治療和預(yù)防豬繁殖與呼吸綜合征的反義dna序列及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供治療和預(yù)防豬繁殖與呼吸綜合征(PRRS)的反義DNA序列及其應(yīng)用。所述單鏈反義DNA序列是以豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV）基因部分序列作為靶點(diǎn)，設(shè)計(jì)并合成的20nt的反義DNA，不帶有其他化學(xué)修飾。采用脂質(zhì)體介導(dǎo)法轉(zhuǎn)染猴腎上皮Marc-145細(xì)胞，能夠顯著抑制PRRSV在Marc-145細(xì)胞上的增殖，通過熒光定量RT-PCR方法和間接免疫熒光實(shí)驗(yàn)方法檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)該反義DNA序列具有顯著下調(diào)豬繁殖與呼吸綜合征病毒核蛋白基因表達(dá)、抑制病毒增殖的作用。因此本發(fā)明的反義DNA序列在豬繁殖與呼吸綜合征病毒感染的治療和控制中具有廣泛的應(yīng)用前景，對(duì)基因治療豬繁殖與呼吸綜合征具有重要價(jià)值，所述反義DNA序列來源容易，成本低廉，具有極大的市場(chǎng)價(jià)值。
【專利說明】治療和預(yù)防豬繁殖與呼吸綜合征的反義DNA序列及其應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及用于治療豬繁殖與呼吸綜合征病毒感染中的應(yīng)用，特別是治療和預(yù)防 豬繁殖與呼吸綜合征的反義DNA序列及其應(yīng)用。 技術(shù)背景
[0002] 豬繁殖與呼吸綜合征（Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome， PRRS)，又名藍(lán)耳病，是世界范圍內(nèi)給養(yǎng)豬業(yè)造成巨大經(jīng)濟(jì)損失的重要傳染病之一，由于 豬繁殖與呼吸綜合征病毒（Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus， PRRSV)存在較大的遺傳變異性，時(shí)常發(fā)生由于疫苗接種失敗而使PRRSV再次成為原發(fā)性病 原，給該病的預(yù)防和治療帶來很大困難。因此，如何有效地控制該病的流行是目前研究者和 生產(chǎn)者面臨的嚴(yán)峻挑戰(zhàn)和重大課題。高效、安全的PRRS疫苗是目前藍(lán)耳病控制措施研究中 的一個(gè)焦點(diǎn)。但病毒的高頻變異特性以及缺乏對(duì)PRRSV免疫逃逸機(jī)制及其致病的分子機(jī)制 的深入認(rèn)識(shí)，使得疫苗研究處于一個(gè)瓶頸時(shí)期，因此有必要建立另外一種新的抗病毒策略。
[0003] 反義核酸（antisense oligonuleotides, AS-〇Ns)是指與革EDNA 或RNA喊基互補(bǔ)， 并能與之結(jié)合的一段DNA或RNA，一般AS-〇Ns長(zhǎng)度為15?20堿基。1967年，Belikova等 提出了利用一段反義寡核苷酸來特異性地抑制基因表達(dá)的設(shè)想。1978年，Paul等利用一段 反義DNA寡聚核苷酸鏈成功地抑制了 Rous肉瘤病毒的復(fù)制，引起人們極大地關(guān)注。20世紀(jì) 80年代，寡核苷酸人工合成技術(shù)的成功，使反義核酸的研究迅速發(fā)展起來。目前，反義核酸 技術(shù)作為一種有效的研究手段正被廣泛地應(yīng)用于功能基因組學(xué)和藥物研發(fā)。
[0004] 目前普遍認(rèn)為反義核酸可以在復(fù)制、轉(zhuǎn)錄、表達(dá)3個(gè)水平上發(fā)揮作用。其機(jī)制 為：（1)在細(xì)胞核內(nèi)以堿基配對(duì)原理與基因組DNA結(jié)合，從復(fù)制與轉(zhuǎn)錄水平發(fā)揮反義阻止作 用，這種反義技術(shù)稱為"反基因治療"(Anti-gene therapy) ; (2)與mRNA的5'末端的SD序 列或核糖體結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合，或與mRNA的SD序列上游的非編碼區(qū)結(jié)合，改變mRNA的二級(jí)結(jié) 構(gòu)，阻礙核糖體的結(jié)合，從而阻礙翻譯；（3)作用于mRNA的poly A形成位點(diǎn)，阻止成熟和 轉(zhuǎn)運(yùn)；(4)作用于mRNA的5'末端，阻止帽子結(jié)構(gòu)的形成；反義核酸與靶序列結(jié)合后激活某 些酶如RNAse H，將靶序列降解。一種反義核酸究竟通過何種途徑發(fā)揮抑制功能，取決于反 義寡核苷酸的種類是DNA還是RNA，以及是否經(jīng)過修飾等具體情況。
