一種a12-脂肪酸脫氫酶基因及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種從深黃被孢霉M6-22中分離的△12-脂肪酸脫氫酶基因，其核苷酸序列如SEQIDN0：1所示，編碼如SEQIDN0：2所示的氨基酸序列；通過構(gòu)建重組載體并在釀酒酵母中表達(dá)，表達(dá)產(chǎn)物具有△12-脂肪酸脫氫酶功能，能催化油酸轉(zhuǎn)化成亞油酸。
【專利說明】-種Δ12-脂肪酸脫氫酶基因及其應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物【技術(shù)領(lǐng)域】和遺傳工程領(lǐng)域，涉及從一種絲狀真菌一深黃被孢霉 (iforiiereBa )Μ6-22中克隆的△ 12_脂肪酸脫氫酶基因，具體講是深黃被孢霉 △12_脂肪酸脫氫酶的核苷酸序列及其應(yīng)用；將該基因直接或與不同載體連接，轉(zhuǎn)入細(xì)菌、 酵母、植物或動物中，利用其編碼Λ 12_脂肪酸脫氫酶產(chǎn)生不飽和脂肪酸的方法和應(yīng)用。

【背景技術(shù)】
[0002] Δ 12-脂肪酸脫氫酶（Δ 12-fatty acid desaturases)又稱油酸脫氫酶（oleate desaturases)。Δ12-脂肪酸脫氫酶的主要作用是在單不飽和脂肪酸油酸（oleic acid) 的第12和13位碳原子之間插入一個雙鍵，形成含有2個雙鍵的多不飽和脂肪酸-亞油酸 (linoleic acid)。Λ 12-脂肪酸脫氫酶是油酸脫氫形成亞油酸的關(guān)鍵酶，是n-3和n-6類 多不飽和脂肪酸（polyunsaturated fatty acid)合成途徑的限速酶，控制著細(xì)胞中大多 數(shù)不飽和脂肪的合成。Λ 12_脂肪酸脫氫酶只存在于植物、藻類和低等真核生物等中，但在 人和哺乳動物細(xì)胞中缺乏，因此，亞油酸是一種人體必須脂肪酸，必須從食物中攝取。膳食 性攝入亞油酸，經(jīng)其它相關(guān)脫氫酶和延伸酶的交替催化下可進(jìn)一步轉(zhuǎn)化成其它長鏈多不飽 和脂肪酸[Horrobin DF，1992, Prog Lipid Res，31:163-194]，這些多不飽和脂肪酸在人體 中具有重要的生理功能。此外，多不飽和脂肪酸是細(xì)胞生物膜的重要組成成分，起到維持 細(xì)胞正常功能和增加機(jī)體抗逆性的作用[Napier JA et al，1999，Curr. Opin. Plant Biol, 2:123-127]，因此包括亞油酸在內(nèi)的多不飽和脂肪酸在保健和醫(yī)療方面有很廣闊的應(yīng)用前 景。研究多不飽和脂肪酸的合成和它的生理作用成為當(dāng)前的熱點(diǎn)。
[0003] Λ12-脂肪酸脫氫酶屬于一類膜整合酶，由于分離和鑒定膜結(jié)合蛋白的難度 很大[MaKeon，1981，酶學(xué)方法，12141-12147 ;wang等，1988,植物生理學(xué)生物化學(xué)， 26:777-792]，因此常規(guī)的生物化學(xué)方法很難得到包括Λ 12-脂肪酸脫氫酶在內(nèi)的各種膜 結(jié)合蛋白性質(zhì)脫氫酶高級機(jī)構(gòu)，而只能通過對酶的核苷酸序列進(jìn)行初步研究，對于脂肪酸 脫氫酶的生物學(xué)功能驗(yàn)證，許多實(shí)驗(yàn)室采用了從各種生物體中克隆相關(guān)的基因并轉(zhuǎn)入各 種受體細(xì)胞中，然后在受體細(xì)胞中觀察其脂肪酸改變的方法。序列對比的結(jié)果表明，編碼 Λ 12_脂肪酸脫氫酶的核苷酸序列具有共同的機(jī)構(gòu)特性：存在三個組氨酸保守區(qū)，形成四次 跨膜的結(jié)構(gòu)[Kyte et al，1982，J. Mol. Biol. 157:105-132]，這些都是維持脫氫酶活性所必 須的。
