一種半月板組織來(lái)源的間充質(zhì)干細(xì)胞及其制備方法和鑒定的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種半月板組織來(lái)源的間充質(zhì)干細(xì)胞的分離方法，包括如下步驟：(1)取半月板組織，剪成組織碎塊，用包含I型膠原酶和II型膠原酶的混合膠原酶溶液消化4～6h；(2)終止消化，用100～400目篩網(wǎng)過(guò)濾，1000～2000rpm離心4～10min，棄上清，PBS洗滌3次，重懸于間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)基中，置于37℃、5％CO2條件下培養(yǎng)，2～3天后棄去非貼壁細(xì)胞和碎片，換液，此后每3天換液一次，在細(xì)胞融合度為80％～90％時(shí)收獲細(xì)胞，即可。本發(fā)明分離得到的間充質(zhì)干細(xì)胞，綜合半月板細(xì)胞的穩(wěn)定表型和間充質(zhì)干細(xì)胞“干性”特征兩者的優(yōu)點(diǎn)，其分化確切，生物活性優(yōu)良，是未來(lái)半月板再生及其轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)研究中較為理想的一種種子細(xì)胞來(lái)源，臨床應(yīng)用前景良好。
【專利說(shuō)明】一種半月板組織來(lái)源的間充質(zhì)干細(xì)胞及其制備方法和鑒定

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種半月板組織來(lái)源的間充質(zhì)干細(xì)胞及其制備方法和鑒定。

【背景技術(shù)】
[0002]半月板在維持膝關(guān)節(jié)穩(wěn)態(tài)方面發(fā)揮非常重要的生物力學(xué)和生物化學(xué)功能，包括吸收震蕩、傳遞載荷、穩(wěn)定關(guān)節(jié)、分散應(yīng)力及發(fā)揮膝關(guān)節(jié)的本體感覺(jué)等。半月板損傷是臨床上非常常見(jiàn)的與運(yùn)動(dòng)和年齡相關(guān)的病變。解剖結(jié)構(gòu)的損傷將導(dǎo)致關(guān)節(jié)退變和骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)生，并伴有不同程度的關(guān)節(jié)功能障礙。半月板損傷后的治療一直是骨科及運(yùn)動(dòng)醫(yī)學(xué)基礎(chǔ)研究和臨床實(shí)踐面臨的難題。目前臨床針對(duì)半月板損傷的處理手段大體包括半月板切除、縫合修復(fù)、重建三個(gè)方面。半月板部分或全部切除都將導(dǎo)致膝關(guān)節(jié)不穩(wěn)，繼而出現(xiàn)逐漸進(jìn)展的關(guān)節(jié)退變。臨床上采用縫合修復(fù)的指征也相當(dāng)有限，僅適用于一些單一縱裂的新鮮損傷類型。盡管同種異體半月板移植被認(rèn)為是半月板缺損或切除后治療的金標(biāo)準(zhǔn)，但長(zhǎng)期的隨訪及組織學(xué)結(jié)果顯示僅有表淺部位少量的宿主細(xì)胞長(zhǎng)入，再者供體來(lái)源不足、組織處理及保存技術(shù)、半月板大小的匹配、手術(shù)固定技術(shù)以及半月板組織存活的細(xì)胞分子研究極大地限制其進(jìn)一步的臨床應(yīng)用。
[0003]種子細(xì)胞為基礎(chǔ)的組織工程及再生醫(yī)學(xué)策略為半月板的生物學(xué)再生帶來(lái)新的希望。目前用于半月板再生的種子細(xì)胞主要分為分化成熟的半月板細(xì)胞和間充質(zhì)干細(xì)胞。
[0004]終末分化成熟的自體半月板細(xì)胞來(lái)源于損傷的半月板組織，其來(lái)源于自體及確切的半月板細(xì)胞表型特征，一直被認(rèn)為是半月板再生最理想的種子細(xì)胞；但是其作為種子細(xì)胞也存在一些問(wèn)題:需要兩次手術(shù)、病變組織來(lái)源的半月板細(xì)胞數(shù)量非常有限、且缺乏增殖能力和正常半月板細(xì)胞的生物活性等。