[0005] 鑒于PRRS對(duì)養(yǎng)豬業(yè)造成的嚴(yán)重危害，而以疫苗預(yù)防接種為主的防制措施存在著 種種不足：如由于弱毒疫苗接種導(dǎo)致該病的爆發(fā)，在接種滅活疫苗豬群中爆發(fā)非典型PRRS 流行等，使得人們對(duì)疫苗使用的安全性和效率提出了疑問。特異、高效的抗病毒藥物在控制 PRRS中的應(yīng)用必然是全面控制PRRSV措施的一個(gè)良好補(bǔ)充?；诜戳x核酸在醫(yī)學(xué)研究領(lǐng)域 中的良好應(yīng)用前景以及控制PRRS流行的緊迫性，特提出本項(xiàng)目研究的立項(xiàng)依據(jù)。本發(fā)明將 針對(duì)豬繁殖與呼吸綜合征病毒的5'-非編碼區(qū)，NSP9和0RF7基因的正、負(fù)鏈序列，運(yùn)用計(jì) 算機(jī)軟件設(shè)計(jì)反義寡核苷酸以靶細(xì)胞的體外培養(yǎng)為模型，旨在開發(fā)一種新的抗豬繁殖與呼 吸綜合征病毒的藥物，并為最終應(yīng)用于臨床獸醫(yī)領(lǐng)域奠定基礎(chǔ)。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的目的在于提供一種治療和預(yù)防豬繁殖與呼吸綜合征的反義DNA序列及 其應(yīng)用。
[0007] 為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的上述目的，本發(fā)明提供了如下的技術(shù)方案：
[0008] 1、用于治療和預(yù)防豬繁殖與呼吸綜合征的反義DNA序列，其序列為下列序列中的 任意一個(gè)或組合使用：
[0009] YN-2 :5' -ATTTGACGCTATGTGAGCTG-3'
[0010] YN-3 :5, -CAGCTCACATAGCGTCAAAT-3，
[0011] YN-8:5，-TGCAGCATCCTCACAACCGT-3，
[0012] 2、本發(fā)明采用化學(xué)合成的反義DNA序列。
[0013] 3、本發(fā)明針對(duì)豬繁殖與呼吸綜合征病毒的5' -UTR，0RF5和NSP9基因的正、負(fù)鏈序 列，設(shè)計(jì)多條反義DNA序列。通過顯微鏡觀察不同處理組病毒所致細(xì)胞CPE的變化、熒光定 量RT-PCR方法和間接免疫熒光等方法，從病毒mRNA和病毒蛋白水平，評(píng)價(jià)篩選所設(shè)計(jì)的反 義DNA對(duì)PRRSV流行毒株增殖的影響。試驗(yàn)結(jié)果表明，本發(fā)明篩選出的反義DNA序列可抑 制PRRSV在Marc-145細(xì)胞上的增殖；反義DNA在制備治療豬繁殖與呼吸綜合征藥物中的可 能作用機(jī)制在于：在分子水平上，反義DNA抑制豬繁殖與呼吸綜合征病毒mRNA基因的表達(dá)， 從而抑制病毒蛋白增殖與感染。
[0014] 本發(fā)明具有下述優(yōu)點(diǎn)：
[0015] 1.目前尚無治療PRRSV感染的特效藥物，高效、安全的PRRS疫苗是目前藍(lán)耳病控 制措施研究中的一個(gè)焦點(diǎn)。但病毒的高頻變異特性以及缺乏對(duì)PRRSV免疫逃逸機(jī)制及其致 病分子機(jī)制的深入認(rèn)識(shí)，使得疫苗研究處于了一個(gè)瓶頸時(shí)期，因此，尋找新的抗病毒策略， 已成為目前豬藍(lán)耳防制研究中的熱點(diǎn)。反義DNA具有顯著下調(diào)豬繁殖與呼吸綜合征病毒核 蛋白基因表達(dá)、抑制病毒增殖的作用，體外細(xì)胞藥效實(shí)驗(yàn)顯示具有確切的抗病毒效果。