[0004] 由于脂肪酸脫氫酶和各種多不飽和脂肪酸在人體健康等方面的重要性，已經(jīng)引起 人們極大的研究興趣。目前，通過文庫篩選、基因組測序、PCR等技術(shù)已從動物、植物、藻類 和低等真核生物等不同來源中分離到許多Λ 12-脂肪酸脫氫酶基因的同源序列，并且證明 具有相應(yīng)的生物學(xué)功能。然而，盡管獲得了很多Λ12-脂肪酸脫氫酶的基因序列，但是在酶 的純化方面存在的技術(shù)困難，目前仍沒有從酶水平揭示其在自然環(huán)境中的生化特性。因此， 只能借助于發(fā)掘更多的不同來源的Λ 12-脂肪酸脫氫酶基因序列，通過基因序列分析來更 深入揭示Λ12-脂肪酸脫氫酶的生物學(xué)功能，并為將來酶的純化和生化特性的揭示以及進(jìn) 一步的應(yīng)用打下基礎(chǔ)。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的是提供一種Λ12-脂肪酸脫氫酶基因，這是從深黃被孢霉 2?<9#/&3)Μ6-22中分離得到，該基因核苷酸序列如SEQ ID N0:1所不或 該核苷酸序列的片段，或與SEQ ID NO :1互補(bǔ)的核苷酸序列，該基因序列長為1173bp (堿 基)，其中1-1173為編碼Λ12-脂肪酸脫氫酶成熟多肽的開放閱讀框；該基因編碼的氨基酸 序列如SEQ ID NO :2所示的多肽或其片段。
[0006] 本發(fā)明另一目的是提供一種含有Λ 12-脂肪酸脫氫酶基因的重組表達(dá)載體，是將 SEQ ID NO :1所示基因直接與不同表達(dá)載體(質(zhì)粒、病毒或運(yùn)載體)連接所構(gòu)建的重組載體。
[0007] 可用本領(lǐng)域的技術(shù)人員熟知的方法來構(gòu)建含編碼從深黃被孢霉M6-22 △ 12_脂肪 酸脫氫酶的核苷酸序列和合適的轉(zhuǎn)錄/翻譯調(diào)控元件的表達(dá)載體。這些方法包括體外重 組DNA技術(shù)、DNA合成技術(shù)、體內(nèi)重組技術(shù)等[Sambroook，et al, Molecular Cloning, a Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory, New York, 1989]。所述的編碼黏 紅酵母YM25079 Λ 12-脂肪酸脫氫酶的核苷酸序列可有效連接到表達(dá)載體的恰當(dāng)啟動子上， 以指導(dǎo)mRNA合成。這些啟動子的代表性例子有：大腸桿菌的Iac或trp啟動子；λ噬菌體 的PL啟動子；真核啟動子包括CMV早期啟動子、HSV胸苷激酶啟動子、早期和晚期SV40啟 動子、反轉(zhuǎn)錄病毒的LTRs和其它一些已知的可控制基因在原核細(xì)胞或真核細(xì)胞或其病毒 中表達(dá)的啟動子。表達(dá)載體還包括翻譯起始用的核糖體結(jié)合位點(diǎn)和轉(zhuǎn)錄終止子等。在載體 中插入增強(qiáng)子序列將會使其在高等真核細(xì)胞中的轉(zhuǎn)錄得到增強(qiáng)。增強(qiáng)子是DNA表達(dá)的順式 作用因子，通常大約有10_300bp，作用于啟動子以增強(qiáng)基因的轉(zhuǎn)錄，如腺病毒增強(qiáng)子。
[0008] 本發(fā)明另一目的是提供一種含有Λ 12-脂肪酸脫氫酶基因或上述重組表達(dá)載體的 宿主細(xì)胞，該細(xì)胞是細(xì)菌細(xì)胞、真菌細(xì)胞、植物細(xì)胞或動物細(xì)胞，或這些宿主細(xì)胞的后代，宿 主細(xì)胞的代表性例子有：大腸桿菌；真菌細(xì)胞或酵母；植物細(xì)胞如油菜、煙草、大豆；昆蟲細(xì) 胞如果蠅S2或Sf9 ;動物細(xì)胞如CH0、COS或Bowes黑素瘤細(xì)胞等。
