一種催化合成丙谷二肽的生物酶及其制備方法和應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供一種催化合成丙谷二肽的生物酶及其制備方法和應(yīng)用。所述生物酶為SEQID NO:2所示的氨基酸序列；所述生物酶的制備，首先構(gòu)建生物酶的基因工程菌株，將全基因合成的生物酶基因片段，利用限制性內(nèi)切酶SalI線性化重組質(zhì)粒。將陽性克隆挑入YPD液體培養(yǎng)基活化后轉(zhuǎn)接入BMGY液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)至OD為1.0時(shí)接入1％甲醇誘導(dǎo)，誘導(dǎo)72h，用于表達(dá)生物酶，經(jīng)過進(jìn)一步發(fā)酵獲得催化合成丙谷二肽的生物酶。利用該生物酶催化合成丙谷二肽；經(jīng)過加熱失活、過濾后，采用納濾技術(shù)除去生成的鹽，濃縮后用甲醇和水析晶，得到高純度的丙谷二肽。此合成方法簡(jiǎn)單，高效，而且環(huán)保，具有極高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值和市場(chǎng)競(jìng)爭(zhēng)力。
【專利說明】一種催化合成丙谷二肽的生物酶及其制備方法和應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種合成丙谷二肽的方法，尤其是采用高效的生物酶催化和現(xiàn)代化的 分離技術(shù)的丙谷二肽生物合成方法，具體是一種催化合成丙谷二肽的生物酶及其制備方法 和應(yīng)用。

【背景技術(shù)】
[0002] N(2) -L-丙氨酞-L-谷氨酸胺屬于氨基酸的衍生物，簡(jiǎn)稱丙谷二肽，主要用于人體 保健行業(yè)，是人體含量最豐富的氨基酸谷氨酰胺的理想替代品。
[0003] 由于谷氨酰胺極為重要的生理功能和藥理作用，使其在腸外營養(yǎng)中的應(yīng)用受到人 們普遍的重視。但是由于它的溶解度低，而且溶液中不穩(wěn)定，在加熱滅菌的條件下，生成有 毒的焦谷酸和氨，所以商品氨基酸制劑中都不含有谷氨酰胺。只有將其轉(zhuǎn)化為穩(wěn)定的衍生 物才能對(duì)人體起作用。
[0004] 相對(duì)于谷氨酰胺而言，丙谷二肽的溶解度是谷氨酸胺的20倍，在儲(chǔ)存和加熱滅菌 中也很穩(wěn)定，可直接制備成輸液制劑用于臨床。丙谷二肽進(jìn)入人體后即迅速分解成谷氨酰 胺而發(fā)揮作用。研究證明，丙谷二肽在體內(nèi)很快被分解為其組成氨基酸，半衰期很短，血液 中只能檢測(cè)到少量的二肽，僅有微量的二肽從尿液中排出，說明丙谷二肽可有效的被利用 而且不會(huì)在血液中積聚，避免了可能產(chǎn)生的藥理及生理性損害。健康人體長(zhǎng)期靜脈滴注丙 谷二肽沒有任何副作用及不良反應(yīng)，不影響正常的腎功能。
[0005] CN101659691A和CN1786019A公開了一種丙谷二肽的化學(xué)合成和工業(yè)化生產(chǎn)方法 (如下路線），但是該方法反應(yīng)合成路線長(zhǎng)，環(huán)境污染大，工藝成本高。
[0006]

【權(quán)利要求】
1. 一種催化丙谷二肽生物合成的生物酶，所述生物酶為SEQ ID NO:2所示的氨基酸序 列。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述催化丙谷二肽的生物合成的生物酶，其特征在于，所述生物酶 來源于體外重組構(gòu)建的基因工程菌株；所述基因工程菌株為大腸桿菌、畢赤酵母、枯草芽孢 桿菌。
3. -種編碼權(quán)利要求1所述的生物酶的核苷酸序列，所述核苷酸序列如SEQ ID NO :1 所示。
4. 一種權(quán)利要求1所述的生物酶的制備方法，包括如下步驟： (1) 首先構(gòu)建丙谷二肽生物酶的基因工程菌株，將權(quán)利要求3所述的核苷酸序列經(jīng)酶 切重組到表達(dá)載體，轉(zhuǎn)化到宿主細(xì)胞中； (2) 將陽性克隆挑入YH)液體培養(yǎng)基活化后轉(zhuǎn)接入BMGY液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)，最后經(jīng)發(fā) 酵，得到催化合成丙谷二肽用的生物酶。
5. -種權(quán)利要求1所述的生物酶催化丙谷二肽的生物合成的方法，其特征在于，包括 如下步驟： (1) 把L-丙氨酸甲酯鹽酸鹽溶于水中； (2) 將L-谷氨酰胺加入水中，降溫至5-15°C，用堿調(diào)pH至8. 5-9. 5,形成反應(yīng)體系； (3) 將所述的生物酶加入到L-谷氨酰胺的反應(yīng)體系中，并將（1)中配好的L-丙氨酸 甲酯水溶液加入所述反應(yīng)體系中，滴加堿水，pH保持在8. 5-9. 5 ; (4) pH不變時(shí)，反應(yīng)結(jié)束，加熱反應(yīng)體系，升溫至60-100°C，使生物酶失活，過濾除生物 酶； (5) 所得濾液除鹽后，減壓蒸餾至固體析出； (6) 經(jīng)離心分離后，得丙谷二肽粗品； (7) 用甲醇和水精制，得丙谷二肽產(chǎn)品。
6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的丙谷二肽的生物合成方法，其特征在于，所述步驟（1)中所得 到L-丙氨酸甲酯鹽酸鹽的水溶液的質(zhì)量濃度為30-60%。
7. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的丙谷二肽的生物合成方法，其特征在于，所述步驟（3)中所述 生物酶的用量為谷氨酰胺質(zhì)量的〇. 1-1. 0%。
8. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的丙谷二肽的生物合成方法，其特征在于，所述谷氨酰胺和 L-丙氨酸甲酯鹽酸鹽的用量為：谷氨酰胺：50 - 155g/L ;L-丙氨酸甲酯鹽酸鹽70 -350g/L。
9. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的丙谷二肽的生物合成方法，其特征在于，所述步驟（4)中還加 入活性炭脫色，促進(jìn)過濾，所述活性炭的用量為反應(yīng)液質(zhì)量的3-8%。
10. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的丙谷二肽的生物合成方法，其特征在于，所述堿選自LiOH、 NaOH、KOH、NH40H、1(20)3和 Na 20)3中的一種或一種以上。
【文檔編號(hào)】C12R1/19GK104480075SQ201410670694
【公開日】2015年4月1日 申請(qǐng)日期:2014年11月20日 優(yōu)先權(quán)日:2014年11月20日
【發(fā)明者】邢將軍 申請(qǐng)人:江蘇誠信藥業(yè)有限公司