F52-6蛋白及其編碼基因及水解木聚糖的應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了F52-6蛋白及其編碼基因及水解木聚糖的應(yīng)用。本發(fā)明提供了一種蛋白，是如下1)或2)的蛋白質(zhì)：1)由序列表中序列2所示的氨基酸殘基組成的蛋白質(zhì)；2)將序列表中序列2的氨基酸序列殘基序列經(jīng)過一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的由1)衍生的蛋白質(zhì)。本發(fā)明的實(shí)驗(yàn)證明，本發(fā)明發(fā)現(xiàn)新的木聚糖酶F52-6，在以木聚糖為底物，pH 5.0條件下，最適溫度為75℃，在70℃孵育2小時(shí)后，仍能保留82.3％的活力；在4℃下，不同pH緩沖液中孵育24小時(shí)后，在pH 4.0-12.0范圍內(nèi)均能保留超過80％的剩余活力。
【專利說明】F52-6蛋白及其編碼基因及水解木聚糖的應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物【技術(shù)領(lǐng)域】，尤其涉及F52-6蛋白及其編碼基因及水解木聚糖的應(yīng) 用。

【背景技術(shù)】
[0002] 木聚糖（Xylan)是植物細(xì)胞壁中半纖維素的重要組分，約占細(xì)胞干重的35%，是 自然界中豐富的可再生資源，僅次于纖維素。木聚糖酶（Xylananse)是一類能將木聚糖水 解為低聚木糖及木糖的酶，很多自然界微生物均含有木聚糖酶。由于木聚糖酶可以廣泛應(yīng) 用于紡織、造紙、食品及生物燃料等工業(yè)，近年來吸引了越來越多學(xué)者的研宄興趣。為了使 酶達(dá)到較高的耐熱性及熱穩(wěn)定性，很多學(xué)者從嗜熱微生物中篩選新酶，但是它們很少可以 適用在工業(yè)條件中。在生物燃料，即水解生物質(zhì)生產(chǎn)生物乙醇的工業(yè)中，很少有酶可以高效 的在50°C的工業(yè)條件下保持良好的穩(wěn)定性。這就限制了生物燃料工業(yè)的高效發(fā)展，也是制 約生物燃料降低生產(chǎn)成本的重要因素。
[0003] 自然界中，不可培養(yǎng)微生物約占所有微生物的99%。大部分篩選木聚糖酶的研宄 仍然禁錮在可培養(yǎng)的1 %的微生物中。近10年來，隨著測序技術(shù)與高通量篩選技術(shù)的發(fā)展， 人們逐漸開始研宄不可培養(yǎng)微生物中蘊(yùn)含的資源，采用的是日臻成熟的宏基因組技術(shù)，并 發(fā)現(xiàn)了大量具有優(yōu)秀性質(zhì)的酶，說明了宏基因組技術(shù)發(fā)掘新酶的廣闊前景。
[0004] 在宏基因組技術(shù)篩選新酶的研宄中，篩選效率從土壤等自然環(huán)境到動(dòng)物消化道， 再到人工馴化的反應(yīng)器依次遞增。這與馴化的強(qiáng)度及選擇壓力是相關(guān)的。在自然環(huán)境中， 比如森林土壤，需要若干年，微生物才能將生物質(zhì)降解，在動(dòng)物消化道中，這種反應(yīng)需要若 干天，但是水解效率依舊不高，這就是食草動(dòng)物食量大的原因；而對于人工馴化的反應(yīng)器， 三天即可達(dá)到90 %的轉(zhuǎn)化率。本研宄從人工馴化反應(yīng)器中篩選木聚糖酶，保證了其高效性。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種蛋白。
[0006] 本發(fā)明提供的蛋白，F(xiàn)52-6,是如下1)或2)的蛋白質(zhì)：
[0007] 1)由序列表中序列2所示的氨基酸殘基組成的蛋白質(zhì)；
[0008] 2)將1)所示的蛋白質(zhì)的氨基酸殘基序列經(jīng)過一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/ 或缺失和/或添加且具有相同功能的由1)衍生的蛋白質(zhì)。
[0009] 上述經(jīng)過一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加為不超過10個(gè)氨 基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加。
[0010] 編碼上述蛋白的DNA分子也是本發(fā)明保護(hù)的范圍。
[0011] 上述DNA分子為如下1)-5)中任一所述的DNA分子：
[0012] 1)編碼區(qū)為序列表中序列1 ;
