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基因多態(tài)性變異位點早期評估乳腺癌風(fēng)險的診斷試劑盒的制作方法

文檔序號:484339閱讀:290來源:國知局
基因多態(tài)性變異位點早期評估乳腺癌風(fēng)險的診斷試劑盒的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種基因多態(tài)性變異位點早期評估乳腺癌風(fēng)險的診斷試劑盒,所述的試劑盒包括七個單核苷酸多態(tài)性位點基因型的特異性引物與七個DNA測序引物,針對的檢測基因為五個雌激素代謝通路相關(guān)基因:ESR1,GSTP1,COMT,SHBG和CYP19A1基因。常見的對乳腺癌進(jìn)行發(fā)病風(fēng)險估計多用單個或幾個SNP位點進(jìn)行分析,存在實用性差,敏感性和特異性都不行,很少能用于實際檢測和應(yīng)用。本發(fā)明所用的檢測位點都與乳腺癌易感性相關(guān),選擇的位點有一定的代表性,通過檢測,能夠有效預(yù)測乳腺癌的發(fā)病風(fēng)險。
【專利說明】基因多態(tài)性變異位點早期評估乳腺癌風(fēng)險的診斷試劑盒

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于分子生物學(xué)領(lǐng)域,涉及醫(yī)學(xué)和生物技術(shù),具體涉及一種女性乳腺癌發(fā) 病風(fēng)險的基因檢測試劑盒,根據(jù)檢測結(jié)果從基因?qū)用嬖u估女性乳腺癌發(fā)病的風(fēng)險,并作為 預(yù)防女性乳腺癌的建議指導(dǎo)。

【背景技術(shù)】
[0002] 乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤之一,發(fā)病率占全身各種惡性腫瘤的7-10%,位居 女性惡性腫瘤發(fā)病率的第一位。近年隨著環(huán)境和人口老齡化的影響,乳腺癌的發(fā)病率有明 顯增高的趨勢。早期發(fā)現(xiàn)并及時治療是乳腺癌防治的關(guān)鍵。
[0003] 人類基因組計劃的完成使我們對癌癥發(fā)生的分子機(jī)制認(rèn)識進(jìn)入了新的階段?;?多態(tài)性(single nucleotide polymorphism, SNP)普遍存在于機(jī)體DNA序列中,是第三代 遺傳標(biāo)記。SNP研究是人類基因組計劃走向應(yīng)用的重要步驟。因為SNP可作為一個強(qiáng)有力 的工具,用于高危群體的發(fā)現(xiàn)、疾病相關(guān)基因的鑒定、藥物的設(shè)計和測試以及生物學(xué)的基礎(chǔ) 研究等。通過病例對照研究不僅對于發(fā)現(xiàn)癌癥相關(guān)基因及闡明其作用機(jī)制起著重要作用, 而且對于癌癥易感性早期風(fēng)險診斷和個體化醫(yī)療具有重要意義。
[0004] 與乳腺癌的發(fā)病直接或間接相關(guān)的基因眾多,其多態(tài)性位點變異可影響乳腺癌的 發(fā)病風(fēng)險,因此建立簡單、可靠、快速的乳腺癌遺傳易感性的無創(chuàng)檢測方法,能夠檢測出乳 腺癌發(fā)生相關(guān)的基因單核苷酸位點基因型,及時篩查出乳腺癌易感高危人群,從而根據(jù)檢 測結(jié)果盡早采取預(yù)防措施,這對于提高乳腺癌的早診早治有重要意義。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明基于 ESRl(rs2046210, rs9383951)、C0MT(rs4680) SHBG(rs6259) GSTPl(rsl695) CYP19Al(rsl0046,rs700519)的7個單核苷酸多態(tài)性位點基因型可用于評 估乳腺癌風(fēng)險基礎(chǔ)上,本發(fā)明提供一種女性乳腺癌遺傳易感性基因檢測試劑盒。
[0006] -種基因多態(tài)性變異位點早期評估乳腺癌風(fēng)險的診斷試劑盒,所述的試劑盒包括 七個單核苷酸多態(tài)性位點基因型的特異性引物與七個DNA測序引物,針對的檢測基因為五 個雌激素代謝通路相關(guān)基因:ESR1,GSTP1,COMT,SHBG和CYP19A1基因。
[0007] 所述的特異性引物是指針 ESR1 (rs2046210, rs9383951)、C0MT(rs4680)、 SHBG (rs6259)、GSTP1 (rsl695)、CYP19A1 (rsl0046, rs700519)七個單核苷酸多態(tài)性位點, 能特異性擴(kuò)增出包含這七個SNPs位點的DNA片段的引物對。
