釋20倍后，產(chǎn)生的瓊脂糖凝膠電泳帶最清晰，外引物擴增產(chǎn)物帶只有淡淡的條帶或看不見，見圖3第1條色帶。
實施例2實驗條件同實施例1，只是陽模中擴增產(chǎn)物稀釋50倍，電泳帶仍然清楚，見圖3中第2條色帶。
實施例3對沙眼支原體(CT)檢測將CT特異的雙引物(深圳匹基(P·G)生物工程公司制造)及其他復制DNA所需的聚合酶、堿基進行PCR擴增(使用PE2400擴增儀)。
擴增條件二步法 變性 95℃ 20秒 退火延伸 72℃ 40秒 進行20個循環(huán)三步法 變性 95℃ 20秒 退火 55℃ 20秒延伸 72℃ 30秒 進行10個循環(huán)內(nèi)引物量取常規(guī)量、外引物按常規(guī)量稀釋20倍后，產(chǎn)生的瓊脂糖凝膠電泳帶。最清晰、外引物擴增產(chǎn)物帶只有淡淡的條帶或看不見，見圖3第3條帶。
實施例4實驗條件同實施例3，只是陽模中擴增產(chǎn)物稀釋50倍，電泳帶仍然清楚、見圖3中第4條色帶。
實施例5對解脲支原體(UU)的檢測將UU特異的雙引物(深圳匹基(P·G)生物工程公司制造)及其它復制DNA所需的聚合酶，堿基進行PCR擴增(使用PE2400擴增儀)。
擴增條件二步法 變性 90℃ 20秒 退火延伸 72℃ 90秒 進行20個循環(huán)三步法 變性 90℃ 20秒 退火 65℃ 20秒 延伸 72℃ 20秒 進行10個循環(huán)內(nèi)引物量為常規(guī)量，外引物按常規(guī)量稀釋20倍后，產(chǎn)生的瓊脂糖凝膠電泳帶，最清晰外引物擴增產(chǎn)物帶只有淡淡的條帶或看不見，見圖3第5條帶。
表1、表2中，系將實施例1、實施例5中的陽膜稀釋，1∶1000表示所用抗體稀釋倍數(shù)。
測定時間為5秒、15秒、從表中可以看出在抗體量稀釋1000倍，陽模稀釋100000倍情況下，還可以定量出特異的核酸，靈敏度大大提高。
本發(fā)明優(yōu)點由于采用二步、三步方法，使操作步驟減少，節(jié)約2個多小時的探針雜交時間，而且特異性提高，靈敏度也提高了10-1000倍，由于以引物內(nèi)標記PCR，所以完全消除了假陽性。
1∶1000 5’
表11∶1000 15
表權利要求
1.一種帶標記物雙引物聚合酶鏈反應測定方法，它包括模板DNA的制備、PCR擴增、擴增產(chǎn)物的分析，其特征在于所述的PCR擴增采用雙引物，即內(nèi)引物和外引物，其中，生物素標記內(nèi)引物上或標記在外引物上，熒光素或地高辛標記在內(nèi)引物上，二對引物同時加入PCR反應液中，第一次為二步法90-95℃、20秒、復性、延伸68-72℃、40-90秒進行10-20循環(huán)；第二次為三步法，變性90-95℃、20秒復性37-65℃、20-30秒、延伸72℃、20-30秒、進行1-10個循環(huán)。
2.根據(jù)權利要求1所述的帶標記物雙引物聚合酶鏈反應測定方法，其特征在于所述的兩引物擴增片段位于同一位置，外引物較內(nèi)引物擴增片段長，且為內(nèi)引物擴增片段的延伸。
3.根據(jù)權利要求1所述的帶標記物雙引物聚合酶鏈反應測定方法，其特征在于擴增產(chǎn)物作瓊脂糖凝膠電泳分析時，內(nèi)引物用量常量，外引物用量為常量至少稀釋20倍。
全文摘要
一種帶標記物雙引物聚合酶鏈反應測定方法,它包括:模板DNA的制備、PCR擴增、擴增產(chǎn)物的分析,PCR擴增采用雙引物,其中生物素可標記內(nèi)引物或標記在外引物上,熒光素或地高辛標記在內(nèi)引物上,二對引物同時加入PCR反應液中,第一次為二步法:90—95℃、20秒復性、延伸68—72℃、40—90秒進行10—20循環(huán);第二次為三步法,變性90—95℃、20秒復性37—65℃、20—30秒、延伸72℃、20—30秒進行1—10個循環(huán)。方法簡便、快速、特異性、靈敏度高,消除了假陽性。
文檔編號G01N33/50GK1235275SQ9810147
公開日1999年11月17日 申請日期1998年5月13日 優(yōu)先權日1998年5月13日
發(fā)明者朱文斯 申請人:朱文斯