[0013] 2)編碼區(qū)為序列表中序列1自5'末端第14-1066位核苷酸；
[0014] 3)編碼區(qū)為序列表中序列1自5'末端第11-1066位核苷酸；
[0015] 4)在嚴(yán)格條件下與1)或2)或3)雜交且編碼具有相同功能蛋白的DNA分子；
[0016] 5)與1)或2)或3)具有90%以上同源性且編碼具有相同功能蛋白的DNA分子。
[0017] 上述嚴(yán)格條件可為用0. 1XSSPE (或0. 1XSSC)，0. 1%SDS的溶液，在DNA或者RNA 雜交實(shí)驗(yàn)中65°C下雜交并洗膜。
[0018] 含有上述DNA分子的表達(dá)盒、重組載體、重組菌、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系或重組菌也是本發(fā) 明保護(hù)的范圍。
[0019] 上述方法中，所述表達(dá)載體為pET_28a載體，所述重組載體在本發(fā)明的實(shí)施例為 將序列表中序列1自5'末端第14-1066位核苷酸插入pET-28a載體的Nde I與Hindlll 酶切位點(diǎn)間得到的載體；
[0020] 上述重組載體為將上述DNA分子插入表達(dá)載體得到的重組載體。
[0021] 上述重組菌為將所述重組載體導(dǎo)入目的菌中得到的重組菌。
[0022] 所述目的菌為大腸桿菌，具體為Rosetta DE3。
[0023] 上述蛋白在作為木聚糖酶或木糖苷酶或葡萄糖苷酶或纖維素酶中的應(yīng)用也 是本發(fā)明保護(hù)的范圍。
[0024] 所述木聚糖酶的酶學(xué)特征具體為：最適pH值為5. 0、最適溫度為75°C。
[0025] 上述的蛋白或上述DNA分子或上述的表達(dá)盒、重組載體、重組菌、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系或 重組菌在制備木聚糖酶或木糖苷酶或0_葡萄糖苷酶或纖維素酶中的應(yīng)用也是本發(fā)明保 護(hù)的范圍。
[0026] 本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種制備木聚糖酶或木糖苷酶或葡萄糖苷酶或 纖維素酶的方法。
[0027] 本發(fā)明的方法，為發(fā)酵上述的重組菌，即得到木聚糖酶或木糖苷酶或0 _葡萄糖 苷酶或纖維素酶。
[0028] 上述方法中，所述發(fā)酵為在IPTG誘導(dǎo)下發(fā)酵培養(yǎng)。
[0029] 上述的蛋白在降解生物質(zhì)中的應(yīng)用也是本發(fā)明保護(hù)的范圍，所述生物質(zhì)為玉米 芯。
[0030] 本發(fā)明的實(shí)驗(yàn)證明，本發(fā)明發(fā)現(xiàn)新的木聚糖酶F52-6,在以木聚糖為底物，pH 5.0 條件下，最適溫度為75°C，在70°C溫育2小時(shí)后，仍能保留82. 3 %的活力；在4°C下，不同pH 緩沖液中孵育24小時(shí)后，在pH 4. 0-12. 0范圍內(nèi)均能保留超過80%的剩余活力。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0031] 圖1為構(gòu)建的重組pET-28a-F52-6表達(dá)載體
[0032] 圖2為對F52-6三維結(jié)構(gòu)及活性位點(diǎn)的預(yù)測
[0033] 圖3為F52-6誘導(dǎo)表達(dá)SDS-PAGE圖譜
[0034] 圖4為溫度對F52-6活性的影響
[0035] 圖5為F52-6的溫度穩(wěn)定性
[0036] 圖6為F52-6的最適pH及pH穩(wěn)定性
[0037] 圖7為F52-6及F52-2對木聚糖的水解產(chǎn)物研宄
[0038] 圖8為F52-6及F52-2與F52-6對玉米芯的水解產(chǎn)物曲線。

【具體實(shí)施方式】
[0039] 下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。
[0040] 下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。
[0041] 實(shí)施例l、F52-6基因的克隆