[0009] 用本發(fā)明所述的核苷酸序列或含有核苷酸序列的重組載體優(yōu)化宿主細(xì)胞可用本 領(lǐng)域的技術(shù)人員熟知的方法進(jìn)行。當(dāng)宿主為原核生物如大腸桿菌時，能吸收DNA的感受態(tài) 細(xì)胞可在指數(shù)生長期手機(jī)菌體，用CaCl 2、電穿孔等方法進(jìn)行。當(dāng)宿主是真核生物，可選用 DNA轉(zhuǎn)染法。顯微注射、電穿孔、脂質(zhì)體包裝等方法。
[0010] 本發(fā)明的核苷酸序列是DNA形式的，DNA形式包括CDNA、基因組DNA或人工合成的 DNA，DNA可以是單鏈的或是雙鏈的，編碼成熟多肽的編碼區(qū)序列可以與SEQ ID N0:2所示 的編碼區(qū)序列相同或是簡并的變異體。
[0011] 本發(fā)明還包括編碼從深黃被孢霉M6-22獲得的Λ 12-脂肪酸脫氫酶的核苷酸序列 的片段。如本發(fā)明所用，術(shù)語"片段"是指能編碼基本上保持本發(fā)明天然的相同的生物學(xué)功 能或活性的多肽的核苷酸序列。通過本文的闡述，這樣的片段、被認(rèn)為在本領(lǐng)域技術(shù)人員的 知識范圍之內(nèi)。
[0012] 本發(fā)明中的多肽和核苷酸序列優(yōu)選以分離的形式提供，更佳地被純化至均質(zhì)。
[0013] 本發(fā)明中特異核苷酸序列能用多種方法獲得。例如，用本領(lǐng)域熟知的雜交技術(shù)分 離核苷酸序列。這些技術(shù)包括但不局限于：（1)用探針與基因組或CDNA文庫雜交以檢出同 源的核苷酸序列；和（2)表達(dá)文庫的抗性篩選以檢出具有共同結(jié)構(gòu)特征的克隆的核苷酸序 列片段。
[0014] 本發(fā)明的DNA片段序列也能用下列方法獲得：（1)從基因組DNA分離雙鏈DNA序 列；（2)化學(xué)合成DNA序列以獲得所述多肽的雙鏈DNA。
[0015] 上述提到的方法中，分離基因組DNA最不常用。DNA序列的直接化學(xué)合成法是經(jīng)常 選用的方法。更經(jīng)常選用的方法是DNA序列的分離。分離感興趣的cDNA的標(biāo)準(zhǔn)方法是從 高表達(dá)該基因的供體細(xì)胞分離mRNA并進(jìn)行轉(zhuǎn)錄，形成質(zhì)粒或噬菌體cDNA文庫。提取mRNA 的方法已有多種成熟的技術(shù)，用試劑盒也可從商業(yè)途徑獲得。而構(gòu)建cDNA文庫也是通常的 方法。當(dāng)結(jié)合聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)（PCR)時，即使極少的表達(dá)產(chǎn)物也能克隆。
[0016] 本發(fā)明另一目的是將λ 12-脂肪酸脫氫酶基因應(yīng)用在生產(chǎn)不飽和脂肪酸中。
[0017] 本發(fā)明提供的核苷酸序列是一種高效的特異性的脂肪酸脫氫酶，可以將其與載體 連接后轉(zhuǎn)化至微生物細(xì)胞體內(nèi)生產(chǎn)不飽和脂肪酸，具有產(chǎn)物特異性高、生產(chǎn)周期短、生產(chǎn)不 受場地、氣候、季節(jié)的影響及利用不同的菌種和培養(yǎng)基適合開發(fā)功能油脂等優(yōu)點(diǎn)，可以用于 商業(yè)化生產(chǎn)，直接改善油脂品質(zhì)，更加具有實(shí)際應(yīng)用價值。本發(fā)明應(yīng)用基因工程技術(shù)構(gòu)建特 異性生產(chǎn)多不飽和脂肪酸的轉(zhuǎn)基因酵母細(xì)胞生產(chǎn)不飽和脂肪酸，具有操作簡單、成本低、可 行性商等優(yōu)點(diǎn)，為新一代轉(zhuǎn)基因脂肪酸廣品的品質(zhì)改良奠定基礎(chǔ)。