醛酮還原酶的重組菌粗酶體系催化合成(s)-n,n-二甲基-3-羥基-3-(2-噻吩)-1-丙胺的方法
【專利摘要】醛酮還原酶的重組菌粗酶體系催化合成(S)-N,N-二甲基-3-羥基-3-(2-噻吩)-1-丙胺（(S)-DHTP）的方法，屬于生物催化不對稱轉(zhuǎn)化【技術(shù)領(lǐng)域】。本發(fā)明是在重組菌粗酶體系中添加輔助底物和初始量輔酶NADP+促進(jìn)體系中的輔酶NADPH的再生循環(huán)，反應(yīng)底物為N,N-二甲基-3-酮-3-(2-噻吩)-1-丙胺（DTKP），重組菌為表達(dá)醛酮還原酶基因的E.coliBL21(DE3)(pETCPAR4)，醛酮還原酶基因cpar4來自于近平滑假絲酵母（Candidaparapsilosis）CCTCCNO：M203011，該基因編碼醛酮還原酶CPAR4，催化不對稱還原DKTP為(S)-DHTP。本發(fā)明利用該無細(xì)胞系統(tǒng)催化反應(yīng)，無需在反應(yīng)體系中額外添加輔酶再生所需的耦聯(lián)酶，提高了酶與底物直接作用的效率，縮短反應(yīng)時(shí)間，獲得較好的轉(zhuǎn)化效果。
【專利說明】醛酮還原酶的重組菌粗酶體系催化合成G?)-N, N-二甲 基-3-輕基(2-噻盼）Η -丙胺的方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種通過醛酮還原酶的重組菌粗酶體系催化合成⑶-Ν，Ν-二甲 基-3-羥基-3- (2-噻吩）-1-丙胺（C?) -DHTP)的方法，屬于生物催化不對稱轉(zhuǎn)化【技術(shù)領(lǐng)域】。

【背景技術(shù)】
[0002] ⑶-DHTP的化學(xué)結(jié)構(gòu)為：

【權(quán)利要求】
1. 一種通過醛酮還原酶的重組菌粗酶體系催化合成（5·)-Ν，Ν-二甲基-3-羥 基-3-(2-噻吩）-1-丙胺的方法，其特征在于 ： 以醛酮還原酶的重組菌粗酶體系為催化劑，并在該無細(xì)胞體系中添加輔助底物和初始 輔酶NADP+實(shí)現(xiàn)輔酶NADPH的再生循環(huán)，同時(shí)催化（N，N-二甲基-3-酮-3- (2-噻吩）-1-丙 胺DKTP不對稱轉(zhuǎn)化反應(yīng)制備光學(xué)純C?) -N，N-二甲基-3-羥基-3- (2-噻吩）-1-丙胺，即 (S) -DHTP ； 所用的輔助底物為葡萄糖、海藻糖、麥芽糖、乳糖、乙醇、或果糖，濃度為10 g/L;輔 酶NADPH初始添加量為0. 005?0. 2 mM ;反應(yīng)的底物為N，N-二甲基-3-酮-3- (2-噻 吩）-1-丙胺，重組菌為表達(dá)醛酮還原酶基因的重組大腸桿菌hcAericAia coB BL21 (DE3) (pETCPAR4)，醒麗還原酶基因來自于近平滑假絲酵母)CCTCC NO :M 203011，該基因編碼醛酮還原酶CPAR4,催化不對稱還原DKTP為（5)-DHTP的反應(yīng)。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述通過醛酮還原酶的重組菌粗酶體系催化合成（5)-N，N-二甲 基-3-羥基-3- (2-噻吩）-1-丙胺的方法，其特征在于步驟為： (1) 重組菌的構(gòu)建：以近平滑假絲酵母（C paraAsiAxsidCCTCC NO :M 203011基因 組DNA作為PCR擴(kuò)增反應(yīng)模板，利用含有限制性酶切位點(diǎn)的引物1 :5' - CCCGCCCG^A TATGTCAGCT CAATTGAAAG TAAAC -3'和含有沿〇1 限制性酶切位點(diǎn)的引物2 :5' -GCCCGCTCGA GGTCATTGAA GTTGTTGAAG CCTG -3' 