[0042] 前期研宄中，利用Fosmid載體構(gòu)建了干式發(fā)酵污泥系統(tǒng)的宏基因組文庫。利用剛 果紅-木聚糖平板，篩選得到了一個(gè)含有木聚糖酶活性的大腸桿菌宿主克隆。Fosmid中含 有的插入片段為38176bp，采用softberry預(yù)測0RF，并用NCBI及Pfam數(shù)據(jù)庫注釋。得到 F52-6基因，該基因的核苷酸序列為序列表中序列1自5'末端第14-1063位核苷酸，其編碼 的蛋白命名為F52-6,其氨基酸序列為序列表中序列2自N'末端第1-351位氨基酸。經(jīng)過 比對，F(xiàn)52-6蛋白與來自Caldicoprobacter oshimai的木聚糖酶有最高的56%相似性，預(yù) 測其為木聚糖酶。
[0043] 實(shí)施例2、F52-6作為木聚糖酶的應(yīng)用
[0044] 1、重組載體的構(gòu)建
[0045] 以人工合成的序列1為模板，用F52-6F與F52-6R為引物，采用TAKARA公司的 PrimeStar高保真酶進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到1075bp的PCR產(chǎn)物，其核苷酸序列為序列1。
[0046] F52-6F:5' -GGAATTCCATATGGAAGCTGGAGGTGTTCCCAT-3' 包含 Nde I 酶切位點(diǎn)
[0047] F52-6R:5' -CCCAAGCTTTTAGCGATCCTGTGCAGTGCT-3' 包含 Hind III 酶切位點(diǎn)
[0048] 上述PCR擴(kuò)增的體系如下：
[0049] 2 X PrimeStar 25 U L Buffer dNTP 4 uL F52-6 F 1 nL F52-6 R 1 uL DNA模板 0. 5 u L
[0050] PrimeStar 0. 5 u L 去離子水 18 U L
[0051] PCR程序如下：
[0052] 94°C 1 min預(yù)變性 98°C 10 s 68°C 70 s 回到2, 24個(gè)循環(huán) 72〇C 5 min End
[0053] 將上述PCR產(chǎn)物用Nde I與Hind III雙酶切，得到的酶切產(chǎn)物與經(jīng)過同樣酶切的 pET-28a 載體（Novagen pET-28a DNA Cat.No.69864-3)連接，得到重組載體。
[0054] 經(jīng)過測序，該重組載體為將序列表中序列1自5'末端第14-1066位核苷酸插入 pET-28a載體的Nde I與Hind III酶切位點(diǎn)間得到的載體，表達(dá)序列2所示的蛋白，將該重 組載體命名為pET-28a-F52-6 (圖1)。
[0055] 序列表中序列1所不的DNA分子中11-1066位核苷酸為F52-6基因；
[0056] 序列表中序列2所示蛋白中自N'末端1-351位氨基酸為F52-6蛋白。
[0057] 2、蛋白的表達(dá)與純化
[0058] 1)表達(dá)
[0059] 將上述重組載體pET-28a-F52_6轉(zhuǎn)化至Rosseta DE3感受態(tài)細(xì)胞中，在含有 50 y g/mL卡那霉素和12. 5 y g/mL氯霉素的LB平板中37°C培養(yǎng)過夜，得到單菌落，菌落PCR 鑒定，引物為F52-6F和F52-6R，得到1075bp的為陽性重組菌，命名為DE3/pET-28a-F52-6。
[0060] 采用同樣的方法將空載體pET-28a轉(zhuǎn)入Rosseta DE3感受態(tài)細(xì)胞，得到DE3/ pET-28a〇
[0061 ] 將DE3/pET-28a-F52-6單菌落接種至100mL含有50 y g/mL卡那霉素和12. 5 y g/ mL氯霉素的LB培養(yǎng)基中37°C培養(yǎng)過夜，當(dāng)0D600nm達(dá)到0. 4時(shí)，加入終濃度為ImM的 IPTG(Isopropyl 0-D-l-Thiogalactopyranoside)誘導(dǎo)四小時(shí)。取 lmL 菌液，離心后收集 菌體，懸于200 yL 1XSDS凝膠加樣緩沖液，煮沸10min，25°C高速離心lmin，取上清液，上 樣量20 y L。以DE3/pET-28a為對照。
[0062] 10% SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳，考馬斯亮藍(lán)染色檢測蛋白表達(dá)，結(jié)果如圖3所示，1 為 DE3/pET-28a、2-5 均為 DE3/pET-28a-F52-6，從圖中可以看出，DE3/pET-28a-F52-6 經(jīng)過 四小時(shí)的誘導(dǎo)，F(xiàn)52-6成功誘導(dǎo)表達(dá)，目的蛋白大小為40KD。
[0063] 2)、純化
