F85-20蛋白及其編碼基因及其作為β-葡萄糖苷酶的應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種F85-20蛋白及其編碼基因及其作為Β-葡萄糖苷酶的應(yīng)用。本發(fā)明提供了一種蛋白，是如下1)或2)的蛋白質(zhì)：1)由序列表中序列2所示的氨基酸殘基組成的蛋白質(zhì)；2)將序列表中序列2的氨基酸序列殘基序列經(jīng)過一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的由1)衍生的蛋白質(zhì)。本發(fā)明的實(shí)驗(yàn)證明，本發(fā)明發(fā)現(xiàn)新的β-葡萄糖苷酶F85-20，在以對(duì)硝基苯酚葡萄糖苷(pNPG)為底物，pH 6.0條件下，最適溫度為65℃，在50℃溫育2小時(shí)后，仍能保留80％的活力；在4℃下，不同pH緩沖液中孵育24小時(shí)后，在pH 4.0-7.5范圍內(nèi)均能保留超過70％的剩余活力。
【專利說明】F85-20蛋白及其編碼基因及其作為β -葡萄糖苷酶的應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物【技術(shù)領(lǐng)域】，尤其涉及一種F85-20蛋白及其編碼基因及其作為 β-葡萄糖苷酶的應(yīng)用。

【背景技術(shù)】
[0002] 據(jù)統(tǒng)計(jì)，每年全球植物通過光合作用合成纖維類物質(zhì)達(dá)到50億噸。纖維素 (Cellulose)是植物細(xì)胞壁的重要組分，是自然界中最豐富的可再生資源。纖維素酶 (Cellulase)是一類能將纖維素水解為低聚葡萄糖及葡萄糖的酶，很多自然界微生物均含 有纖維素酶。由于纖維素酶可以廣泛應(yīng)用于紡織、造紙、食品及生物燃料等工業(yè)，近年來吸 引了越來越多學(xué)者的研究興趣。然而，在纖維素酶水解的過程中，產(chǎn)生的大量纖維二糖及 寡糖會(huì)強(qiáng)烈抑制纖維素酶的活性，導(dǎo)致纖維素水解效率的急劇下降，整個(gè)生產(chǎn)效率的降低。 β -葡萄糖苷酶可以高效催化纖維二糖及寡糖轉(zhuǎn)化為葡萄糖，因此將該酶加至纖維素酶中， 會(huì)解除產(chǎn)物抑制，使纖維素酶恢復(fù)高效力，從而保證整個(gè)水解過程連續(xù)而穩(wěn)定。
[0003] 工業(yè)中，纖維素的水解溫度一般為50°C，很少有酶在該溫度下保持比較長(zhǎng)時(shí)間的 催化效力及穩(wěn)定性。這就限制了生物燃料工業(yè)的高效發(fā)展，也是制約生物燃料降低生產(chǎn)成 本的重要因素。為了使酶達(dá)到較高的耐熱性及熱穩(wěn)定性，很多學(xué)者從嗜熱微生物中篩選新 酶，但是它們很少可以適用在工業(yè)條件中。自然界中，不可培養(yǎng)微生物約占所有微生物的 99%。大部分篩選β-葡萄糖苷酶的研究仍然禁錮在可培養(yǎng)的1%的微生物中。近10年 來，隨著測(cè)序技術(shù)與高通量篩選技術(shù)的發(fā)展，人們逐漸開始研究不可培養(yǎng)微生物中蘊(yùn)含的 資源，采用的是日臻成熟的宏基因組技術(shù)，并發(fā)現(xiàn)了大量具有優(yōu)秀性質(zhì)的酶，說明了宏基因 組技術(shù)發(fā)掘新酶的廣闊前景。
[0004] 在宏基因組技術(shù)篩選新酶的研究中，篩選效率從土壤等自然環(huán)境到動(dòng)物消化道， 再到人工馴化的反應(yīng)器依次遞增。這與馴化的強(qiáng)度及選擇壓力是相關(guān)的。在自然環(huán)境中， 比如森林土壤，需要若干年，微生物才能將生物質(zhì)降解，在動(dòng)物消化道中，這種反應(yīng)需要若 干天，但是水解效率依舊不高，這就是食草動(dòng)物食量大的原因；而對(duì)于人工馴化的反應(yīng)器， 三天即可達(dá)到90%的轉(zhuǎn)化率。本研究從人工馴化反應(yīng)器中篩選β-葡萄糖苷酶，保證了其 高效性。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種蛋白。
[0006] 本發(fā)明提供的蛋白，F(xiàn)85-20,是如下1)或2)的蛋白質(zhì)：
[0007] 1)由序列表中序列2所示的氨基酸殘基組成的蛋白質(zhì)；
[0008] 2)將1)所示的蛋白質(zhì)的氨基酸殘基序列經(jīng)過一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/ 或缺失和/或添加且具有相同功能的由1)衍生的蛋白質(zhì)。
