一種兔臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的制備方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種兔臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的制備方法，選用兔臍帶為原材料，包括以下步驟，兔臍帶組織的清洗、兔臍帶組織的消化、細(xì)胞接種、傳代培養(yǎng)、即時使用或冷凍保存?zhèn)溆谩０凑毡景l(fā)明獲得的兔臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞經(jīng)表面抗原檢測及多向分化鑒定，符合間充質(zhì)干細(xì)胞產(chǎn)品合格標(biāo)準(zhǔn)，具有較高的增殖及分化潛力。按照本發(fā)明獲得的兔臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞為以兔為實(shí)驗(yàn)動物的干細(xì)胞相關(guān)應(yīng)用研究提供了一種新的同種異體移植的種子細(xì)胞，極大程度上保證了臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的低免疫原性，極大地豐富了現(xiàn)有的種子細(xì)胞庫。
【專利說明】一種兔臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的制備方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及從臍帶中分離、擴(kuò)增、鑒定間充質(zhì)干細(xì)胞的方法，尤其涉及了一種兔臍 帶間充質(zhì)干細(xì)胞的制備方法。

【背景技術(shù)】
[0002] 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs)因細(xì)胞數(shù)量 及增殖分化潛能隨供體年齡的增加而下降，病毒感染率較高，異體移植可能引起免疫反應(yīng)， 以及采集需行有創(chuàng)操作，帶來新的傷害等缺點(diǎn)，其應(yīng)用受到一定限制。而從生產(chǎn)"廢棄物" 臍帶中提取的臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞（umbilical cord mesenchymal stem cells, UCMSCs)因 其成本較低，來源豐富，不會造成新的創(chuàng)傷和痛苦，不涉及倫理問題，具有極強(qiáng)的可塑性，無 致瘤活性和低免疫原性等優(yōu)點(diǎn)，在疾病治療和生物修復(fù)等方面得到廣泛的應(yīng)用。有研究表 明，臍帶中干細(xì)胞含量豐富，平均每厘米臍帶組織中可高達(dá)4X105個，遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于骨髓中的 含量；UCMSCs與BMSCs相比，具有更強(qiáng)的擴(kuò)增能力，并且增殖和分化潛能不會隨著傳代次數(shù) 的增加和機(jī)體年齡的增長而降低。
[0003] 人UCMSCs之所以成為公認(rèn)的極富潛力的種子細(xì)胞，主要源于其多向分化潛能及 低免疫原性等獨(dú)特優(yōu)勢。人UCMSCs的低免疫原性在同種異體移植時已獲公認(rèn)，然而在異種 異體移植時卻存在爭議。已有研究表明，直接將人UCMSCs應(yīng)用于非人物種的體內(nèi)模型，實(shí) 驗(yàn)結(jié)果有時并不理想，其原因可能是種屬間的差異導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)動物對人UCMSCs產(chǎn)生了免疫 反應(yīng)。而這種免疫反應(yīng)恰是干細(xì)胞應(yīng)用研究中需極力避免和排除的干擾因素。因此，同種 異體移植以維持干細(xì)胞的低免疫原性極為重要。
[0004] 盡管人UCMSCs已在多種實(shí)驗(yàn)研究中廣泛應(yīng)用，然而，由于倫理限制，大多數(shù)在 體實(shí)驗(yàn)不可能在人體內(nèi)進(jìn)行，而是以動物作為模型，這種異種異體移植中，非人物種對人 UCMSCs產(chǎn)生的免疫反應(yīng)，嚴(yán)重干擾了實(shí)驗(yàn)結(jié)果，極不利于干細(xì)胞應(yīng)用研究的發(fā)展。