[0008] 所述的 DNA 測序引物是針對 ESR1 (rs2046210, rs9383951)、C0MT(rs4680)、 SHBG (rs6259)、GSTP1 (rsl695)、CYP19A1 (rsl0046, rs700519)七個單核苷酸多態(tài)性位點而 設(shè)計,能通過DNA測序技術(shù)特異性檢測出上述七個SNPs位點基因型的DNA測序引物。
[0009] 所述的七對特異性引物序列如下: (l)ESRlrs2046210 正向引物:5' CCATTTCTCCCTTCTTGTTGTGA 3,(SEQ ID N0:1);反 向引物 5'AAGGCATGCTGGAAGAGTGT 3'(SEQ ID N0:2); (2) ESRlrs9383951 正向引物:5'AGTGGCGCCAACTCTTATTGA 3'(SEQ ID N0:3);反向引 物 5' CTAAGGTTGGGAGGGCAAGT 3' (SEQ ID N0:4); (3) C0MT(rs4680)正向引物:5'CGAGGCTCATCACCATCGAG3'(SEQ ID N0:5);反向引物 5,ACTGAGGGGCCTGGTGATAG 3,(SEQ ID N0:6); (4) SHBG(rs6259)正向引物:5'TTGAGGGGAAGGAAACCTCTG3'(SEQ ID N0:7);反向引物 5,GTGGAGCTTTAATGGGAAGCG3,(SEQ ID N0:8); (5) GSTPl(rsl695)正向引物:5'TCATCCTTCCACGCACATCC3'(SEQ ID N0:9);反向引物 5' TTCTTTGTTCAGCCCCCAGT3' (SEQ ID N0:10); (6) CYP19A1 rsl0046 正向引物:5'ACAGTGTTCTGACTGACCCAT3'(SEQ ID N0:11);反向 引物 5' CATGGGCCACTGAGTGTTCA3'(SEQ ID N0:12); (7) CYP19A1 rs700519 正向引物:5'ACAGGCTTGATTTCGCTACCA3'(SEQ ID N0:13);反 向引物 5' TCAACTCAGTGGCAAAGTCCA3'(SEQ ID N0:14)。
[0010] 所述的七對DNA測序引物序列如下: (a) ESRlrs2046210 測序引物:5'GATGGAGGTACAGAAAGGCAT3'(SEQ ID N0:15); (b) ESRlrs9383%l 測序引物:5'TTGGGAGGGCAAGTCCTAGT3'(SEQ ID N0:16); (c) C0MT(rs4680)測序引物:5'GTGGGTTTTCAGTGAACGTGG3'(SEQ ID N0:17); (d) SHBG(rs6259)測序引物:5'GGAGGAGTGGAAAAGTGGGG3'(SEQ ID N0:18); (e) GSTPl(rsl695)測序引物:5'CCCCAGGGCTCTATGGGAAG3'(SEQ ID N0:19); (f) CYP19Al rsl0046 測序引物:5,TCTGGCTAACTGTCTGATCATTTTC3'(SEQ ID N0:20); (g) CYP19Al rs700519 測序引物:5'AGGCTTGATTTCGCTACCAGT 3'(SEQ ID N0:21)。 toon] 所述的試劑盒的每一人份包括: (i) PCR 反應(yīng)體系:10XPCR 反應(yīng)緩沖液 2. 5ul ;25mM dNTP 混合液(λ 2ul ;5U/ul Taq DNA聚合酶0. 125ul ;20uM特異性引物對,每條引物各0. 25ul ;ddH20 19. 175ul ; (ii) PCR 產(chǎn)物純化體系:lU/ul SAP 酶 0· 75ul ;10U/ul Exol 酶 0· 375ul ;ddH20 3. 875ul ; (iii) 測序反應(yīng)體系:25% Big Dye mix lul ;3. 2uM DNA 測序引物 lul ;125Mm EDTA 溶 液 lul ;無水乙醇 15ul ;70% 乙醇溶液 30ul ;HIDI 溶液 8ul ;ddH20 2ul。
[0012] 本發(fā)明的有益效果: 常見的對乳腺癌進(jìn)行發(fā)病風(fēng)險估計多用單個或幾個SNP位點進(jìn)行分析,存在實用性 差,敏感性和特異性都不行,很少能用于實際檢測和應(yīng)用。本發(fā)明所用的檢測位點都與乳腺 癌易感性相關(guān),選擇的位點有一定的代表性,通過檢測,能夠有效預(yù)測乳腺癌的發(fā)病風(fēng)險。

【具體實施方式】