[0005]中胚層來(lái)源的成體間充質(zhì)干細(xì)胞因其來(lái)源廣泛、優(yōu)良的自我更新、多向分化潛能、免疫調(diào)節(jié)、定向歸巢以及無(wú)倫理道德方面爭(zhēng)議等優(yōu)點(diǎn)被廣泛用于半月板再生醫(yī)學(xué)領(lǐng)域。在體內(nèi)外適當(dāng)?shù)臈l件下，間充質(zhì)干細(xì)胞能分化為中胚層、甚至內(nèi)外胚層的組織細(xì)胞。但是，另一方面，間充質(zhì)干細(xì)胞在體外培養(yǎng)擴(kuò)增過(guò)程中可能出現(xiàn)轉(zhuǎn)化、衰老或凋亡現(xiàn)象，常伴隨細(xì)胞增殖能力和分化潛能的下降，逐漸失去其“干性”特點(diǎn)。再者，間充質(zhì)干細(xì)胞最傳統(tǒng)經(jīng)典的來(lái)源是骨髓，但其含量非常低(僅占有核細(xì)胞的0.01%?0.001% )，且存在供區(qū)并發(fā)癥等缺點(diǎn)。因此開(kāi)發(fā)其他來(lái)源的間充質(zhì)干細(xì)胞用于半月板的修復(fù)重建非常有意義。盡管目前有很多其他組織，如脂肪或滑膜組織等來(lái)源間充質(zhì)干細(xì)胞用于半月板再生的種子細(xì)胞的報(bào)道，但是這些組織來(lái)源間充質(zhì)干細(xì)胞最大的缺點(diǎn)是其分化為半月板細(xì)胞的不確切性，導(dǎo)致修復(fù)效果不佳。
[0006]綜上，目前用于半月板組織修復(fù)的種子細(xì)胞要么“干性”不足，要么難以有效分化為半月板細(xì)胞，導(dǎo)致修復(fù)效果不佳。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]為了解決上述問(wèn)題，本發(fā)明提供了一種半月板組織來(lái)源的間充質(zhì)干細(xì)胞及其制備方法和鑒定。
[0008]本發(fā)明半月板組織來(lái)源的間充質(zhì)干細(xì)胞的分離方法，包括如下步驟:
[0009](I)取半月板組織，剪成組織碎塊，用包含I型膠原酶和II型膠原酶的混合膠原酶溶液消化4?6h，其中，混合膠原酶溶液中，I型膠原酶和II型膠原酶的濃度均為0.1%?0.5% (w/v)；
[0010](2)終止消化，用100?400目篩網(wǎng)過(guò)濾，1000?2000rpm離心4?lOmin，棄上清，PBS洗滌3次，重懸于間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)基中，置于37°C、5% CO2、條件下培養(yǎng)，2?3天后棄去非貼壁細(xì)胞和碎片，換液，此后每3天換液一次,在細(xì)胞融合度為80%?90%時(shí)收獲細(xì)胞，即可。
[0011]步驟(I)中，所述組織碎塊的體積為I?5mm3。
[0012]步驟(I)中，所述消化是在37°C、30?300轉(zhuǎn)/分條件下振蕩消化。
[0013]步驟(I)中，所述混合膠原酶溶液中，I型膠原酶和II型膠原酶的濃度均為0.2%(w/v);所述I型膠原酶溶液是包含膠原酶的低糖DMEM培養(yǎng)基。
[0014]步驟⑵中，所述終止消化的方法是:加入細(xì)胞懸液1/2?3倍體積的含10% FBS的低糖DMEM培養(yǎng)基。
[0015]步驟(2)中，所述篩網(wǎng)為200目篩。
[0016]步驟(2)中，所述離心的轉(zhuǎn)速為1200rpm,離心時(shí)間為5min。
[0017]步驟⑵中，細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)，環(huán)境的相對(duì)濕度為95%。
[0018]步驟⑵中，所述間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)基是添加有10% FBS, 3.7g/LNaHC03,100U/ml青霉素，100 μ g/ml鏈霉素，25ng/ml兩性霉素B，2mM L-谷氨酰胺的低糖DMEM培養(yǎng)基。
[0019]本發(fā)明還提供了前述方法分離得到的間充質(zhì)干細(xì)胞。
[0020]FBS:胎牛血清。