[0005] 兔因其易獲得、價格便宜、容易飼養(yǎng)、可操作性強(qiáng)等優(yōu)勢，是目前最為常見的實(shí)驗(yàn) 動物之一。但目前尚未發(fā)現(xiàn)有關(guān)兔臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞制備的相關(guān)研究。因此，分離、擴(kuò)增、 鑒定兔胳帶間充質(zhì)干細(xì)胞（rabbit umbilical cord mesenchymal stem cells，rUCMSCs) 可有效保證UCMSCs在同種異體移植中的低免疫原性，對于干細(xì)胞應(yīng)用研究的發(fā)展具有極 其重要的意義。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明針對現(xiàn)有技術(shù)中的缺點(diǎn)，提供了一種兔臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的制備方法。
[0007] 為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明通過下述技術(shù)方案得以解決：
[0008] -種兔臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的制備方法，選用兔臍帶為原材料，包括以下步驟，
[0009] A.兔臍帶組織的清洗：在無菌條件下，收集兔臍帶組織，用無菌生理鹽水或無菌 PBS液體沖洗3-5次兔臍帶組織，直至兔臍帶組織內(nèi)無兔血；
[0010] B.兔臍帶組織的消化：將兔臍帶組織放到100ml的無菌燒杯中，用無菌組織剪將 兔臍帶組織剪成1mm3的兔臍帶組織塊后，加入兔臍帶組織塊體積3-4倍的0. 1 %無菌膠原 酶，無菌封裝后，置于37-39°C、體積分?jǐn)?shù)為4. 5-5. 5% C02培養(yǎng)箱中消化，直至兔臍帶組織 塊消化完全；兔臍帶組織塊消化完全后，用含體積分?jǐn)?shù)為10% FBS、100U/ml青霉素和鏈霉 素的L-DMEM培養(yǎng)基中止消化；本發(fā)明中并不剔除臍帶血管，而選擇將所有臍帶組織剪成大 小約1mm 3組織塊進(jìn)行消化，達(dá)到了減少臍帶組織損耗的有益效果，解決了兔臍帶較為細(xì)小、 很難獲取足夠的臍帶的技術(shù)問題。本發(fā)明選用質(zhì)量體積分?jǐn)?shù)為〇. 1 %的II型膠原酶單酶消 化，盡量減小組織塊以縮短消化時間，達(dá)到了避免酶消化過程對細(xì)胞損傷的有益效果。本發(fā) 明未使用1〇〇目細(xì)胞篩過濾，將消化離心后沉淀組織直接接種培養(yǎng)，達(dá)到了降低操作過程 中細(xì)胞損失的有益效果。
[0011] C.細(xì)胞接種：將中止后的混合液置于低溫離心機(jī)內(nèi)離心后去除上清液，保留沉淀 物，用含10% FBS、100U/ml青霉素和鏈霉素的L-DMEM培養(yǎng)基吹勻；將重懸液接種于培養(yǎng) 瓶或培養(yǎng)皿中，靜置于37-39°C、4. 5-5. 5% C02、92-96%飽和濕度的恒溫培箱中培養(yǎng)；培養(yǎng) 24h后全量換液，去除殘存組織和未貼壁細(xì)胞，之后3天換液一次，至細(xì)胞融合達(dá)到80%時， 傳代培養(yǎng)，即時使用或冷凍保存?zhèn)溆?。?jīng)表面抗原檢測及多向分化鑒定，獲得的兔臍帶間充 質(zhì)干細(xì)胞符合間充質(zhì)干細(xì)胞產(chǎn)品合格標(biāo)準(zhǔn)，具有較高的增殖及分化潛力?？煽焖賰龃?，為以 兔為實(shí)驗(yàn)動物的干細(xì)胞相關(guān)應(yīng)用研究提供了一種新的司種異體移植的種子細(xì)胞，極大程度 上保證了臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的低免疫原性，達(dá)到了豐富現(xiàn)有種子細(xì)胞庫的有益效果。培養(yǎng) 24h后全量換液是指：更換含10% FBS、100U/ml青霉素和鏈霉素的L-DMEM培養(yǎng)基溶液。
[0012] 本發(fā)明通過以上方法成功分離、提取出大量的富有活性的兔臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞。 本發(fā)明解決了現(xiàn)有設(shè)計(jì)中兔臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的制備尚無報道的技術(shù)問題。
[0013] 作為優(yōu)選，兔臍帶組織從臍帶沃頓膠、臍帶血管周圍或臍帶血管內(nèi)皮下的任何一 處或多處選取。兔臍帶較為細(xì)小，因此需獲取足夠量的臍帶，本發(fā)明共采集了 12條兔臍帶。 本發(fā)明中，兔臍帶組織可以從臍帶沃頓膠、臍帶血管周圍或臍帶血管內(nèi)皮下中選取，達(dá)到豐 富兔臍帶組織來源的有益效果，解決了現(xiàn)有技術(shù)中兔臍帶細(xì)小、比較難獲取足夠量臍帶的 技術(shù)問題。
