一種適合微量櫻桃葉片dna高效提取方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種適合微量櫻桃葉片DNA高效提取方法，屬于分子生物學(xué)【技術(shù)領(lǐng)域】，該方法為：取微量經(jīng)過變色硅膠充分干燥的櫻桃葉片，置于2ml離心管中，用末端經(jīng)過打磨的直徑0.6cm的玻璃棒快速搗碎葉片呈粉末狀，然后通過緩沖液洗滌、裂解、抽提、沉淀和檢測(cè)等步驟，最后得到高濃度和純度的DNA。本發(fā)明取代了傳統(tǒng)DNA提取方法中普遍使用的液氮研磨，通過此方法在不使用液氮的情況下依然能夠得到高質(zhì)量的DNA，而且還可以防止材料在液氮研磨過程中的褐化。該方法操作簡(jiǎn)單，實(shí)用方便，效率高，尤其是針對(duì)微量珍貴材料的DNA提取具有重要作用。
【專利說明】一種適合微量櫻桃葉片DNA高效提取方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于分子生物學(xué)【技術(shù)領(lǐng)域】，具體為一種適合微量櫻桃葉片DNA高效提取方 法。

【背景技術(shù)】
[0002] 獲得高質(zhì)量（高濃度、高純度、高完整性）的DNA是分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)最基礎(chǔ)也是最 關(guān)鍵的第一步，目前，已經(jīng)開發(fā)了多種方法，也成功地從植物葉片、愈傷組織、組培苗、果實(shí)、 韌皮部等組織器官中提取出DNA。但是對(duì)于一些稀缺資源或材料，如植物殘存的微量材料， 分子標(biāo)記輔助育種中后代出生不久的小苗、木本植物雜交F1代苗木早期植株等研究材料 來說均無法獲得大量的植物組織材料用于DNA的提取，而導(dǎo)致研究效率較低，研究周期長(zhǎng)， 而且還容易造成研究材料的死亡和丟失。
[0003] 櫻桃為典型的多年生木本果樹作物，其雜交F1代的生長(zhǎng)速率極慢，而且當(dāng)年采收 的種子一般要到第二年才能生長(zhǎng)成苗，這些生物學(xué)特性極大地阻礙了其在連鎖遺傳圖譜構(gòu) 建中作圖群體DNA的早期獲得，以及有些育種相關(guān)性狀的分子生物學(xué)早期鑒定，而延緩了 研究進(jìn)程。最重要的是有些小苗容易在生長(zhǎng)過程中死亡而導(dǎo)致研究材料的丟失。因此如何 在植株早期獲得高質(zhì)量的DAN對(duì)于大多數(shù)材料的分子生物學(xué)研究具有重要意義。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 為了解決櫻桃在苗期葉片及其它組織材料少而無法獲得高質(zhì)量的基因組DNA用 于后續(xù)研究。本發(fā)明提供一種適合微量櫻桃葉片DNA高效提取方法。采用本發(fā)明所述的方 法可以在櫻桃幼苗期或者殘存微量葉片中獲得較多高質(zhì)量基因組DNA，而且還省略了傳統(tǒng) 方法中使用的液氮研磨，降低了提取成本，較少了提取過程中組織材料的氧化。該方法操作 簡(jiǎn)單、實(shí)用方便，效率高，尤其是針對(duì)微量珍貴材料的DNA提取具有重要作用。
[0005] 其技術(shù)方案為：
[0006] 一種適合微量櫻桃葉片DNA高效提取方法，包括以下步驟：
[0007] 1)材料準(zhǔn)備：采集新鮮櫻桃幼葉片置于封口袋中，按照1 : 20-1 : 50的比例加 入變色硅膠，并充分混勻，直到葉片完全干燥。
[0008] 2)取充分干燥的櫻桃葉片0.01-0. 03g置于2ml離心管中，用直徑0.6cm前段打磨 成平滑卵頭狀的玻璃棒快速搗碎干燥葉片至呈粉末狀。
[0009] 3)加入1ml緩沖液1和10 μ 1 β -巰基乙醇，充分混合后在在常溫下5000rpm離心 3min，棄上清，收集沉淀。
[0010] 4)在沉淀中加入lml65°C預(yù)熱的3 %的CTAB緩沖液和10 μ 1 β -巰基乙醇，65°C水 浴lh，期間每隔5-10min顛倒離心管以使液體混勻，然后26?下12500rpm離心lOmin ;