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0018] 圖1為本發(fā)明的深黃被孢霉Μ6-22 Λ 12-脂肪酸脫氫酶和卷枝毛霉(ifocor Λ12-脂肪酸脫氫酶的氨基酸序列同源性比較示意圖； 圖2為本發(fā)明所構(gòu)建的釀酒酵母表達(dá)載體pY3CID12-2結(jié)構(gòu)示意圖； 圖3為本發(fā)明含pYES3/CT空載體的轉(zhuǎn)基因酵母的氣相色譜圖； 圖4為本發(fā)明含重組質(zhì)粒pY3MID12-2的轉(zhuǎn)基因酵母的氣相色譜圖。

【具體實(shí)施方式】
[0019] 下面通過實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)說明，但本發(fā)明的內(nèi)容并不局限于此，本 實(shí)施例中方法如無特殊說明的均按常規(guī)方法操作，所用試劑如無特殊說明的采用常規(guī)試劑 或按常規(guī)方法配置的試劑。
[0020] 實(shí)施例1 :從深黃被孢霉M6-22中分離△ 12_脂肪酸脫氫酶的核苷酸序列 將深黃被孢霉M6-22接種到PDA液體培養(yǎng)基中，28 °C培養(yǎng)48h，收集菌絲體，用液氮研磨 成菌絲粉，然后采用真核細(xì)胞總RNA提取試劑盒（Promega公司產(chǎn)品)提取深黃被孢霉M6-22 的總RNA，再利用反轉(zhuǎn)錄試劑盒（fermentas公司產(chǎn)品）反轉(zhuǎn)錄合成第一條cDNA,以該cDNA 為模板，利用特異性引物(引物1和引物2)進(jìn)行PCR反應(yīng)，反應(yīng)所用組份和擴(kuò)增條件如下： 引物 I :MID12-2Fl:5'-ATGGCAACCAGACGAAACATTGGCTCA-3' 引物 2 :CID12-2Rl:5'-CTAGTTTTTCCAGAACACAACATCTCCT-3' ; PCR擴(kuò)增體系（25 μυ組成如下： IOXEx Taq Buffer 2. 5 M-L dNTP (2.5 Mmol/L) 2 μ? 模板 3 μ? MID12-2F1 (10 Mmol/L) 2 μ? CID12-2R1 (10 Mmol/L) 2 μ? Ex Taq DNA polymerase (5U/M-L) 2 M-L 無菌ddH20 補(bǔ)足至25 PL 擴(kuò)增條件：94°C變性 4min，再用 94°C lmin、58°C I. 5min、72°C 2min 進(jìn)行 30 個循環(huán)， 最后72°C IOmin ;瓊脂糖凝膠電泳檢測結(jié)果顯示，擴(kuò)增得到大小約1200bp的片段，用多功 能DNA純化回收試劑盒（離心柱型）（北京百泰克生物技術(shù)有限公司）回收，把回收片段亞 克隆到PMD-18T (TaKaRa公司產(chǎn)品沖，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到用CaCl2法處理的大腸桿菌DH5 α， 在含氨芐青霉素（l〇〇ug/ml)的LB固體平板上過夜培養(yǎng)，挑取平板上生長的白色菌落，通過 菌落PCR驗(yàn)證陽性克隆。將驗(yàn)證陽性的克隆子接入LB液體培養(yǎng)基(含lOOug/ml氨芐青霉 素）中過夜培養(yǎng)，用高純質(zhì)粒小量制備試劑盒(離心柱型）（北京百泰克生物技術(shù)有限公司） 提取質(zhì)粒，經(jīng)測序(北京三博志遠(yuǎn)北京三博遠(yuǎn)志生物技術(shù)有限責(zé)任公司），結(jié)果顯示所擴(kuò)增 得到的片段大小為1173bp，如SEQ ID NO: 1所示的核苷酸序列。