[0021]目前，通常認(rèn)為間充質(zhì)干細(xì)胞存在于骨髓、外周血、臍血、松質(zhì)骨、脂肪組織、滑膜和臍帶中，但是用這些來(lái)源的間充質(zhì)干細(xì)胞用于半月板修復(fù)均存在缺陷，如，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞含量非常低(僅占有核細(xì)胞的0.01%?0.001% )，且存在供區(qū)并發(fā)癥等缺點(diǎn)，而其他組織來(lái)源的干細(xì)胞又不能確切分化為半月板細(xì)胞，導(dǎo)致修復(fù)效果不好。
[0022]然而，發(fā)明人卻從半月板組織分離得到了間充質(zhì)干細(xì)胞，綜合半月板細(xì)胞的穩(wěn)定表型和間充質(zhì)干細(xì)胞“干性”特征兩者的優(yōu)點(diǎn)，可以克服前述其他來(lái)源間充質(zhì)干細(xì)胞用于修復(fù)半月板存在的問(wèn)題。
[0023]本發(fā)明半月板組織來(lái)源的間充質(zhì)干細(xì)胞，綜合半月板細(xì)胞的穩(wěn)定表型和間充質(zhì)干細(xì)胞“干性”特征兩者的優(yōu)點(diǎn)，可以制備成為半月板組織修復(fù)用種子細(xì)胞，用于修復(fù)半月板組織，臨床應(yīng)用前景良好。
[0024]以下通過(guò)實(shí)施例形式的【具體實(shí)施方式】，對(duì)本發(fā)明的上述內(nèi)容作進(jìn)一步的詳細(xì)說(shuō)明。但不應(yīng)將此理解為本發(fā)明上述主題的范圍僅限于以下的實(shí)施例。凡基于本發(fā)明上述內(nèi)容所實(shí)現(xiàn)的技術(shù)均屬于本發(fā)明的范圍。

【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0025]圖1半月板損傷的MR1、關(guān)節(jié)鏡下發(fā)現(xiàn)、大體觀察；
[0026]圖2半月板碎片來(lái)源的間充質(zhì)干細(xì)胞顯微鏡下的形態(tài)；
[0027]圖3半月板碎片來(lái)源的組織特異間充質(zhì)干細(xì)胞的表面標(biāo)記；
[0028]圖4半月板碎片來(lái)源的組織特異間充質(zhì)干細(xì)胞的成骨分化；
[0029]圖5半月板碎片來(lái)源的組織特異間充質(zhì)干細(xì)胞的成脂分化；
[0030]圖6半月板碎片來(lái)源的組織特異間充質(zhì)干細(xì)胞的成軟骨分化。

【具體實(shí)施方式】
[0031]實(shí)驗(yàn)材料和試劑:
[0032]磷酸緩沖鹽溶液(PBS)，I型膠原酶，II型膠原酶，低糖DMEM(含lg/L葡萄糖，購(gòu)自Gibco)，高糖DMEM (含4.5g/L葡萄糖)，胰酶消化液(0.25%胰酶/0.1 % EDTA)，CD44抗體，CD90抗體，CD105抗體，CD34抗體，CD45抗體，II型膠原抗體，成骨誘導(dǎo)液，成脂誘導(dǎo)液，成脂誘導(dǎo)維持液，成軟骨誘導(dǎo)液，茜素紅染液，油紅O染液，甲苯胺藍(lán)染液，阿爾新藍(lán)染液。
[0033]實(shí)施例1本發(fā)明半月板組織來(lái)源的間充質(zhì)干細(xì)胞的分離及檢測(cè)
[0034]一、分離及檢測(cè)方法
[0035]1、半月板碎片的取材
[0036]通過(guò)患者的臨床表現(xiàn)、MRI和關(guān)節(jié)鏡下的陽(yáng)性發(fā)現(xiàn)綜合判斷確診為半月板損傷(詳見(jiàn)圖1)。在關(guān)節(jié)鏡下用髓核鉗取出半月板碎片(詳見(jiàn)圖1)。在顯微鏡下切除帶血管的組織、周圍附著的滑膜和韌帶，置于含有雙抗的PBS中漂洗3次。
[0037]2、半月板碎片來(lái)源的組織特異間充質(zhì)干細(xì)胞的分離培養(yǎng)
