一種對非酒精性脂肪肝病細胞模型具有修復作用的文蛤酶解寡肽及其制備方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種對非酒精性脂肪肝病細胞模型具有修復作用的文蛤酶解寡肽，其特征在于包含如下氨基酸序列：Gln Leu Asn Trp Asp，本發(fā)明還涉及一種對非酒精性脂肪肝病細胞模型具有修復作用的文蛤酶解寡肽的制備方法，與現有技術相比，本發(fā)明的優(yōu)點在于：應用軟脂酸誘導建立NAFLD細胞模型，充分模擬體內受損的肝細胞，結果發(fā)現經15μg/mL的軟脂酸誘導48h后，建立的NAFLD體外細胞模型其TG含量較正常肝細胞顯著升高，油紅O染色發(fā)現模型組細胞內脂滴數量比正常組細胞增多，且細胞死亡率低、重復性好，顯示該造模方法簡便易行，同時，本發(fā)明以文蛤中分離得到對NAFLD細胞模型具有明顯修復作用的文蛤酶解寡肽。
【專利說明】一種對非酒精性脂肪肝病細胞模型具有修復作用的文蛤酶 解寡肽及其制備方法

【技術領域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種自動物體中得到的提取物及其制備方法，特別是涉及一種對非酒 精性脂肪肝病細胞模型具有修復作用的文蛤提取物及其制備方法。

【背景技術】
[0002] 文蛤（MeretrixmeretrixL.)屬于軟體動物門、簾蛤科、文蛤屬，其貝殼堅厚，兩 殼大小相等，喜歡生長在有淡水注入的內灣及河口附近的細沙質海灘，是我國四大養(yǎng)殖貝 類之一。文蛤肉質鮮美含有人體所必須的蛋白質、脂肪、微量元素等。我國利用文蛤治療疾 病的歷史悠久，《本草綱目》里有記載它能治"瘡、癤腫毒，消積塊，解酒毒"等疾病。
[0003] 最近的研究表明，文蛤提取物具有抗腫瘤、抗氧化、降糖、降血脂及降血壓等作用， 是有待開發(fā)的保健食品。其中，非酒精性脂肪肝?。╪onalcoholicfattyliverdisease, NAFLD)是以肝細胞脂肪變性和脂肪堆積為主要特征的病理綜合征，脂肪代謝受雌激素、生 長激素、皮質醇、胰高血糖素、胰島素等激素調節(jié)的影響，這些激素可以短時間內迅速使許 多蛋白質和糖類等其他物質經新陳代謝轉變成脂類物質堆積在人體，而肝臟無法完全排除 這些多余的脂肪，進而導致脂肪肝的形成。目前治療的方法主要采取減肥治療、降脂治療和 血管緊張素轉換酶抑制劑等保守治療，但保守治療目前尚缺乏特效方法，效果欠佳。近年 來，我國的研究學者對從海洋軟體動物中提取生物活性物質對肝損傷進行保護作用作了大 量的研究。如張蓓等人從海星和海參中提取到腦苷脂，以研究其對脂肪肝大鼠肝臟脂質代 謝的影響，結果表明腦苷脂可降低肝臟脂質蓄積。
[0004] 但流行病學資料顯示，NAFLD不單純是肝臟疾病，而是肥胖，高脂血癥，胰島素抵抗 等代謝綜合征相關組分在肝臟的集中體現，其中胰島素抵抗和遺傳易感性與其發(fā)病密切相 關，近年來，隨著生活水平的提高及飲食結構的改變，NAFLD在我國己成為僅次于病毒性肝 炎的第二大慢性肝病，但其發(fā)病機制尚未完全闡明，治療上也缺乏有效措施，因此，建立穩(wěn) 定可靠的便于進行藥物干預實驗的NAFLD模型成為亟待解決的問題，而有關文蛤提取物對 NAFLD細胞模型的作用尚未見報道。本試驗通過蛋白酶對文蛤進行酶解獲得寡肽，作用于經 軟脂酸誘導正常肝Changliver細胞即"人張氏肝細胞"建立的NAFLD體外細胞模型，以探 討文蛤酶解寡肽對NAFLD細胞模型的修復作用，以期為開發(fā)文蛤功能食品提供實驗依據。