[0016] 2.本發(fā)明是關(guān)于用于治療和預(yù)防豬繁殖與呼吸綜合征的反義DNA序列。反義DNA 序列可為感染豬繁殖與呼吸綜合征病毒的豬只提供新的治療藥物，具有劑量適中，費(fèi)用適 中，用藥方便，療效顯著，毒副作用小等優(yōu)點(diǎn)。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0017] 圖1本發(fā)明的反義DNA片段所針對(duì)PRRSV基因位點(diǎn)作用示意圖。
[0018] 圖2本發(fā)明的反義DNA片段抑制PRRSV在Marc-145細(xì)胞增殖效果示意圖。
[0019] 圖3本發(fā)明的反義DNA片段抑制PRRSV mRNA基因表達(dá)抑制示意圖。
[0020] 圖4本發(fā)明的反義DNA片段抑制PRRSV核蛋白表達(dá)示意圖。

【具體實(shí)施方式】
[0021] 以下結(jié)合附圖1-4,用本發(fā)明的實(shí)施例來進(jìn)一步說明本發(fā)明的實(shí)質(zhì)性內(nèi)容，但并不 以此來限定本發(fā)明。
[0022] 以下實(shí)施例中所使用的技術(shù)，包括基因測(cè)序、合成、細(xì)胞轉(zhuǎn)染等分子生物學(xué)技術(shù)， 以及細(xì)胞培養(yǎng)、檢測(cè)技術(shù)等，除非特別說明，均為本領(lǐng)域的技術(shù)人員已知的常規(guī)技術(shù)；所使 用的儀器設(shè)備、試劑、細(xì)胞系等，除非是本說明書特別說明，均為本領(lǐng)域的研究和技術(shù)人員 通過公共途徑獲得。
[0023] 實(shí)施例1 :反義DNA的設(shè)計(jì)
[0024] 反義DNA的設(shè)計(jì)策略：1)完整地預(yù)測(cè)mRNA的主要二級(jí)結(jié)構(gòu)和次要二級(jí)結(jié)構(gòu)，這些 結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)主要遵循自由能最小，不在折疊區(qū)。盡可能地找到單鏈區(qū)域、如果單鏈區(qū)域的長(zhǎng)度 不夠，兩端可以延伸到雙鏈區(qū)域；2)反義核酸的長(zhǎng)度要求20nt。一般選用起始密碼子（AUG) 或其附近的20個(gè)堿基序列，或是在mRNA的兩端，或是頸環(huán)結(jié)構(gòu)，盡可能在單鏈區(qū)域；3)盡 量含有CCAC，TCCC，ACTC，GCCA或CTCT堿基，這些堿基有助于增強(qiáng)反義核酸作用；4) CG含量 也有助于反義核酸發(fā)揮作用，控制G+C含量在40%至60%之間；5)選擇RNA二級(jí)結(jié)構(gòu)中不 穩(wěn)定的部位作為靶點(diǎn)，從而使反義核酸與靶位點(diǎn)牢固結(jié)合。根據(jù)PRRSV毒株參照序列與運(yùn) 用DNAStar Lasergene 7. 1在NCBI上下載盡可能找到的（>100條）PRRSV毒株的5' -UTR 端、0RF5、NSP9等基因進(jìn)行分析，找出共有保守區(qū)，以保守區(qū)域正鏈和負(fù)鏈為靶序列，然后 使用RNA二級(jí)結(jié)構(gòu)分析軟件RNAStructure 5. 3對(duì)PRRSV流行毒株的5' -UTR、0RF5、NSP9 三個(gè)區(qū)域進(jìn)行二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)及 Overall Δ G37. 0、Break targ. Δ G37. 0、Duplex Δ G37. 0、 oligo-self AG37. 0、oligo-oligo AG37. 0等重要參數(shù)分析，在此基礎(chǔ)上設(shè)計(jì)了反義DNA, 送上海生工合成，合成的DNA均經(jīng)HPLC純化。反義DNA分別為：
[0025] YN-2 :5' -ATTTGACGCTATGTGAGCTG-3'
[0026] YN-3 :5, -CAGCTCACATAGCGTCAAAT-3，
[0027] YN-8:5 ' -TGCAGCATCCTCACAACCGT-3 '
[0028] 2、使用的陰性及陽性對(duì)照序列分別為：
[0029] 陰性對(duì)照：