[0038]用眼科剪將取材的半月板碎片剪成約I?5mm3大小的組織碎塊，然后在0.2% I型、0.2% II型混合膠原酶(I型、II型膠原酶的濃度均為0.2%)(低糖DMEM配置)中37°C恒溫水浴搖床振蕩(150轉(zhuǎn)/分)消化4?6h。經(jīng)顯微鏡觀察，大部分細(xì)胞消化下來(lái)后用巴氏吸管吹打3min，加入細(xì)胞懸液等體積的含10% FBS的低糖DMEM新鮮培養(yǎng)基終止消化，用200目篩網(wǎng)過(guò)濾消化后的細(xì)胞懸液，1200rpm離心5min，棄上清，PBS洗滌3次，顯微鏡下細(xì)胞計(jì)數(shù)后細(xì)胞按I X 16/瓶(25cm2培養(yǎng)瓶)重懸于完全培養(yǎng)基(低糖DMEM，10%FBS，3.7g/L NaHCO3,100U/ml青霉素，100 μ g/ml鏈霉素，25ng/ml兩性霉素B，2mM L-谷氨酰胺)中，置于37°C含5% CO2和95%濕度的培養(yǎng)箱中孵育。隔日倒置相差顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)變化和生長(zhǎng)情況。2?3天后棄去非貼壁細(xì)胞和細(xì)胞碎片，更換新的完全培養(yǎng)基。此后每3天換液一次。培養(yǎng)大約10?14天，細(xì)胞達(dá)到80%?90%融合，用0.25%胰酶/0.1 % EDTA按1:2或1:3的比例消化傳代。收集第3代細(xì)胞用于后面的實(shí)驗(yàn)。
[0039]實(shí)施例2本發(fā)明半月板組織來(lái)源的間充質(zhì)干細(xì)胞的分離及檢測(cè)
[0040]一、分離及檢測(cè)方法
[0041]1、半月板碎片的取材
[0042]通過(guò)患者的臨床表現(xiàn)、MRI和關(guān)節(jié)鏡下的陽(yáng)性發(fā)現(xiàn)綜合判斷確診為半月板損傷(詳見(jiàn)圖1)。在關(guān)節(jié)鏡下用髓核鉗取出半月板碎片(詳見(jiàn)圖1)。在顯微鏡下切除帶血管的組織、周圍附著的滑膜和韌帶，置于含有雙抗的PBS中漂洗3次。
[0043]2、半月板碎片來(lái)源的組織特異間充質(zhì)干細(xì)胞的分離培養(yǎng)
[0044]用眼科剪將取材的半月板碎片剪成約I?5mm3大小的組織碎塊，然后在0.1 % I型、0.1% II型混合膠原酶(I型、II型膠原酶的濃度均為0.2%)(低糖DMEM配置)中37°C恒溫水浴搖床振蕩(30轉(zhuǎn)/分)消化4?6h。經(jīng)顯微鏡觀察，大部分細(xì)胞消化下來(lái)后用巴氏吸管吹打3min，加入細(xì)胞懸液等1/2體積的含10% FBS的低糖DMEM新鮮培養(yǎng)基終止消化，用100目篩網(wǎng)過(guò)濾消化后的細(xì)胞懸液，100rpm離心lOmin，棄上清，PBS洗滌3次，顯微鏡下細(xì)胞計(jì)數(shù)后細(xì)胞按I X 16/瓶(25cm2培養(yǎng)瓶)重懸于完全培養(yǎng)基(低糖DMEM，10%FBS，3.7g/L 似!10)3，10(^/1111青霉素，10(^8/1111鏈霉素，25叩/1111兩性霉素8，21111 L-谷氨酰胺)中，置于37°C含5% CO2和95%濕度的培養(yǎng)箱中孵育。隔日倒置相差顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)變化和生長(zhǎng)情況。2?3天后棄去非貼壁細(xì)胞和細(xì)胞碎片，更換新的完全培養(yǎng)基。此后每3天換液一次。培養(yǎng)大約10?14天，細(xì)胞達(dá)到80%?90%融合，用0.25%胰酶/0.1%EDTA按1:2或1:3的比例消化傳代。
[0045]實(shí)施例3本發(fā)明半月板組織來(lái)源的間充質(zhì)干細(xì)胞的分離及檢測(cè)
[0046]一、分離及檢測(cè)方法
[0047]1、半月板碎片的取材
[0048]通過(guò)患者的臨床表現(xiàn)、MRI和關(guān)節(jié)鏡下的陽(yáng)性發(fā)現(xiàn)綜合判斷確診為半月板損傷(詳見(jiàn)圖1)。在關(guān)節(jié)鏡下用髓核鉗取出半月板碎片(詳見(jiàn)圖1)。在顯微鏡下切除帶血管的組織、周圍附著的滑膜和韌帶，置于含有雙抗的PBS中漂洗3次。
[0049]2、半月板碎片來(lái)源的組織特異間充質(zhì)干細(xì)胞的分離培養(yǎng)