通過 PCR 反應(yīng)擴(kuò)增 基因片斷； PCR 反應(yīng)體系：ddH20 37 yL，10XReaction Buffer 5 yL，25 mmol/L 的 dNTP 0.5 μ L，50 pmol/μ L 的引物 1 為 1 μ L，50 pmol/μ L 的引物 2 為 1 μ L，基因組 DNA 5 μ L， 5U/ μ L 的 Taq DNA polymerase 0· 5 μ L ; PCR反應(yīng)過程為：94°C 預(yù)變性5 min;94°C 1 min，64°C 1 min，72°C 1 min，進(jìn)行30個(gè) 循環(huán)；72 °C延伸10 min ; 近平滑假絲酵母（fefli/ii/aparaAsiAxsidCCTCC N0:M 203011醛酮還原酶編碼基因， 其基因的核苷酸序列為：SEQ ID NO :1，其氨基酸組成為SEQ ID NO :2 ; 利用限制性內(nèi)切酶和通〇1對擴(kuò)增得到的基因與載體pET-21c進(jìn)行雙酶切 處理，處理后DNA片斷通過粘性末端連接獲得帶有目的基因片斷的重組質(zhì)粒pETCPAR4 ;重 組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌凡cWi BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞，通過含有l(wèi)OOyg/mL氨芐青霉素的 LB平板篩選目的重組菌株萬· BL21 (DE3) (pETCPAR4); (2) 重組菌粗酶體系的制備： LB培養(yǎng)基：胰蛋白胨1%，酵母提取物0. 5%，NaCl 1%，pH7. 0 ;需要時(shí)使用前加入氨芐青 霉素50 μ g/mL，固體培養(yǎng)基添加1. 5%瓊脂粉； 挑取重組菌凡cWiBL21 (DE3) (pETCPAR4)單菌落接種于3mL含50yg/mL氨芐青 霉素的LB液體培養(yǎng)基中，于37°C、200 rpm振蕩培養(yǎng)過夜；取lmL培養(yǎng)液轉(zhuǎn)接于50mL含 50 μ g/mL氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中，于37°C、200 rpm振蕩培養(yǎng)至0D6(?為0. 6 ;向培 養(yǎng)物中加入誘導(dǎo)物IPTG至終濃度1 mmol/L，在培養(yǎng)溫度17°C下誘導(dǎo)培養(yǎng)12~15 h ; 培養(yǎng)后的重組大腸桿菌細(xì)胞10, 000 rpm離心10 min并用生理鹽水洗漆三次后收集； 菌體重新懸浮于pH 6. 5、0. 1M的磷酸鉀緩沖液中，配置成含有濕細(xì)胞濃度為100 g/L的菌 懸液，菌懸液經(jīng)超聲破碎后離心，所得上清液總可溶蛋白濃度5~20 g/L，作為粗酶體系用于 不對稱轉(zhuǎn)化反應(yīng)； (3)⑶-N，N-二甲基-3-羥基-3-(2-噻吩）-1-丙胺的合成： 2mL反應(yīng)體系的組成：lmL pH 6. 5、0. 1 Μ的磷酸鉀緩沖液，lmL粗酶體系，總可溶蛋白 5?20 mg，10g/L輔助底物，1?6g/L底物DKTP，0.005?0.2 mM NADP+;反應(yīng)混合物于2(T30°C 振蕩反應(yīng)8h，反應(yīng)后混合物用2倍體積乙酸乙酯萃取，有機(jī)相用于產(chǎn)物（5·)-DHTP分析。
【文檔編號】C12N1/21GK104152506SQ201410388122
【公開日】2014年11月19日 申請日期:2014年8月8日 優(yōu)先權(quán)日:2014年8月8日
【發(fā)明者】聶堯, 徐巖 申請人:江南大學(xué)