[0009] 上述經(jīng)過一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加為不超過10個(gè)氨 基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加。
[0010] 編碼上述蛋白的DNA分子也是本發(fā)明保護(hù)的范圍。
[0011] 上述DNA分子為如下1) -5)中任一所述的DNA分子：
[0012] 1)編碼區(qū)為序列表中序列1 ;
[0013] 2)編碼區(qū)為序列表中序列1自5'末端第19-1404位核苷酸；
[0014] 3)編碼區(qū)為序列表中序列1自5'末端第11-1404位核苷酸；
[0015] 4)在嚴(yán)格條件下與1)或2)或3)雜交且編碼具有相同功能蛋白的DNA分子；
[0016] 5)與1)或2)或3)具有90%以上同源性且編碼具有相同功能蛋白的DNA分子。
[0017] 上述嚴(yán)格條件可為用0. IX SSPE (或0. I XSSC)，0. 1 % SDS的溶液，在DNA或者RNA 雜交實(shí)驗(yàn)中65°C下雜交并洗膜。
[0018] 含有上述DNA分子的表達(dá)盒、重組載體、重組菌、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系或重組菌也是本發(fā) 明保護(hù)的范圍。
[0019] 上述方法中，所述表達(dá)載體為pET_28a載體，所述重組載體在本發(fā)明的實(shí)施例為 將序列表中序列1自5'末端第11-1404位核苷酸插入pET-28a載體的Nco I與Hind III 酶切位點(diǎn)間得到的載體；
[0020] 上述重組載體為將上述DNA分子插入表達(dá)載體得到的重組載體。
[0021] 上述重組菌為將所述重組載體導(dǎo)入目的菌中得到的重組菌。
[0022] 所述目的菌為大腸桿菌，具體為BL21DE3。
[0023] 上述蛋白在作為β_葡萄糖苷酶或纖維素酶或木糖苷酶中的應(yīng)用也是本發(fā)明保 護(hù)的范圍。
[0024] 上述的蛋白或上述DNA分子或上述的表達(dá)盒、重組載體、重組菌、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系或 重組菌在制備β-葡萄糖苷酶或纖維素酶或木糖苷酶中的應(yīng)用也是本發(fā)明保護(hù)的范圍。
[0025] 所述β -葡萄糖苷酶的酶學(xué)特征具體為：最適pH值為6. 0,最適溫度為65°C。
[0026] 本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種制備β_葡萄糖苷酶或纖維素酶或木糖苷酶的 方法。
[0027] 本發(fā)明的方法，為發(fā)酵上述的重組菌，即得到β -葡萄糖苷酶或纖維素酶或木糖 苷酶。
[0028] 上述方法中，所述發(fā)酵為在IPTG誘導(dǎo)下發(fā)酵培養(yǎng)。
[0029] 上述的蛋白在降解生物質(zhì)中的應(yīng)用也是本發(fā)明保護(hù)的范圍，所述生物質(zhì)為玉米 -H- 〇
[0030] 本發(fā)明的實(shí)驗(yàn)證明，本發(fā)明發(fā)現(xiàn)新的β-葡萄糖苷酶F85-20,在以對(duì)硝基苯酚葡 萄糖苷（PNPG)為底物，pH 6. 0條件下，最適溫度為65°C，在50°C溫育2小時(shí)后，仍能保留 80%的活力；在4°C下，不同pH緩沖液中孵育24小時(shí)后，在pH 4. 0-7. 5范圍內(nèi)均能保留超 過70 %的剩余活力。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0031] 圖1為對(duì)F85-20三維結(jié)構(gòu)及活性位點(diǎn)的預(yù)測(cè)
[0032] 圖2為F85-20誘導(dǎo)表達(dá)SDS-PAGE圖譜
[0033] 圖3為溫度對(duì)F85-20活性的影響
[0034] 圖4為F85-20的溫度穩(wěn)定性
[0035] 圖5為F85-20的最適pH及pH穩(wěn)定性
[0036] 圖6為F175-3及F85-20對(duì)纖維素的水解產(chǎn)物研究
[0037] 圖7為F175-3及F85-20與F175-3對(duì)玉米芯的水解產(chǎn)物曲線。

【具體實(shí)施方式】
[0038] 下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。
[0039] 下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。