[0050]用眼科剪將取材的半月板碎片剪成約I?5mm3大小的組織碎塊，然后在0.5% I型、0.5% II型混合膠原酶(I型、II型膠原酶的濃度均為0.2%)(低糖DMEM配置)中37°C恒溫水浴搖床振蕩(300轉(zhuǎn)/分)消化4?6h。經(jīng)顯微鏡觀察，大部分細(xì)胞消化下來(lái)后用巴氏吸管吹打3min，加入細(xì)胞懸液3倍體積的含10% FBS的低糖DMEM新鮮培養(yǎng)基終止消化，用400目篩網(wǎng)過(guò)濾消化后的細(xì)胞懸液，2000rpm離心4min，棄上清，PBS洗滌3次，顯微鏡下細(xì)胞計(jì)數(shù)后細(xì)胞按I X 16/瓶(25cm2培養(yǎng)瓶)重懸于完全培養(yǎng)基(低糖DMEM，10%FBS，
3.7g/L 似!10)3，10(^/1111青霉素，10(^8/1111鏈霉素，25叩/1111兩性霉素8，21111 L-谷氨酰胺)中，置于37°C含5% CO2和95%濕度的培養(yǎng)箱中孵育。隔日倒置相差顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)變化和生長(zhǎng)情況。2?3天后棄去非貼壁細(xì)胞和細(xì)胞碎片，更換新的完全培養(yǎng)基。此后每3天換液一次。培養(yǎng)大約10?14天，細(xì)胞達(dá)到80%?90%融合，用0.25%胰酶/0.1%EDTA按1:2或1:3的比例消化傳代。
[0051]以下用實(shí)驗(yàn)例的方式說(shuō)明本發(fā)明的有益效果:
[0052]實(shí)驗(yàn)例I半月板組織來(lái)源的間充質(zhì)干細(xì)胞的特性檢測(cè)
[0053]一、檢測(cè)方法
[0054]取實(shí)施例1制備的半月板組織來(lái)源的間充質(zhì)干細(xì)胞，按照如下方法檢測(cè)各特性:
[0055]1、半月板碎片來(lái)源的組織特異間充質(zhì)干細(xì)胞的表面標(biāo)記
[0056]通過(guò)FCM分析第3代半月板碎片來(lái)源的間充質(zhì)干細(xì)胞的免疫表型。選擇⑶44、⑶90和⑶105作為陽(yáng)性標(biāo)記，⑶34和⑶45作為陰性標(biāo)記。收集生長(zhǎng)良好的第3代細(xì)胞，以I X 16細(xì)胞/ml的細(xì)胞密度重懸于PBS中，于FITC標(biāo)記的⑶44或純化⑶90、⑶105、⑶34、⑶45抗體溶液中孵育lh，加入一定體積FITC標(biāo)記的二抗孵育30min。每管檢測(cè)都設(shè)計(jì)同型抗體IgG對(duì)照以消除非特異染色。經(jīng)洗滌后于流式固定液中固定30min。至少10000個(gè)細(xì)胞通過(guò)流式細(xì)胞儀進(jìn)行分析，上機(jī)檢測(cè)。
[0057]2、半月板碎片來(lái)源的組織特異間充質(zhì)干細(xì)胞的多向分化潛能
[0058]通過(guò)成骨、成脂和成軟骨三系分化來(lái)評(píng)價(jià)間充質(zhì)干細(xì)胞的多向分化潛能
[0059]成骨分化:取生長(zhǎng)良好的第3代半月板碎片來(lái)源的間充質(zhì)干細(xì)胞，以3X103/cm2的密度接種于6孔板中，24小時(shí)后棄去培養(yǎng)基，加入2ml成骨誘導(dǎo)液(高糖DMEM，10% FBS,0.1 μ M地塞米松，1mM β-甘油磷酸鈉，50 μ M抗壞血酸，2mM L-谷氨酰胺，I %雙抗)。每3天換液一次，誘導(dǎo)2周。采用茜素紅染色和ALP染色評(píng)估成骨礦化和早期特異成骨基質(zhì)的分泌情況。并通過(guò)Real-tine PCR檢測(cè)成骨特異基因的表達(dá)。
[0060]成脂分化:取生長(zhǎng)良好的第3代半月板碎片來(lái)源的間充質(zhì)干細(xì)胞，以3X103/cm2的密度接種于6孔板中，24小時(shí)后棄去培養(yǎng)基，加入2ml成脂誘導(dǎo)液(高糖DMEM，10% FBS,I μ M地塞米松，0.5mMIBMX, 10g/ml胰島素，10mM吲哚美辛，2mM L-谷氨酰胺，I %雙抗)，3天后換成成脂維持液(高糖DMEM，10% FBS, 10g/ml胰島素，2mM L-谷氨酰胺，I %雙抗)，24h后再換成成脂誘導(dǎo)液，如此循環(huán)，至到2周。采用油紅O染色評(píng)估細(xì)胞質(zhì)內(nèi)脂滴形成情況。并通過(guò)Real-tine PCR檢測(cè)成脂特異基因的表達(dá)。