[0030] CP1 :5' -GATATACACAACACCCAATT-3'
[0031] 陽性對(duì)照：
[0032] 5UP2 :5, -CGTGGCATAGAGCCAACACC-3'
[0033] 3、圖1為本發(fā)明的反義DNA片段所針對(duì)病毒基因位點(diǎn)作用示意圖，其中YN-2和 YN-3針對(duì)PRRSV的0RF5基因，YN-8針對(duì)PRRSV的NSP9基因，陽性對(duì)照5UP2針對(duì)PRRSV的 5-UP2區(qū)域。
[0034] 實(shí)施例2 :反義DNA抑制病毒致細(xì)胞病變效應(yīng)
[0035] 1、將生長(zhǎng)良好的Marc-145細(xì)胞，用0. 25 %的豬胰蛋白酶消化后，計(jì)數(shù)，然后 1 X 104cells/孔，每孔100 μ 1，加到96孔培養(yǎng)板中，置于二氧化碳培養(yǎng)箱中待細(xì)胞長(zhǎng)至單 層，待用。將各個(gè)實(shí)驗(yàn)組的反義DNA在最大無毒劑量范圍（<40μΜ)內(nèi)，即采取32μΜ的 反義DNA，接種25個(gè)TCID50/孔的ΥΝ-1株藍(lán)耳病病毒，病毒孵育1. 5h后將反義DNA利用 Lipofectamine?2000轉(zhuǎn)染到Marc-145細(xì)胞中，4h后換成正常培養(yǎng)基，在37°C，5% C02培 養(yǎng)箱中培養(yǎng)，連續(xù)培養(yǎng)60h，逐日觀察各實(shí)驗(yàn)組中細(xì)胞病變程度，并與正常細(xì)胞對(duì)照組和病 毒對(duì)照組比較。
[0036] 2、結(jié)果如圖2所示，將多種反義DNA及陽性、陰性對(duì)照反義DNA序列轉(zhuǎn)染入已接種 PRRSV的Marc-145細(xì)胞中，連續(xù)培養(yǎng)60h，可見YN-2、YN-3和YN-8能夠顯著地抑制PRRSV 致細(xì)胞CPE。
[0037] 實(shí)施例3 :反義DNA抑制PPRSV mRNA表達(dá)水平分析
[0038] 1、將生長(zhǎng)良好的Marc-145細(xì)胞，用0.25%的豬胰蛋白酶消化后，計(jì)數(shù)，然后按照 1 X 104個(gè)細(xì)胞每孔的密度進(jìn)行培養(yǎng)，每孔100 μ 1，加到96孔培養(yǎng)板中，置于二氧化碳培養(yǎng) 箱中待細(xì)胞長(zhǎng)至單層，待用。采用25個(gè)TCID5(/孔的ΥΝ-1株藍(lán)耳病病毒接種細(xì)胞，病毒孵 育1.511后將32 4 1的各個(gè)實(shí)驗(yàn)組反義0嫩（無毒劑量范圍內(nèi)）利用1^?(^6(^&1^116"12000 轉(zhuǎn)染到Marc-145細(xì)胞中，4h后換成5%的DMEM完全培養(yǎng)基，37°C，5% C02培養(yǎng)箱中連續(xù)培 養(yǎng)60h收取細(xì)胞，提取RNA，然后反轉(zhuǎn)錄成cDNA，最后采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR的方法檢測(cè)不 同濃度反義DNA對(duì)PRRSV ORF7和5'-UTR基因 mRNA表達(dá)水平的影響，數(shù)據(jù)結(jié)果根據(jù)Pfaff 1 法使用數(shù)據(jù)分析軟件SPSS 11.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。
[0039] 2、結(jié)果如圖3所示，將多種反義DNA及陽性、陰性對(duì)照反義DNA序列轉(zhuǎn)染入已接種 PRRSV的Marc-145細(xì)胞中，連續(xù)培養(yǎng)60h，可見YN-2、YN-3和YN-8能夠顯著的抑制PRRSV mRNA的表達(dá)。
[0040] 實(shí)施例4 :反義DNA抑制PRRSV病毒蛋白增殖效果的檢測(cè)