[0040] 實(shí)施例1、F85-20基因的克隆
[0041] 前期研究中，利用Fosmid載體構(gòu)建了干式發(fā)酵污泥系統(tǒng)的宏基因組文庫。經(jīng)測(cè)序 及softberry預(yù)測(cè)0RF，以及NCBI及Pfam數(shù)據(jù)庫注釋。得到F85-20基因，該基因的核苷酸 序列為序列表中序列1自5'末端第19-1404位核苷酸，其編碼的蛋白命名為F85-20,其氨 基酸序列為序列表中序列2自Ν'末端第1-462位氨基酸。經(jīng)過比對(duì)，F(xiàn)85-20蛋白與來自 bacterium UASB270的β-葡萄糖苷酶有最高的60%相似性，預(yù)測(cè)其為β-葡萄糖苷酶。
[0042] 實(shí)施例2、F85-20作為β -葡萄糖苷酶的應(yīng)用
[0043] 1、重組載體的構(gòu)建
[0044] 以人工合成的序列1為模板，用F85-20F與F85-20R為引物，采用TAKARA公司的 PrimeStar高保真酶進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到1413bp的PCR產(chǎn)物，其核苷酸序列為序列1。
[0045] F85-20F:5' ~CATGCCATGGAGATACAAATGAATAAACAT~3,包含 Nco I 酶切位點(diǎn)
[0046] F85-20R:5' -CCCAAGCTTGGCATAAAGGGCCTCC-3，包含 Hind III 酶切位點(diǎn)
[0047] 上述PCR擴(kuò)增的體系如下：
[0048]
[0049]

【權(quán)利要求】
1. 一種蛋白，是如下1)或2)的蛋白質(zhì)： 1) 由序列表中序列2所不的氣基酸殘基組成的蛋白質(zhì)； 2) 將1)所示的蛋白質(zhì)的氨基酸殘基序列經(jīng)過一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺 失和/或添加且具有相同功能的由1)衍生的蛋白質(zhì)。
2. 編碼權(quán)利要求1所述蛋白的DNA分子。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的DNA分子，其特征在于：所述DNA分子為如下1)-5)中任一 所述的DNA分子： 1) 編碼區(qū)為序列表中序列1 ; 2) 編碼區(qū)為序列表中序列1自5'末端第19-1404位核苷酸； 3) 編碼區(qū)為序列表中序列1自5'末端第11-1404位核苷酸； 4) 在嚴(yán)格條件下與1)或2)或3)雜交且編碼具有相同功能蛋白的DNA分子； 5) 與1)或2)或3)具有90%以上同源性且編碼具有相同功能蛋白的DNA分子。
4. 含有權(quán)利要求2或3所述DNA分子的表達(dá)盒、重組載體、重組菌、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系或重 組菌。
5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的重組載體，其特征在于：所述重組載體為將權(quán)利要求2或3所 述DNA分子插入表達(dá)載體得到的重組載體。
6. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的重組菌，其特征在于：所述重組菌為將所述重組載體導(dǎo)入目 的菌中得到的重組菌。
7. 權(quán)利要求1所述的蛋白在作為￠-葡萄糖苷酶或纖維素酶或木糖苷酶中的應(yīng)用； 所述0 -葡萄糖苷酶的酶學(xué)特征具體為：最適pH值為6. 0,最適溫度為65°C。
8. 權(quán)利要求1所述的蛋白或權(quán)利要求2或3所述DNA分子或權(quán)利要求4所述的表達(dá) 盒、重組載體、重組菌、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系或重組菌在制備3-葡萄糖苷酶或纖維素酶或木糖苷 酶中的應(yīng)用。
9. 一種制備3 -葡萄糖苷酶或纖維素酶或木糖苷酶的方法，為發(fā)酵權(quán)利要求6所述的 重組菌，即得到3-葡萄糖苷酶或纖維素酶或木糖苷酶。
10. 權(quán)利要求1所述的蛋白在降解生物質(zhì)中的應(yīng)用，所述生物質(zhì)為玉米芯。
【文檔編號(hào)】C12N15/56GK104388409SQ201410654095
【公開日】2015年3月4日 申請(qǐng)日期:2014年11月17日 優(yōu)先權(quán)日:2014年11月17日
【發(fā)明者】吳曉磊, 王蒙, 來國(guó)莉, 聶勇, 耿爽 申請(qǐng)人:北京大學(xué)