[0011] 5)取上清液轉(zhuǎn)入新的2. 0ml的離心管中，加入等體積的氯仿，輕搖萃取，在5°C下 12500rpm 離心 lOmin ;
[0012] 6)上清液轉(zhuǎn)入新的2. Oml離心管中，重復(fù)步驟5);
[0013] 7)取上清液約600 μ 1轉(zhuǎn)入新的1. 5ml離心管中，加入2倍體積經(jīng)-20°c預(yù)冷的無 水乙醇和1/10體積的3mol/L的醋酸鈉，顛倒混勻-20放置30min，llOOOrpm離心15min，棄 上清，收集沉淀；
[0014] 8)在DNA沉淀中加入75%乙醇800 μ 1，輕搖并放置5min，倒掉乙醇，如此清洗兩 次，再用無水乙醇清洗一次，置于通風(fēng)處過夜吹干；
[0015] 9)DNA沉淀用50μ 1 TE溶解，然后加入1μ llOng/μ 1的RNase A，常溫過夜后置 于-20°C冰箱保存?zhèn)溆茫?br> [0016] 10)取2μ1溶解的DNA溶液，經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，并在Eppend Orf Biophotomete型核酸蛋白質(zhì)分析儀上檢測(cè)260nm、280nm處的吸收值和DNA的濃度，并根據(jù) 0D 260/0D280值來判斷DNA的純度。
[0017] 步驟1)中所述的櫻桃新鮮葉片為無病蟲害的葉片，且以幼嫩葉片最佳，對(duì)于較少 的葉片材料可以裝在通透性較好的茶包中然后置于分口袋中加相應(yīng)比例的變色硅膠，干燥 材料應(yīng)輕拿輕放，防止干燥葉片碎裂后無法從變色硅膠中分離出來。
[0018] 步驟2)中所述的玻璃棒應(yīng)事先打磨好，其前端或兩頭需打磨成平滑的卵頭狀，以 便更好的搗碎葉片。
[0019] 步驟3)中所述的緩沖液1為lmol/L氯化鈉；0. lmol/L Tris-HCl PH8. 0 ; 0· 02mol/L EDTA ΡΗ8· 0 ;0· 4mol/L 葡萄糖。
[0020] 步驟 4)中所述的 CTAB 緩沖液為 1. 5mol/lNaCl ;0· lmol/L Tris-Hcl ΡΗ8· 0 ; 0. 02mol/L EDTA PH8. 0 ；2% PVP ；3% CTAB〇
[0021] 步驟4)中加入CTAB裂解液后應(yīng)及時(shí)充分搖勻，盡可能的呈懸浮液，水浴過程中隔 3-5min上下輕搖一次，保證裂解充分。
[0022] 步驟7)中沉淀所有無水乙醇最少要加2倍體積，若沉淀液顏色較深的話適量多加 醋酸鈉（20-100ul)可有效去除顏色。
[0023] 步驟8)中洗滌沉淀的75%乙醇至少要800 μ 1，洗滌次數(shù)可根據(jù)情況增加，最后用 無水乙醇洗滌吹干。
[0024] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果為：
[0025] 本發(fā)明旨在克服對(duì)于幼苗生長(zhǎng)初期無法獲得足夠的組織材料而無法提取基因組 DNA的難題。采用本發(fā)明所述的提取方法流程能從微量葉片材料（O.Olg左右）中高效提取 基因組DNA。所得到的DNA純度高（0D260/0D280 = L 77-L 94 ;0D260/0D230 = L 95-2. 11)、 完整性和流動(dòng)性好（可迅速溶解于水或者TE，溶解后不會(huì)析出沉淀，溶液不粘稠，1. 0%瓊 脂糖凝膠電泳檢測(cè)片段大于20Kb)。
[0026] 1、本發(fā)明所述方法以干燥葉片為提取材料，相較于傳統(tǒng)用新鮮或冰凍的幼嫩葉片 來說，該方法對(duì)提取材料的要求寬松，可以適合于野外或遠(yuǎn)距離材料的提取，而且避免了幼 嫩材料在液氮研磨過程中被氧化而變褐，獲得的基因組DNA能夠滿足后續(xù)實(shí)驗(yàn)要求。