【發(fā)明內容】

[0005] 本發(fā)明所要解決的一個技術問題是針對現有技術的現狀提供一種對非酒精性脂 肪肝病細胞模型修復性高的文蛤酶解寡肽。
[0006] 本發(fā)明所要解決的另一個技術問題是針對現有技術的現狀提供一種對非酒精性 脂肪肝病細胞模型修復性高的文蛤酶解寡肽的制備方法。
[0007] 本發(fā)明解決上述技術問題所采用的技術方案為：該對非酒精性脂肪肝病細胞模型 具有修復作用的文蛤酶解寡肽，其特征在于包含如下氨基酸序列：GlnLeuAsnTrpAsp。
[0008] 本發(fā)明還提供一種對非酒精性脂肪肝病細胞模型具有修復作用的文蛤酶解寡肽 的制備方法，其特征在于包括如下步驟：
[0009] ①建立非酒精性脂肪肝病細胞模型，將正常肝細胞置于DMEM培養(yǎng)液、37°C、5%C02 的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細胞貼壁達到80%后棄培養(yǎng)液，0. 25%的胰蛋白酶消化，傳代培養(yǎng)，選 擇生長狀態(tài)良好的細胞，用15iig/mL的軟脂酸對正常肝細胞進行誘導，處理12h、24h、48h、 72h后收集細胞并測定甘油三脂（TG)含量，選擇使正常肝細胞TG含量明顯增加且細胞生長 良好的誘導時間，以建立體外非酒精性脂肪肝病細胞模型；
[0010] ②將文蛤去殼取內臟后放入蒸餾水中輕輕攪拌，洗去雜質后勻漿，存放于-20°C 或-80°C備用；
[0011] ③將步驟②制得的文蛤勻漿液進行酶解，經過超濾膜，分別截取5KDa分子量以 下、5KDa?8KDa以及8KDa分子量以上的3個不同分子段酶解液，用G-25葡聚糖凝膠層析， 對所得的各個峰進行收集，獲得的產物分別作用于步驟①的非酒精性脂肪肝病細胞模型細 胞，以篩選使得非酒精性脂肪肝病細胞模型細胞TG含量減低率最大的酶解液進行收集，然 后將收集的最大峰酶解液于280nm下過ZorbaxSB-C18色譜柱，得到兩個洗脫峰，收集大 的洗脫峰高效液相檢測其純度顯示為單一組分，并測定其氨基酸序列，確認為GinLeuAsn TrpAsp。
[0012] 進一步地，所述步驟①中軟脂酸為15y g/mL，對正常肝細胞進行誘導。
[0013] 進一步地，所述步驟③中使得非酒精性脂肪肝病細胞模型細胞TG含量減低率最 大的為5KDa分子量以下分子段的酶解液，其TG含量降低率達54. 2%。
[0014] 進一步地，所述步驟③中對文蛤勻漿液分別用5種蛋白酶進行酶解，該5種蛋白酶 分別為中性蛋白酶、胰蛋白酶、堿性蛋白酶、胃蛋白酶和木瓜蛋白酶。
[0015] 進一步地，步驟③中使得非酒精性脂肪肝病細胞模型細胞TG含量減低率最大的 酶為堿性蛋白酶，酶解條件為40°C、pH為9. 5、料液比為1:2、酶解時間為8h且加酶量為 1000U/g。
[0016] 與現有技術相比，本發(fā)明的優(yōu)點在于：應用軟脂酸誘導建立NAFLD細胞模型，充分 模擬體內受損的肝細胞，結果發(fā)現經15yg/mL的軟脂酸誘導48h后，建立的NAFLD體外細 胞模型其TG含量較正常肝細胞顯著升高，油紅0染色發(fā)現模型組細胞內脂滴數量比正常組 細胞增多，且細胞死亡率低、重復性好，顯示該造模方法簡便易行，同時，本發(fā)明以文蛤中分 離得到對NAFLD細胞模型具有明顯修復作用的文蛤酶解寡肽，具體表現為細胞內的脂質過 氧化程度得到緩解，細胞清除氧自由基的能力增強、以及能有效降低細胞的受損程度，對進 一步探討文蛤酶解寡肽對NAFLD細胞模型修復作用的機制，并進行動物體內實驗，從而為 開發(fā)文蛤的護肝功能食品提供可靠的實驗依據。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0017]圖1為分子段< 5kDa的酶解液進行G-25葡聚糖凝膠層析圖；
[0018] 圖2為對目標肽進行HPLC分析并測定的氨基酸序列結果分析圖；
[0019] 圖3-A為正常組Chang liver肝細胞經油紅0染色的結果圖；
[0020] 圖3-B為模型組Chang liver肝細胞經油紅0染色的結果圖；
[0021] 圖3-C為藥物組Chang liver肝細胞經油紅0染色的結果圖。