[0064] 收集 DE3/pET-28a-F52-6 菌體，用 PBS 緩沖液（NaCl 137mM，KCl 2. 7mM，Na2HP0410mM，KH2P042mM，pH 7. 4)洗滌菌體三次，重懸，反復(fù)凍融三次破壁。離心， 收取上清，采用鎳柱填料純化蛋白。首先洗絳液（NaH2P0 450mM, NaCl 300mM, imidazo 1 e 20mM, pH 8.0)洗三次，然后洗脫液（NaH2P0450mM, NaCl 300mM, imidazole 250mM, pH 8.0) 洗脫三次，洗滌及洗脫條件均為500g，2min，收集三倍柱體積的洗脫液為目的蛋白F52-6。
[0065] 將目的蛋白F52-6進(jìn)行SDS-PAGE檢測，得到大小為40KD，說明純化得到目的蛋白 F52-6。
[0066] 3、目的蛋白F52-6的功能驗(yàn)證及酶特性檢測
[0067] 木聚糖酶活性的測定：反應(yīng)體系：100 y L 1%木聚糖溶液+100 y L 100mM醋酸鈉 緩沖液。5yL酶液加入50°C預(yù)熱的反應(yīng)體系中，溫育5min，隨后加入500 yL DNS試劑。沸 水浴5min后，于540nm處測定吸光值。
[0068] -個(gè)單位的酶活（U)定義為一個(gè)酶分子每分鐘水解木聚糖釋放出還原糖的量 (y mol)〇
[0069] 1)最適pH的測定條件：
[0070] 將緩沖液更換為不同pH，測定酶活。緩沖液的配制：磷酸氫二鈉-檸檬酸 (3. 5-8. 0)，Tris-HCl (8. 0-10. 0)，磷酸氫二鈉-氫氧化鈉（10. 0-12. 0)。
[0071] 結(jié)果如圖6所示，目的蛋白F52-6能夠降解木聚糖，為木聚糖酶，且其最適pH為 5. 0〇
[0072] 2)最適溫度的測定：
[0073] 將酶反應(yīng)體系預(yù)先在20-90°C預(yù)熱5min，再加入酶進(jìn)行反應(yīng)。反應(yīng)為pH5. 0。
[0074] 結(jié)果如圖4所示，目的蛋白F52-6能夠降解木聚糖，為木聚糖酶，且其最適溫度為 75。。。
[0075] 3)溫度穩(wěn)定性測定條件：
[0076] 將酶在各個(gè)溫度下分別溫育20min，40min，60min，80min，lOOmin以及120min，隨 后在75 °C，pH 5. 0測定剩余酶活；
[0077] 結(jié)果如圖5所示，目的蛋白F52-6能夠降解木聚糖，為木聚糖酶，且其在70°C溫育 2小時(shí)后，仍保留有82. 3%的活性。
[0078] 4)pH穩(wěn)定性測定：
[0079]將酶加入對應(yīng)pH的緩沖液中，于4°C放置24h，最后在75°C，pH 5. 0條件下測定剩 余活性。
[0080] 結(jié)果如圖6所示，目的蛋白F52-6能夠降解木聚糖，為木聚糖酶，且其在4°C下，不 同pH緩沖液中孵育24小時(shí)后，在pH 4. 0-12. 0范圍內(nèi)均能保留超過80%的剩余活力。
[0081] 5)米氏常數(shù)的測定：
[0082] 準(zhǔn)備0_45mg/mL的木聚糖溶液，測定酶的反應(yīng)動(dòng)力學(xué)參數(shù)（Lineweaver-Burk plot)〇
[0083] 酶解產(chǎn)物的研宄采用薄層層析的方法，酶在50°C與底物反應(yīng)4h后，取樣點(diǎn)在硅膠 板上，層析后染色觀察降解產(chǎn)物。
[0084] 結(jié)果如圖7所示，標(biāo)品為木糖XI、木二糖X2及木三糖X3,泳道1 :陰性對照；泳道 2 :F52-2水解結(jié)果；泳道三：F52-6水解結(jié)果；泳道四：F52-2+F52-6水解結(jié)果，結(jié)果表明，當(dāng) F52-2單獨(dú)作用木聚糖時(shí)，水解產(chǎn)物僅為少量木糖；當(dāng)F52-6單獨(dú)作用時(shí)，產(chǎn)物為木糖、木二 糖以及大量寡糖；當(dāng)兩者合并使用時(shí)，木二糖的量明顯減少，木糖的量增多，說明兩種酶的 共同作用可以提高木糖的產(chǎn)量。
[0085] 4、F52-6對玉米芯降解實(shí)驗(yàn)
[0086] 200U/g生物質(zhì)（玉米芯）的比例加入上述2純化的F52-6,50°C溫育72h，液相測 定糖含量。
[0087] 分離條件：
[0088] 分析柱：Shim_pack ISA-07 (4. OmmX 25cm)
[0089] 流動(dòng)相：A液0. 1M硼酸（用氫氧化鉀調(diào)節(jié)至pH = 8)