[0027] 2、本發(fā)明方法在葉片組織破碎方法上替代了原有的液氮研磨法，可以在只有微量 葉片材料的情況下直接在離心管中破碎材料，即簡(jiǎn)化了 DNA提取時(shí)葉片組織的破碎方法， 避免使用液氮，又可以實(shí)現(xiàn)在微量葉片材料的情況下高效地提取基因組DNA。相對(duì)于傳統(tǒng)的 提取方法既可以節(jié)省葉片材料，簡(jiǎn)化試驗(yàn)步驟，又可以降低提取成本。
[0028] 3、采用本發(fā)明的方法可以縮短提取時(shí)間至2. 5小時(shí)，實(shí)驗(yàn)流程相對(duì)簡(jiǎn)化。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0029] 圖1是用本發(fā)明的方法提取的櫻桃的總基因組DNA，經(jīng)過1. 0%瓊脂糖凝膠電泳檢 測(cè)結(jié)果，注：瓊脂糖凝膠濃度為1. 〇%，Ml為Markerl，片段從小到大依次為546bp、2027bp、 2322bp、4361bp、9416bp、23130bp，M2 為 Markerl，片段從小到大依次為 100bp、250bp、 500bp、750bp、1000bp、2000bp。

【具體實(shí)施方式】
[0030] 下面結(jié)合附圖和【具體實(shí)施方式】對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案作進(jìn)一步說明。
[0031] 一種適合微量櫻桃葉片DNA高效提取方法，包括以下步驟：
[0032] 1)在野外或田間分別采集新鮮中國(guó)櫻桃（河南洛陽(yáng)）、野生中國(guó)櫻桃（四川北 川）、歐洲甜櫻桃（美早，四川漢源）、以及毛櫻桃（甘肅平?jīng)觯┤~片各0.5-1. 0g，幼葉片置 于封口袋中，加入10_50g變色硅膠，并充分混勻，直到葉片完全干燥。
[0033] 2)取充分干燥的櫻桃葉片0.01-0. 03g置于2ml離心管中，用直徑0.6cm前段打磨 成平滑卵頭狀的玻璃棒快速搗碎干燥葉片至呈粉末狀。
[0034] 3)加入1ml緩沖液1和10 μ 1 β -巰基乙醇，充分混合后在在常溫下5000rpm離心 3min，棄上清，收集沉淀。
[0035] 4)在沉淀中加入lml65°C預(yù)熱的3 %的CTAB緩沖液和10 μ 1 β -巰基乙醇，65°C水 浴lh，期間每隔5-10min顛倒離心管以使液體混勻，然后26?下12500rpm離心lOmin ;
[0036] 5)取上清液轉(zhuǎn)入新的2. 0ml的離心管中，加入等體積的氯仿，輕搖萃取，在5°C下 12500rpm 離心 lOmin ;
[0037] 6)上清液轉(zhuǎn)入新的2. 0ml離心管中，重復(fù)步驟5);
[0038] 7)取上清液約600 μ 1轉(zhuǎn)入新的1. 5ml離心管中，加入2倍體積經(jīng)-20°C預(yù)冷的無 水乙醇和1/10體積的3mol/L的醋酸鈉，顛倒混勻-20放置30min，llOOOrpm離心15min，棄 上清，收集沉淀；
[0039] 8)在DNA沉淀中加入75%乙醇800 μ 1，輕搖并放置5min，倒掉乙醇，如此清洗兩 次，再用無水乙醇清洗一次，置于通風(fēng)處過夜吹干；
[0040] 9)DNA沉淀用5〇μ 1 TE溶解，然后加入1μ liong/μ 1的RNase A，常溫過夜后置 于-20°C冰箱保存?zhèn)溆茫?br> [0041] 10)取2 μ 1溶解的DNA溶液，經(jīng)1. 0 %瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)（圖1，從左往右依次 為中國(guó)櫻桃、歐洲甜櫻桃、野生中國(guó)櫻桃、毛櫻桃各2個(gè)）。
[0042] 11)取2 μ 1溶解的DNA溶液稀釋50倍后在Eppendorf Biophotomete型核酸蛋白 質(zhì)分析儀上檢測(cè)260nm、280nm處的吸收值和DNA的濃度，并根據(jù)0D 260/0D 280及0D 260/ 0D230值來判斷DNA的純度。
[0043] 表1供試材料的葉片質(zhì)量提取的DNA檢測(cè)信息
[0044]