[0061]成軟骨分化:采用三維細(xì)胞微團(tuán)和無(wú)血清培養(yǎng)體系評(píng)價(jià)半月板碎片來(lái)源的間充質(zhì)干細(xì)胞的成軟骨能力。收集IX 16生長(zhǎng)良好的第3代半月板碎片來(lái)源的間充質(zhì)干細(xì)胞，在15毫升的聚丙烯錐形離心管中懸于Iml成軟骨誘導(dǎo)液[100X ITS(6.25 μ g/ml胰島素，6.25 μ g/ml轉(zhuǎn)鐵蛋白，5.35 μ g/ml亞麻酸，6.25ng/ml牛血清白蛋白，6.25 μ g/ml亞硒酸),lmmol/L丙酮酸鈉,0.17mmol/L抗壞血酸,0.1 μ M地塞米松,0.35mmol/L脯氨酸，10ng/mlTGFβ 3]中，1500rpm/min離心10分鐘，置于37°C含5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每3天換液一次，至到3周。行HE、甲苯胺藍(lán)、阿爾新藍(lán)、II型膠原免疫組化染色評(píng)估微球大體及軟骨特異細(xì)胞外基質(zhì)的分泌情況。并通過(guò)Real-tine PCR檢測(cè)成軟骨特異基因的表達(dá)。
[0062]二、檢測(cè)結(jié)果
[0063]1、形態(tài)特征
[0064]如圖2所示，原代接種4?6天后分離獲得的細(xì)胞呈典型的長(zhǎng)梭形的成纖維細(xì)胞樣形態(tài)㈧；10?14天后培養(yǎng)的細(xì)胞達(dá)到80%?90%融合，呈旋渦狀生長(zhǎng)⑶；傳代至第3代后細(xì)胞較均一(C)。
[0065]結(jié)果證明，本發(fā)明分離獲得的細(xì)胞呈間充質(zhì)干細(xì)胞形態(tài)。
[0066]2、分離細(xì)胞的表面標(biāo)記
[0067]如圖3所示，本發(fā)明分離獲得的細(xì)胞，表達(dá)典型的間充質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記⑶44、⑶90和⑶105 (95 %以上)，而不表達(dá)造血系細(xì)胞標(biāo)記⑶34和⑶45 (5 %以下)。
[0068]結(jié)果證明，本發(fā)明分離獲得的細(xì)胞表達(dá)間充質(zhì)干細(xì)胞標(biāo)記。
[0069]3、細(xì)胞分化
[0070]如圖4所示，本發(fā)明分離獲得的細(xì)胞經(jīng)成骨誘導(dǎo)14天后茜素紅和ALP染色陽(yáng)性，Real-tine PCR檢測(cè)顯示表達(dá)成骨特異基因Runx2，OCN, ALP和I型膠原。
[0071]如圖5所示，本發(fā)明分離獲得的細(xì)胞經(jīng)成脂誘導(dǎo)14天后光鏡下可見(jiàn)透亮的脂滴形成，油紅O染色陽(yáng)性，Real-tine PCR檢測(cè)顯示表達(dá)成脂特異基因PPAR- y , Adiponect1n,LPL，PAS 和 aP2。
[0072]如圖6所示，本發(fā)明分離獲得的細(xì)胞經(jīng)在三維細(xì)胞微團(tuán)和無(wú)血清條件下成軟骨誘導(dǎo)21天后，HE染色顯示細(xì)胞圓形位于微團(tuán)里面，甲苯胺藍(lán)、阿爾新藍(lán)和免疫組化染色陽(yáng)性顯示軟骨特異細(xì)胞外基質(zhì)GAG和II型膠原表達(dá)，Real-tine PCR檢測(cè)顯示表達(dá)成軟骨特異基因S0X-9，II型膠原和GAG。
[0073]結(jié)果證明，本發(fā)明分離獲得的細(xì)胞具有分化成骨、成脂、成軟骨的能力。
[0074]實(shí)驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明，本發(fā)明分離獲得的細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)，呈典型的長(zhǎng)梭形的成纖維細(xì)胞樣形態(tài)，表達(dá)典型的間充質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記⑶44、⑶90和⑶105，而不表達(dá)造血系細(xì)胞標(biāo)記⑶34和CD45，在適當(dāng)?shù)臈l件下具有分化成骨、成脂、成軟骨的能力，經(jīng)鑒定為間充質(zhì)干細(xì)胞。