[0013] 。ESR1基因編碼雌激素受體。C0MT編碼兒茶酚-0-甲基轉(zhuǎn)移酶,與雌激素的滅活 相關(guān)。C0MT第4號外顯子上一個G>A多態(tài)性位點突變,導(dǎo)致其第158位密碼子編碼的氨基 酸有Val變?yōu)镸et。C0MT基因的Val和Met等位基因與兒茶酚-0-甲基轉(zhuǎn)移酶活性高低相 關(guān),Val/Val基因型酶具有高活性,Val/Met基因型酶活性中等,Met/Met基因型酶活性最 低。研究表明該多態(tài)性位點與乳腺癌發(fā)病相關(guān)。CYP19A1基因編碼細(xì)胞色素 P450芳香化酶 是雌激素合成酶,rsl0046位于CYP19A1基因的3'UTR區(qū),rs700519多態(tài)性位點導(dǎo)致R264C 變異。SHBG編碼雌激素結(jié)合球蛋白,GSTP1編碼II相代謝酶谷胱甘肽轉(zhuǎn)硫酶。
[0014] 下面結(jié)合具體實施例,進(jìn)一步闡釋本發(fā)明。應(yīng)理解,這些實施例僅用于說明本發(fā)明 而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法,或按照制造廠商 所建議的條件。
[0015] 實施例1. 通過對330例乳腺癌患者和400例正常對照進(jìn)行基因分型,分析由七個位點組成的單 體型在病例組和正常組的頻率。結(jié)果發(fā)現(xiàn)單體型TGGGGTC顯著提高乳腺癌發(fā)病風(fēng)險,與常 見單體型相比,乳腺癌發(fā)病風(fēng)險提高20倍,P〈0. 0001,具有顯著性差異。
[0016] 實施例2 .檢測試劑盒的應(yīng)用 1、DNA抽提 抽取靜脈血或刮取受撿者口腔黏膜上皮細(xì)胞,用酚氯仿法抽提基因組DNA。
[0017] 2、PCR 反應(yīng) 使用檢測試劑盒中PCR反應(yīng)組件,其中含下列引物對: (1) ESRlrs2046210 正向引物:5' CCATTTCTCCCTTCTTGTTGTGA 3,(SEQ ID N0:1);反 向引物 5'AAGGCATGCTGGAAGAGTGT 3'(SEQ ID N0:2); (2) ESRlrs9383951 正向引物:5'AGTGGCGCCAACTCTTATTGA 3'(SEQ ID N0:3);反向引 物 5' CTAAGGTTGGGAGGGCAAGT 3' (SEQ ID N0:4); (3) C0MT(rs4680)正向引物:5'CGAGGCTCATCACCATCGAG3'(SEQ ID N0:5);反向引物 5,ACTGAGGGGCCTGGTGATAG 3,(SEQ ID N0:6); (4) SHBG(rs6259)正向引物:5'TTGAGGGGAAGGAAACCTCTG3'(SEQ ID N0:7);反向引物 5'GTGGAGCTTTAATGGGAAGCG3'(SEQ ID N0:8); (5) GSTPl(rsl695)正向引物:5'TCATCCTTCCACGCACATCC3'(SEQ ID N0:9);反向引物 5' TTCTTTGTTCAGCCCCCAGT3' (SEQ ID N0:10); (6) CYP19A1 rsl0046 正向引物:5'ACAGTGTTCTGACTGACCCAT3'(SEQ ID N0:11);反向 引物 5' CATGGGCCACTGAGTGTTCA3'(SEQ ID N0:12); (7) CYP19A1 rs700519 正向引物:5'ACAGGCTTGATTTCGCTACCA3'(SEQ ID N0:13);反 向引物 5' TCAACTCAGTGGCAAAGTCCA3'(SEQ ID N0:14)。
[0018] PCR擴(kuò)增的反應(yīng)體系為:10X反應(yīng)緩沖液2. 5ul ;25mM的dNTP混合液0. 2ul ;5U/ul Taq DNA聚合酶0. 125ul ;DNA模板lul ;20uM特異性引物對(每條引物各0. 25ul) ;ddH20 19.175ul ; 反應(yīng)條件為:94°C 4min變性酶激活,94°C 30sec變性,55°C 30sec退火,72°C lmin 延伸,25個循環(huán),最后72 °C延長5分鐘。
[0019] 3、PCR產(chǎn)物純化 使用試劑盒中的PCR產(chǎn)物純化組件,反應(yīng)體系為總體積25ul,包含PCR產(chǎn)物20ul, lU/ul SAP 酶 0· 75ul ;10U/ul ΕχοΙ 酶 0·375ul ;ddH20 3.875ul。
[0020] 在ABI2720型PCR擴(kuò)增儀上進(jìn)行反應(yīng),反應(yīng)條件為37°C、15min,72°C、20min。