【權(quán)利要求】
1. 一種適合微量櫻桃葉片DNA高效提取方法，其特征在于，包括以下步驟： 1) 材料準(zhǔn)備：采集新鮮櫻桃幼葉片置于封口袋中，按照1 : 20-1 : 50的比例加入變 色硅膠，并充分混勻，直到葉片完全干燥； 2) 取充分干燥的櫻桃葉片0. 01-0. 03g置于2ml離心管中，用直徑0. 6cm前段打磨成平 滑卵頭狀的玻璃棒快速搗碎干燥葉片至呈粉末狀； 3) 加入lml緩沖液1和10μ 1 β -巰基乙醇，充分混合后在在常溫下5000rpm離心 3min，棄上清，收集沉淀； 4) 在沉淀中加入lml65°C預(yù)熱的3%的CTAB緩沖液和10μ 1 β -巰基乙醇，65°C水浴 lh，期間每隔5-10min顛倒離心管以使液體混勻，然后26°C下12500rpm離心lOmin ; 5) 取上清液轉(zhuǎn)入新的2.0ml的離心管中，加入等體積的氯仿，輕搖萃取，在5°C下 12500rpm 離心 lOmin ; 6) 上清液轉(zhuǎn)入新的2. 0ml離心管中，重復(fù)步驟5); 7) 取上清液約600 μ 1轉(zhuǎn)入新的1. 5ml離心管中，加入2倍體積經(jīng)-20°C預(yù)冷的無水乙 醇和1/10體積的3mol/L的醋酸鈉，顛倒混勻-20放置30min，llOOOrpm離心15min，棄上 清，收集沉淀； 8) 在DNA沉淀中加入75%乙醇800 μ 1，輕搖并放置5min，倒掉乙醇，如此清洗兩次，再 用無水乙醇清洗一次，置于通風(fēng)處過夜吹干； 9. DNA沉淀用50μ1 TE溶解，然后加入lyllOng/yl的RNase A，常溫過夜后置 于-20°C冰箱保存?zhèn)溆茫? 10) 取2 μ 1溶解的DNA溶液，經(jīng)1. 0 %瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，并在Eppendorf Biophotomete型核酸蛋白質(zhì)分析儀上檢測(cè)260nm、280nm處的吸收值和DNA的濃度，并根據(jù) OD 260/0D280值來判斷DNA的純度。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種適合微量櫻桃葉片DNA高效提取方法，其特征在于，步 驟1)中所述的櫻桃新鮮葉片為無病蟲害的葉片，且以幼嫩葉片最佳，對(duì)于較少的葉片材料 可以裝在通透性較好的茶包中然后置于分口袋中加相應(yīng)比例的變色硅膠，干燥材料應(yīng)輕拿 輕放，防止干燥葉片碎裂后無法從變色硅膠中分離出來。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種適合微量櫻桃葉片DNA高效提取方法，其特征在于，步 驟2)中所述的玻璃棒應(yīng)事先打磨好，其前端或兩頭需打磨成平滑的卵頭狀，以便更好的搗 碎葉片。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種適合微量櫻桃葉片DNA高效提取方法，其特征在于，步 驟 3)中所述的緩沖液 1 為 lmol/L 氯化鈉；0. lmol/L Tris-HCl PH8. 0 ;0. 02mol/L EDTA PH8. 0 ;0. 4mol/L 葡萄糖。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種適合微量櫻桃葉片DNA高效提取方法，其特征在于，步 驟 4)中所述的 CTAB 緩沖液為 1. 5mol/lNaCl ;0· lmol/L Tris-Hcl PH8. 0 ;0· 02mol/L EDTA ΡΗ8· 0 ;2% PVP ;3% CTAB。
【文檔編號(hào)】C12N15/10GK104152435SQ201410360484
【公開日】2014年11月19日 申請(qǐng)日期:2014年7月24日 優(yōu)先權(quán)日:2014年7月24日
【發(fā)明者】王小蓉, 陳濤, 湯浩茹, 張靜, 羅婭, 黃智林, 劉胤 申請(qǐng)人:四川農(nóng)業(yè)大學(xué)