[0014] 作為優(yōu)選，步驟A中，在無菌條件下，收集兔臍帶組織，用無菌生理鹽水沖洗3次兔 臍帶組織，直至兔臍帶組織內(nèi)無兔血。本發(fā)明選用無菌生理鹽水沖洗兔臍帶組織，在沖洗 兔血的同時，沒有引入病毒或者雜菌，為后期無菌操作提供了條件。用無菌生理鹽水沖洗3 次，即節(jié)約了試劑、縮短實(shí)驗(yàn)時間和實(shí)驗(yàn)周期，又清洗干凈了兔血。
[0015] 作為優(yōu)選，步驟B中，低溫離心機(jī)內(nèi)以2500rmp的轉(zhuǎn)速離心20分鐘。選用低溫離 心機(jī)，有利于中止消化，避免了在離心過程中繼續(xù)進(jìn)行消化。在2500rmp的轉(zhuǎn)速離心20分 鐘時，在達(dá)到最佳沉降的效果的前提下，不僅可以保證細(xì)胞不會因過度離心而遭到破壞，而 且可以縮短實(shí)驗(yàn)時間、縮短實(shí)驗(yàn)周期、節(jié)約能源。
[0016] 作為優(yōu)選，步驟B中，無菌封裝后，置于37°C、體積分?jǐn)?shù)為5% C02培養(yǎng)箱中消化， 直至兔臍帶組織塊消化完全。培養(yǎng)箱中溫度保持在37°C為防生環(huán)境，可維持酶的最高消化 活性，利于進(jìn)行兔臍帶組織塊的消化。經(jīng)過實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，培養(yǎng)箱中C0 2的體積分?jǐn)?shù)為5%時，兔 臍帶組織塊能夠完全消化，且縮短了完全消化的時間，節(jié)約了實(shí)驗(yàn)時間、縮短了實(shí)驗(yàn)周期。
[0017] 作為優(yōu)選，步驟B中，L-DMEM培養(yǎng)基的用量為5?10ml ; 1ml的L-DMEM培養(yǎng)基中， FBS的用量為0. 05-0. 2ml，青霉素的用量為80-115U，鏈霉素的用量為95-120U。
[0018] 作為優(yōu)選，步驟C中，將重懸液接種于培養(yǎng)瓶或培養(yǎng)皿中，靜置于37°C、5% C02、 95%飽和濕度的恒溫培箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)箱中溫度保持在37°C為防生環(huán)境，適宜細(xì)胞生長，極 利于細(xì)胞貼壁與增殖。經(jīng)過實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，恒溫培箱保持在37°C、5% C02、95%飽和濕度時，細(xì) 胞貼壁時間短，貼壁細(xì)胞成活率高；且在體外成集落樣生長，形態(tài)均一，生長狀態(tài)穩(wěn)定，增殖 速度快。
[0019] 本發(fā)明通過以上方法成功分離、提取出大量的富有活性的兔臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞。 本發(fā)明解決了現(xiàn)有設(shè)計(jì)中兔臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的制備尚無報道的技術(shù)問題。本發(fā)明中并不 剔除臍帶血管，而選擇將所有臍帶組織剪成大小約1_ 3組織塊進(jìn)行消化，達(dá)到了減少臍帶 組織損耗的有益效果，解決了兔臍帶較為細(xì)小、很難獲取足夠的臍帶的技術(shù)問題。本發(fā)明 中，兔臍帶組織可以從臍帶沃頓膠、臍帶血管周圍或臍帶血管內(nèi)皮下中選取，達(dá)到豐富兔臍 帶組織來源的有益效果，解決了現(xiàn)有技術(shù)中兔臍帶細(xì)小、比較難獲取足夠量臍帶的技術(shù)問 題。本發(fā)明選用質(zhì)量體積分?jǐn)?shù)為0.1 %的II型膠原酶單酶消化，盡量減小組織塊以縮短消 化時間，達(dá)到了避免酶消化過程對細(xì)胞損傷的有益效果。
[0020] 本發(fā)明制備的兔臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞貼壁時間短，貼壁細(xì)胞成活率高；在體外成集 落樣生長，形態(tài)均一，生長狀態(tài)穩(wěn)定，增殖速度快；并且經(jīng)表面抗原檢測及多向分化鑒定，獲 得的兔臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞符合間充質(zhì)干細(xì)胞產(chǎn)品合格標(biāo)準(zhǔn)，具有較高的增殖及分化潛力； 可快速凍存，建立干細(xì)胞庫；為以兔為實(shí)驗(yàn)動物的干細(xì)胞相關(guān)應(yīng)用研究提供了一種新的同 種異體移植的種子細(xì)胞，極大程度上保證了臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的低免疫原性，極大地豐富 了現(xiàn)有的種子細(xì)胞庫。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0021] 圖1為兔原代臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞形態(tài)圖，其中，1A為接種12h細(xì)胞形態(tài)圖；1B為接 種24h細(xì)胞形態(tài)圖；1C為培養(yǎng)5d細(xì)胞形態(tài)圖。