[0021] 4、DNA測序反應(yīng) 使用檢測試劑盒中的測序反應(yīng)組件,其中,含有下列DNA測序引物: (a)ESRlrs2046210 測序引物:5'GATGGAGGTACAGAAAGGCAT3'(SEQIDN0:15); (b) ESRlrs938395l測序引物:5'TTGGGAGGGCAAGTCCTAGT 3'(SEQIDNO:l6); (c) C0MT(rs4680)測序引物:5'GTGGGTTTTCAGTGAACGTGG3'(SEQIDN0:17) ; (d) SHBG(rs6259)測序引物:5'GGAGGAGTGGAAAAGTGGGG3'(SEQIDN0:18) ; (e) GSTPl(rsl695)測序引物:5'CCCCAGGGCTCTATGGGAAG3'(SEQIDN0:19) ; (f) CYP19Alrsl0046 測序引物:5,TCTGGCTAACTGTCTGATCATTTTC3'(SEQIDN0:20); (g) CYP19Al rs700519 測序引物:5'AGGCTTGATTTCGCTACCAGT 3'(SEQ ID N0:21)。
[0022] 反應(yīng)的總體系為5ul,包括PCR純化產(chǎn)物lul,25% Big Dye mix lul ;3. 2uM DNA測 序引物 lul ;ddH20 2ul。
[0023] 在ABI2720型PCR擴(kuò)增儀上進(jìn)行反應(yīng),反應(yīng)條件為98°C 2min,后25個循環(huán)的96°C 30s,55°C 30s, 60°C 4min。
[0024] 反應(yīng)結(jié)束后加入125mM EDTA溶液lul和無水乙醇15ul,室溫下沉淀15min,4°C, 3600rpm/min離心30min,去除上清液,加入70%乙醇溶液30ul,3600rpm/min離心15min,去 除上清液,室溫放置20min后加入HIDI溶液8ul,放入測序儀。
[0025] 5、基因型分析 對測序圖譜進(jìn)行分析辨認(rèn)所檢測的SNP位點的基因型。
[0026] 實施例3 .提供女性乳腺癌發(fā)病風(fēng)險基因檢測服務(wù) 1、采樣機(jī)抽提DNA 由醫(yī)院檢驗科醫(yī)師對受檢者進(jìn)行血樣或口腔上皮細(xì)胞采樣,采用酚氯仿法對標(biāo)本進(jìn)行 DNA抽提。
[0027] 2、基因型檢測 使用本發(fā)明提供的試劑盒,對受檢者基因組的ESR1 (rs2046210,rs9383951)、 C0MT(rs4680) SHBG(rs6259) GSTPl(rsl695) CYP19Al(rsl0046,rs700519)的 7 個單核苷 酸多態(tài)性位點分別進(jìn)行DNA測序,確定這7個SNP位點的基因型。
[0028] 3、乳腺癌發(fā)病風(fēng)險的評估 通過對受檢者SNPs基因型的分析,出具乳腺癌發(fā)病風(fēng)險的評估分析報告。報告詳細(xì)說 明了受檢者 ESRl(rs2046210, rs9383951)、C0MT(rs4680) SHBG(rs6259) GSTPl(rsl695) CYP19A1 (rsl0046, rs700519)的7個單核苷酸多態(tài)性位點的基因型信息及發(fā)病風(fēng)險評估結(jié) 果。
【權(quán)利要求】
1. 一種基因多態(tài)性變異位點早期評估乳腺癌風(fēng)險的診斷試劑盒,其特征在于,所述的 試劑盒包括七個單核苷酸多態(tài)性位點基因型的特異性引物與七個DNA測序引物,針對的檢 測基因為五個雌激素代謝通路相關(guān)基因:ESR1,GSTP1,COMT,SHBG和CYP19A1基因。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒,其特征在于:所述的特異性引物是指針 ESR1(rs2046210, rs9383951)、 C0MT(rs4680)、 SHBG(rs6259)、 GSTP1(rsl695)、 CYP19A1 (rsl0046, rs700519)七個單核苷酸多態(tài)性位點,能特異性擴(kuò)增出包含這七個SNPs 位點的DNA片段的引物對。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒,其特征在于:所述的DNA測序引物是針 對 ESRl(rs2046210, rs9383951)、C0MT(rs4680)、SHBG(rs6259)、GSTPl(rsl695)、 CYP19A1 (rsl0046, rs700519)七個單核苷酸多態(tài)性位點而設(shè)計,能通過DNA測序技術(shù)特異 性檢測出上述七個SNPs位點基因型的DNA測序引物。
4. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的試劑盒,其特征在于:所述的七對特異性引物序列如下: (1) ESRlrs2046210 正向引物:5' CCATTTCTCCCTTCTTGTTGTGA 3,(SEQ ID N0:1);反 向引物 5'AAGGCATGCTGGAAGAGTGT 3'(SEQ ID N0:2); (2) ESRlrs9383951 正向引物:5'AGTGGCGCCAACTCTTATTGA 3'(SEQ ID N0:3);反向引 物 5' CTAAGGTTGGGAGGGCAAGT 3' (SEQ ID N0:4); (3) C0MT(rs4680)正向引物:5'CGAGGCTCATCACCATCGAG3'(SEQ ID N0:5);反向引物 5,ACTGAGGGGCCTGGTGATAG 3,(SEQ ID N0:6); (4) SHBG(rs6259)正向引物:5'TTGAGGGGAAGGAAACCTCTG3'(SEQ ID N0:7);反向引物 5,GTGGAGCTTTAATGGGAAGCG3,(SEQ ID N0:8); (5) GSTPl(rsl695)正向引物:5'TCATCCTTCCACGCACATCC3'(SEQ ID N0:9);反向引物 5' TTCTTTGTTCAGCCCCCAGT3' (SEQ ID N0:10); (6) CYP19A1 rsl0046 正向引物:5'ACAGTGTTCTGACTGACCCAT3'(SEQ ID N0:11);反向 引物 5' CATGGGCCACTGAGTGTTCA3'(SEQ ID N0:12); (7) CYP19A1 rs700519 正向引物:5'ACAGGCTTGATTTCGCTACCA3'(SEQ ID N0:13);反 向引物 5' TCAACTCAGTGGCAAAGTCCA3'(SEQ ID N0:14)。
5. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的試劑盒,其特征在于:所述的七對DNA測序引物序列如下: (a) ESRlrs2046210 測序引物:5'GATGGAGGTACAGAAAGGCAT3'(SEQIDN0:15); (b) ESRlrs938395l測序引物:5'TTGGGAGGGCAAGTCCTAGT 3'(SEQIDNO:l6); (c) C0MT(rs4680)測序引物:5'GTGGGTTTTCAGTGAACGTGG3'(SEQIDN0:17) ; (d) SHBG(rs6259)測序引物:5'GGAGGAGTGGAAAAGTGGGG3'(SEQIDN0:18) ; (e) GSTPl(rsl695)測序引物:5'CCCCAGGGCTCTATGGGAAG3'(SEQIDN0:19) ; (f) CYP19Alrsl0046 測序引物:5,TCTGGCTAACTGTCTGATCATTTTC3'(SEQIDN0:20); (g) CYP19Al rs700519 測序引物:5'AGGCTTGATTTCGCTACCAGT 3'(SEQ ID N0:21)。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒,其特征在于,所述的試劑盒的每一人份包括: (i) PCR 反應(yīng)體系:10XPCR 反應(yīng)緩沖液 2. 5ul ;25mM dNTP 混合液 0· 2ul ;5U/ul Taq DNA聚合酶0. 125ul ;20uM特異性引物對,每條引物各0. 25ul ;ddH20 19. 175ul ; (ii) PCR 產(chǎn)物純化體系:lU/ul SAP 酶 0· 75ul ;10U/ul Exol 酶(λ 375ul ;ddH20 3. 875ul ; (iii)測序反應(yīng)體系:25% Big Dye mix lul ;3· 2uM DNA 測序引物 lul ;125Mm EDTA 溶 液 lul ;無水乙醇 15ul ;70% 乙醇溶液 30ul ;HIDI 溶液 8ul ;ddH20 2ul。
【文檔編號】C12Q1/68GK104152557SQ201410388121
【公開日】2014年11月19日 申請日期:2014年8月8日 優(yōu)先權(quán)日:2014年8月8日
【發(fā)明者】潘志文, 付志璇, 徐笑紅 申請人:浙江省腫瘤醫(yī)院
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