[0090] B液0. 4M硼酸（用氫氧化鉀調(diào)節(jié)至pH = 9)
[0091]梯度：A液100 % -B液100 %，2 % /min直線梯度洗脫
[0092] 流量：〇. 6mL/min
[0093] 溫度：65°C
[0094] 衍生條件：
[0095] 衍生液：1 % L-精氨酸，3%硼酸
[0096] 流速：0? 5mL/min
[0097] 反應(yīng)溫度：15(TC
[0098] 結(jié)果見圖8,該酶的水解效率為23. 1%，加入50U/g生物質(zhì)的F52-2后，水解效率 增加至79. 3%。
[0099] 5、三維結(jié)構(gòu)的模擬
[0100] 在Swiss-model中搜尋最適模板，最后采用pymol軟件對圖像進(jìn)行修飾。采用 Cluster W進(jìn)行多序列比對，得到活性位點(diǎn)，見圖2。
[0101] 6、金屬離子（5mM)對酶活性的影響
[0102] 方法：100yL 1%木聚糖溶液（溶劑為100mM醋酸鈉緩沖液（pH 5.0))+100yL 100mM醋酸鈉緩沖液（pH 5. 0)，其中加入終濃度為5mM的各種金屬離子。5 y L上述2純化 的F52-6加入75°C預(yù)熱的反應(yīng)體系中，溫育5min，隨后加入500 y L DNS試劑。沸水浴5min 后，于540nm處測定吸光值。
[0103] 表1為金屬離子（5mM)對酶活性的影響
[0104]

【權(quán)利要求】
1. 一種蛋白，是如下1)或2)的蛋白質(zhì)： 1) 由序列表中序列2所不的氣基酸殘基組成的蛋白質(zhì)； 2) 將1)所示的蛋白質(zhì)的氨基酸殘基序列經(jīng)過一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺 失和/或添加且具有相同功能的由1)衍生的蛋白質(zhì)。
2. 編碼權(quán)利要求1所述蛋白的DNA分子。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的DNA分子，其特征在于：所述DNA分子為如下1)-5)中任一 所述的DNA分子： 1) 編碼區(qū)為序列表中序列1 ; 2) 編碼區(qū)為序列表中序列1自5'末端第14-1066位核苷酸； 3) 編碼區(qū)為序列表中序列1自5'末端第11-1066位核苷酸； 4) 在嚴(yán)格條件下與1)或2)或3)雜交且編碼具有相同功能蛋白的DNA分子； 5) 與1)或2)或3)具有90%以上同源性且編碼具有相同功能蛋白的DNA分子。
4. 含有權(quán)利要求2或3所述DNA分子的表達(dá)盒、重組載體、重組菌、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系或重 組菌。
5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的重組載體，其特征在于：所述重組載體為將權(quán)利要求2或3所 述DNA分子插入表達(dá)載體得到的重組載體。
6. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的重組菌，其特征在于：所述重組菌為將所述重組載體導(dǎo)入目 的菌中得到的重組菌。
7. 權(quán)利要求1所述的蛋白在作為木聚糖酶或木糖苷酶或e-葡萄糖苷酶或纖維素酶中 的應(yīng)用； 所述木聚糖酶的酶學(xué)特征具體為：最適pH值為5. 0、最適溫度為75°C。
8. 權(quán)利要求1所述的蛋白或權(quán)利要求2或3所述DNA分子或權(quán)利要求4所述的表達(dá) 盒、重組載體、重組菌、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系或重組菌在制備木聚糖酶或木糖苷酶或e-葡萄糖苷 酶或纖維素酶中的應(yīng)用。
9. 一種制備木葡聚糖酶或木糖苷酶或e -葡萄糖苷酶或纖維素酶的方法，為發(fā)酵權(quán)利 要求6所述的重組菌，即得到木葡聚糖酶或木糖苷酶或e -葡萄糖苷酶或纖維素酶。
10. 權(quán)利要求1所述的蛋白在降解生物質(zhì)中的應(yīng)用，所述生物質(zhì)為玉米芯。
【文檔編號】C12N9/42GK104450649SQ201410654103
【公開日】2015年3月25日 申請日期:2014年11月17日 優(yōu)先權(quán)日:2014年11月17日
【發(fā)明者】吳曉磊, 王蒙, 來國莉, 聶勇, 耿爽 申請人:北京大學(xué)