[0021] 實(shí)施例2 :所分離核苷酸序列的同源性搜索 將推測的Λ 12_脂肪酸脫氫酶的氨基酸序列在Genbank上進(jìn)行同源相似性搜 索，所得同源序列大部分為編碼Λ 12_脂肪酸脫氫酶的序列，其中與卷枝毛霉Ofomr circifleWoiofes) Δ12-脂肪酸脫氫酶氨基酸同源性最高，相同性為68% (圖1)。圖1顯 示本發(fā)明的深黃被孢霉M6-22中分離Λ12-脂肪酸脫氫酶和卷枝毛霉Λ12-脂肪酸脫氫 酶（GenBank: BAB69056. 1)的氨基酸序列同源性比較圖，MID12-2為本發(fā)明的深黃被孢霉 M6-22 Λ 12-脂肪酸脫氫酶，MCD12為卷枝毛霉Λ 12-脂肪酸脫氫酶，Consensus :兩序列之間 相同的氨基酸序列，這說明本發(fā)明新的核苷酸序列所編碼的酶具有潛在的Λ12-脂肪酸脫 氫酶的功能。
[0022] 實(shí)施例3:釀酒酵母重組表達(dá)載體的構(gòu)建 根據(jù)SEQ ID N0:1所示編碼區(qū)序列，設(shè)計(jì)出一對基因特異性擴(kuò)增引物（引物3和引物4) 分離其潛在的開放閱讀框序列： 引物 3 ：MID12-2F2:5'-ATTGAATTCATGGCAACCAGACGAAACATT-3' 引物 4 ：CID12-2R2:5' -TAGAATTCCTAGTTTTTCCAGAACACAACATCT-3' 此兩個引物的5 '端下劃線部分分別含有/Ziz7i/ III和通〇 I酶切位點(diǎn)，所用的擴(kuò)增條件 和反應(yīng)組分和以cDNA為模板的PCR反應(yīng)相同，擴(kuò)增產(chǎn)物的測序結(jié)果顯示和SEQ ID N0:1所 示l-1173bp的序列一致。然后取25ulPCR產(chǎn)物和10ulpYES3/CT分別進(jìn)行雙酶切，回收酶 切大片段，并用T4連接酶在16度連接4h，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌HD5 α，通過質(zhì)粒提取和 PCR篩選陽性克隆，并進(jìn)行測序鑒定。質(zhì)粒構(gòu)建結(jié)果見圖2,所構(gòu)建的含有Λ 12-脂肪酸脫氫 酶基因的酵母表達(dá)命名為PY3MID12-2 ;該質(zhì)粒是由pYES3/CT (Invitrogen公司)和引物3、 引物4的PCR產(chǎn)物構(gòu)建而成。質(zhì)粒和PCR產(chǎn)物分別經(jīng)fee I和feoR I雙酶切后，電泳回收 純化，經(jīng)T4 DNA連接酶連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a，篩選鑒定出重組質(zhì)粒，命名為 PY3MID12-2。
[0023] 實(shí)施例4 :重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化釀酒酵母細(xì)胞 挑取釀酒酵母菌株INVSCl單菌落于5ml YEH)液體培養(yǎng)基中，30°C搖床過夜培養(yǎng)，按1% 的接種量轉(zhuǎn)接于IOOml的YEH)液體培養(yǎng)基中，30°C搖床搖至0D600于1. 3-1. 5之間。4°C、 4000g離心5min收集沉淀細(xì)胞，用IOOml預(yù)冷的無菌CldH2O洗滌細(xì)胞，4°C、4000g離心5min 收集沉淀細(xì)胞，再用50ml預(yù)冷的無菌ddH20洗滌細(xì)胞，4°C、4000g離心5min收集沉淀細(xì)胞， 用20ml預(yù)冷的IM山梨醇洗滌細(xì)胞，4°C、4000g離心5min收集沉淀細(xì)胞，細(xì)胞用0. 