[0075]本發(fā)明半月板碎片來(lái)源的間充質(zhì)干細(xì)胞綜合半月板細(xì)胞的穩(wěn)定表型和MSC“干性”特征兩者的優(yōu)點(diǎn)，其分化確切，生物活性優(yōu)良，是未來(lái)半月板再生及其轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)研究中較為理想的一種種子細(xì)胞來(lái)源，臨床應(yīng)用前景良好。
【權(quán)利要求】
1.一種半月板組織來(lái)源的間充質(zhì)干細(xì)胞的分離方法，其特征在于:包括如下步驟: (1)取半月板組織，剪成組織碎塊，用包含I型膠原酶和II型膠原酶的混合膠原酶溶液消化4?6h，其中，混合膠原酶溶液中，I型膠原酶和11型膠原酶的濃度均為0.1 %?0.5 %(w/v)； (2)終止消化，用100?400目篩網(wǎng)過(guò)濾，1000?2000rpm離心4?lOmin，棄上清，PBS洗滌3次，重懸于間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)基中，置于37°C、5% CO2條件下培養(yǎng)，2?3天后棄去非貼壁細(xì)胞和碎片，換液，此后每3天換液一次，在細(xì)胞融合度為80%?90%時(shí)收獲細(xì)胞，即可。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的分離方法，其特征在于:步驟(I)中，所述組織碎塊的體積為I ?5mm3。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的分離方法，其特征在于:步驟(I)中，所述消化是在37°C、30?300轉(zhuǎn)/分條件下振蕩消化。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的分離方法，其特征在于:步驟(I)中，所述混合膠原酶溶液中，I型膠原酶和II型膠原酶的濃度均為0.2% (w/v);所述I型膠原酶溶液是包含膠原酶的低糖DMEM培養(yǎng)基。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的分離方法，其特征在于:步驟(2)中，所述終止消化的方法是:加入細(xì)胞懸液1/2?3倍體積的含10% FBS的低糖DMEM培養(yǎng)基。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的分離方法，其特征在于:步驟(2)中，所述篩網(wǎng)為200目篩。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的分離方法，其特征在于:步驟(2)中，所述離心的轉(zhuǎn)速為1200rpm,離心時(shí)間為5min。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的分離方法，其特征在于:步驟(2)中，細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)，環(huán)境的相對(duì)濕度為95%。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的分離方法，其特征在于:步驟(2)中，所述間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)基是添加有 10% FBS, 3.7g/L NaHCO3,100U/ml 青霉素，100 μ g/ml 鏈霉素，25ng/ml 兩性霉素B，2mM L-谷氨酰胺的低糖DMEM培養(yǎng)基。
10.權(quán)利要求1?9任意一項(xiàng)方法分離得到的間充質(zhì)干細(xì)胞。
【文檔編號(hào)】C12N5/0775GK104357385SQ201410654276
【公開(kāi)日】2015年2月18日 申請(qǐng)日期:2014年11月17日 優(yōu)先權(quán)日:2014年11月17日
【發(fā)明者】付維力 申請(qǐng)人:四川大學(xué)華西醫(yī)院