[0041] 1、將生長(zhǎng)良好的Marc-145細(xì)胞，用0.25%的豬胰蛋白酶消化后，計(jì)數(shù)，然后按照 1 X 104個(gè)細(xì)胞每孔的密度進(jìn)行培養(yǎng)，每孔100 μ 1，加到96孔培養(yǎng)板中，置于二氧化碳培養(yǎng) 箱中待細(xì)胞長(zhǎng)至單層，待用。之后接種病毒：采用25個(gè)TCID5(/孔的ΥΝ-1株藍(lán)耳病病毒接 種細(xì)胞，病毒孵育1. 5h后將32 μ Μ的各個(gè)實(shí)驗(yàn)組反義DNA采用Lip〇fectamineTM2000轉(zhuǎn)染 到Marc-145細(xì)胞中，4h后換成5%的DMEM完全培養(yǎng)基。
[0042] 2、連續(xù)培養(yǎng)60h后進(jìn)行間接免疫實(shí)驗(yàn)，具體步驟如下：
[0043] 1)用37°C預(yù)溫的0. 05M/PBS (pH7. 4)漂洗細(xì)胞3遍（每次浸泡2min);向96孔中 緩慢加入1〇〇μ 1預(yù)冷的2%多聚甲醛，放入4°C冰箱中固定20-30min。
[0044] 2)固定結(jié)束后用冷的0· 05M/PBS(pH7. 4)漂洗3遍（每次浸泡2min)，然后自然 干燥；經(jīng)上面步驟清洗過后，采用含0. 3% Triton X-100的PBS穿透15min，之后用冷的 0· 05M/PBS (ρΗ7· 4)漂洗3遍（每次浸泡2min)，然后自然干燥；
[0045] 3)用1 %的脫脂奶粉封閉：（96孔板中進(jìn)行，PBS (pH7. 4)來配制1 %的脫脂奶粉） 每孔加入1 %的脫脂奶粉，把96孔全部浸泡即可，4°C封閉2h ;然后加入一抗處理。在96孔 中滴加終濃度為5 μ g/mL a -PRRSV -抗，每孔50 μ 1，4°C過夜，清洗、晾干，吸去一抗，用PBS 漂洗3次（每次浸泡5min)，自然干燥；
[0046] 4)在96孔中上滴加 FITC標(biāo)記的羊抗鼠二抗60μ 1(濃度為5ug/mL)，37°C感作lh ; 吸取二抗后用的1 XPBS漂洗3次（每次浸泡5min)，最后在避光的條件下快速加入二抗。
[0047] 5)二抗處理完之后，每孔加入DAPI 50μ 1/孔，室溫lOmiruPBS洗3遍，每次5min。 突光顯微鏡下觀察。
[0048] 3、將多種反義DNA及陽性、陰性對(duì)照反義DNA序列轉(zhuǎn)染入已接種PRRSV的 Marc-145細(xì)胞中，連續(xù)培養(yǎng)60h，可見YN-2、YN-3和YN-8能夠顯著的抑制PRRSV核蛋白的 表達(dá)，結(jié)果如圖4所示。
【權(quán)利要求】
1. 一種治療和預(yù)防豬繁殖與呼吸綜合征的反義DNA序列，其特征在于，核酸序列為下 列序列中的任意一個(gè)或組合使用： YN-2 :5' -ATTTGACGCTATGTGAGCTG-3' YN-3 :5, -CAGCTCACATAGCGTCAAAT-3， YN-8 :5' -TGCAGCATCCTCACAACCGT-3'。
2. -種治療和預(yù)防豬繁殖與呼吸綜合征的反義DNA序列的應(yīng)用，其特征在于，所述核 酸序列可特異性地與豬繁殖與呼吸綜合征病毒基因的特定靶序列結(jié)合。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的治療和預(yù)防豬繁殖與呼吸綜合征的反義DNA序列的應(yīng)用，其 特征在于，所述核酸序列用于制備治療和/或預(yù)防豬繁殖與呼吸綜合征的藥物。
4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的治療和預(yù)防豬繁殖與呼吸綜合征的反義DNA序列的應(yīng)用，其 特征在于，所述治療和/或預(yù)防繁殖與呼吸綜合征的藥物為抑制預(yù)防繁殖與呼吸綜合征病 毒的藥物。
5. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的治療和預(yù)防豬繁殖與呼吸綜合征的反義DNA序列的應(yīng)用，其 特征在于，所述治療和/或預(yù)防繁殖與呼吸綜合征的藥物為抑制預(yù)防繁殖與呼吸綜合征病 毒蛋白合成的藥物。
【文檔編號(hào)】C12N15/113GK104195139SQ201410445817
【公開日】2014年12月10日 申請(qǐng)日期:2014年9月3日 優(yōu)先權(quán)日:2014年9月3日
【發(fā)明者】尹革芬, 畢峻龍, 李文貴, 李想, 鄭龍龍, 楊貴樹 申請(qǐng)人:云南農(nóng)業(yè)大學(xué)