5ml的預(yù) 冷的IM山梨醇懸浮，每80ul分裝于I. 5ml預(yù)冷的離心管中。取Iug線性化的重組表達(dá)載 體PY3MID12-2加入80ul的感受態(tài)細(xì)胞中，混勻后轉(zhuǎn)至0. 2cm的點(diǎn)轉(zhuǎn)杯中，冰上孵育5min， 轉(zhuǎn)入電轉(zhuǎn)儀中電擊（電擊條件：電壓I. 5kV，電容25uF，電阻200 Ω，電擊時間為4-10ms)。電 擊完畢后立即加入Iml IM預(yù)冷的山梨醇并吹勻，30°C孵育2h后涂布于SC-Trp (無色氨酸） 選擇培養(yǎng)基上，置30°C培養(yǎng)3-4天。
[0024] 實(shí)施例5 :酵母工程菌的誘導(dǎo)表達(dá) 挑取SC-Trp(無色氨酸)選擇培養(yǎng)基平板上出現(xiàn)的陽性轉(zhuǎn)化子，接種于15ml SC-Trp(無 色氨酸）選擇培養(yǎng)基(含2%葡萄糖)，30°C搖菌培養(yǎng)24h，轉(zhuǎn)接于IOOml的SC-Trp (含2%的 半乳糖和1%的棉子糖）中使其初始0D600為0. 4,30°C繼續(xù)培養(yǎng)72h，4000g離心收集菌體， 用去離子水洗滌三次，50°C烘干，研碎，取IOOmg加入5ml 5%的KOH-CH3OH溶液中，70°C反應(yīng) 3h，反應(yīng)結(jié)束后冷卻至室溫，用6M的鹽酸調(diào)節(jié)溶液的pH值到2. 0,加入4ml 14%BF3-CH30H， 70°C反應(yīng)I. 5h，合成脂肪酸甲酯；再加入IOml飽和的NaCl溶液，劇烈震蕩混勻，轉(zhuǎn)移至分 液漏斗中，用8ml 1:4的氯仿：環(huán)己烷抽提兩次，合并兩次的提取液，加入適量的無水Na2SO4 干燥提取液，靜置lh，去掉Na2SO4，把含有脂肪酸甲酯的上清用氮?dú)獯蹈?，?00ul的正己烷 回溶樣品，最后用〇. 45um微孔濾膜過濾。
[0025] 實(shí)施例6:脂肪酸氣相色譜分析 采用氣相色譜分析儀器分析轉(zhuǎn)基因酵母工程菌的誘導(dǎo)表達(dá)情況，氣相色譜分析儀器為 島津GC-7A，柱子：彈性石英毛細(xì)管柱，0.32 X 30m，固相支持物：聚二乙二醇丁二酸酯鍍膜 物：聚酰亞胺。載氣：N2,線速10cm/s。分流比：100:1，氣化室溫度：250°C，柱溫：180°C，尾 吹：50ml/min，檢測器：氫火焰離子化檢測器。把上述制備的脂肪酸甲酯化樣品進(jìn)行GC分 析，上樣量為Iul;分析軟件：Anstar。
[0026] 色譜分析結(jié)果見圖3、4,圖3顯示含pYES3/CT空載體的轉(zhuǎn)基因酵母，圖4顯示含重 組質(zhì)粒PY3MID12-2的轉(zhuǎn)基因酵母；與圖3相比，圖4中保留時間為13. 7min對應(yīng)的峰與亞 油酸甲酯標(biāo)準(zhǔn)品一致，即為深黃被孢霉M6-22 Λ 12-脂肪酸脫氫酶催化油酸產(chǎn)生的亞油酸。
【權(quán)利要求】
1. 一種Λ12-脂肪酸脫氫酶基因，其特征在于：其核苷酸序列如SEQ ID NO :1所示，編 碼如SEQ ID NO : 2所示的氨基酸序列。
2. -種宿主細(xì)胞，所述宿主細(xì)胞含有權(quán)利要求1所述的Λ 12-脂肪酸脫氫酶基因。
3. 權(quán)利要求1所述Λ 12-脂肪酸脫氫酶基因在生產(chǎn)不飽和脂肪酸中的應(yīng)用。
【文檔編號】C12R1/645GK104212819SQ201410360401
【公開日】2014年12月17日 申請日期:2014年7月28日 優(yōu)先權(quán)日:2014年7月28日
【發(fā)明者】張琦, 楊昭杰, 許振寧, 楊曉霞, 魏云林, 林連兵, 季秀玲 申請人:昆明理工大學(xué)