【具體實施方式】
[0022] 以下通過結合附圖、序列表及實施例對本發(fā)明作進一步說明。
[0023] 實施例1
[0024] 1、NAFLD模型的建立
[0025] 正常肝Changliver細胞（下稱正常組細胞）置于DMEM培養(yǎng)液、37°C、5%C02的 培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細胞貼壁達到80%后棄培養(yǎng)液，0. 25%的胰蛋白酶消化，傳代培養(yǎng)。選擇 生長狀態(tài)良好的細胞，用15yg/mL的軟脂酸對Changliver細胞進行誘導，處理12h、24h、 48h、72h后收集細胞并測定甘油三脂（TG)含量，TG檢測方法按照試劑盒說明書進行。選擇 使正常肝Changliver細胞TG含量明顯增加且細胞生長良好的誘導時間，建立體外NAFLD 細胞模型（下稱模型組細胞）。
[0026] 正常肝Changliver細胞用15 iig/mL軟脂酸誘導后的TG含量結果發(fā)現軟脂酸作 用后TG含量均有明顯上升，但作用48h后，其細胞內的TG含量上升最多，較正常組TG含量 上升300%左右，鏡下觀察細胞生長狀態(tài)良好，因此建立NAFLD細胞模型的軟脂酸誘導時間 為48h(見表1)，且經油紅0染色發(fā)現模型組細胞內脂滴數量比正常組細胞增多，細胞死亡 率低、重復性好，顯示該造模方法簡便易行。
[0027] 表1軟脂酸處理Chang1iver細胞后的TG含量變化
[0028]

【權利要求】
1. 一種對非酒精性脂肪肝病細胞模型具有修復作用的文蛤酶解寡肽，其特征在于包含 如下氨基酸序列：Gin Leu Asn Trp Asp。
2. -種如權利要求1所述對非酒精性脂肪肝病細胞模型具有修復作用的文蛤酶解寡 肽的制備方法，其特征在于包括如下步驟： ① 建立非酒精性脂肪肝病細胞模型，將正常肝細胞置于DMEM培養(yǎng)液、37°C、5% C02的 培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細胞貼壁達到80%后棄培養(yǎng)液，0. 25%的胰蛋白酶消化，傳代培養(yǎng)，選擇 生長狀態(tài)良好的細胞，用軟脂酸對正常肝細胞進行誘導，處理1211、2411、4811、7211后收集細 胞并測定甘油三脂（TG)含量，選擇使正常肝細胞TG含量明顯增加且細胞生長良好的誘導 時間，以建立體外非酒精性脂肪肝病細胞模型； ② 將文蛤去殼取內臟后放入蒸餾水中輕輕攪拌，洗去雜質后勻漿，存放于-20°C 或-80°C備用； ③ 將步驟②制得的文蛤勻漿液進行酶解，經過超濾膜，分別截取5KDa分子量以下、 5KDa?8KDa以及8KDa分子量以上的3個不同分子段酶解液，用G-25葡聚糖凝膠層析， 對所得的各個峰進行收集，獲得的產物分別作用于步驟①的非酒精性脂肪肝病細胞模型細 胞，以篩選使得非酒精性脂肪肝病細胞模型細胞TG含量減低率最大的酶解液進行收集，然 后將收集的最大峰酶解液于280nm下過Zorbax SB-C18色譜柱，得到兩個洗脫峰，收集大 的洗脫峰高效液相檢測其純度顯示為單一組分，并測定其氨基酸序列，確認為Gin Leu Asn Trp Asp。
3. 根據權利要求2所述的對非酒精性脂肪肝病細胞模型具有修復作用的文蛤酶解寡 肽的制備方法，其特征在于所述步驟①中軟脂酸為15u g/mL，對正常肝細胞進行誘導。
4. 根據權利要求2所述的對非酒精性脂肪肝病細胞模型具有修復作用的文蛤酶解寡 肽的制備方法，其特征在于所述步驟③中使得非酒精性脂肪肝病細胞模型細胞TG含量減 低率最大的為5KDa分子量以下分子段的酶解液，其TG含量降低率達54. 2%。
5. 根據權利要求2所述的對非酒精性脂肪肝病細胞模型具有修復作用的文蛤酶解寡 肽的制備方法，其特征在于所述步驟③中對文蛤勻漿液分別用5種蛋白酶進行酶解，該5種 蛋白酶分別為中性蛋白酶、胰蛋白酶、堿性蛋白酶、胃蛋白酶和木瓜蛋白酶。
6. 根據權利要求4所述的對非酒精性脂肪肝病細胞模型具有修復作用的文蛤酶解寡 肽的制備方法，其特征在于步驟③中使得非酒精性脂肪肝病細胞模型細胞TG含量減低率 最大的酶為堿性蛋白酶，酶解條件為40°C、pH為9. 5、料液比為1:2、酶解時間為8h且加酶 量為 1000U/g。
【文檔編號】C12P21/06GK104387451SQ201410624999
【公開日】2015年3月4日 申請日期:2014年11月7日 優(yōu)先權日:2014年11月7日
【發(fā)明者】楊最素, 趙莎莎, 丁國芳, 黃芳芳, 趙玉勤, 余方苗 申請人:浙江海洋學院