[0022] 圖2為兔傳代臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞形態(tài)圖，其中，2A為第4代兔臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞形 態(tài)圖；2B為第10代兔臍帶間充質(zhì)于細(xì)胞形態(tài)圖。
[0023] 圖3為第四代間充質(zhì)干細(xì)胞流式細(xì)胞儀檢測的免疫表型細(xì)胞含量圖。
[0024] 圖4為PCR檢測細(xì)胞表面標(biāo)記mRNA表達(dá)電泳圖，泳道Ι-Marker，泳道2-內(nèi)參 GAPDH，泳道 3-CD73,泳道 4-CD90,泳道 5-CD105,泳道 6-CD34,泳道 7-CD45 ;Marker 片段 大小從下往上依次為：20bp，40bp，60bp，80bp，100bp，120bp，140bp，160bp，180bp，200bp， 300bp,400bp,500bp〇
[0025] 圖5為兔臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞誘導(dǎo)分化為成骨細(xì)胞、成脂細(xì)胞、成軟骨細(xì)胞的免疫 組化染色圖，其中，5A為成骨誘導(dǎo)后茜素紅染色；5B為成脂誘導(dǎo)后油紅0染色；5C為成軟骨 誘導(dǎo)后形態(tài)觀察。
[0026] 圖6A為PCR檢測兔臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞成骨、成脂、成軟骨誘導(dǎo)分化相關(guān)基因表達(dá) 電泳圖，成骨誘導(dǎo)Runx2基因、成脂誘導(dǎo)PPAR γ基因、成軟骨誘導(dǎo)Sox9基因表達(dá)電泳圖。
[0027] 圖6B為PCR檢測兔臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞成骨、成脂、成軟骨誘導(dǎo)分化相關(guān)基因表達(dá) 定量圖，成骨誘導(dǎo)Runx2基因、成脂誘導(dǎo)PPAR γ基因、成軟骨誘導(dǎo)Sox9基因表達(dá)定量圖。

【具體實(shí)施方式】
[0028] 下面結(jié)合附圖與實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)描述。
[0029] 實(shí)施例1
[0030] 一種兔臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的制備方法，選用兔臍帶為原材料，包括以下步驟，
[0031] A.兔臍帶組織采集：取孕21?23d的普通級孕兔，空氣栓塞處死；體積分?jǐn)?shù)為 75%乙醇浸泡消毒10分鐘后，仰臥位固定于清潔的解剖臺上；減去孕兔腹部兔毛，碘伏消 毒孕兔腹部，依次剪開皮膚、皮下組織、肌層、腹膜后，找到狹長子宮，可見有成串胎囊；用無 菌紗布將子宮與腹腔內(nèi)其他器官隔開，從一側(cè)依次剖開胎囊，剪開羊膜，提起胎兔，小心剔 除臍帶周圍羊膜，輕柔擠出臍帶內(nèi)兔血，將臍帶胎盤端和胎兔端離斷，放入無菌等滲生理鹽 水中備用；重復(fù)以上操作，收集足夠量的臍帶；
[0032] B.兔臍帶組織的清洗：在無菌條件下，收集兔臍帶組織，用無菌生理鹽水或無菌 PBS液體沖洗3次兔臍帶組織，直至兔臍帶組織內(nèi)無兔血；
[0033] C.兔臍帶組織的消化：將兔臍帶組織放到100ml的無菌燒杯中，用無菌組織剪將 兔臍帶組織剪成1mm3的兔臍帶組織塊后，加入兔臍帶組織塊體積3倍的0. 1 %無菌膠原酶， 無菌封裝后，置于37°C、體積分?jǐn)?shù)為4. 5% C02培養(yǎng)箱中消化，直至兔臍帶組織塊消化完全； 兔臍帶組織塊消化完全后，用含體積分?jǐn)?shù)為10% FBS、100U/ml青霉素和鏈霉素的L-DMEM培 養(yǎng)基中止消化；
[0034] D.細(xì)胞接種：將中止后的混合液置于低溫離心機(jī)內(nèi)離心后去除上清液，保留沉淀 物，用含10% FBS、100U/ml青霉素和鏈霉素的L-DMEM培養(yǎng)基吹勻；將重懸液接種于培養(yǎng)瓶 或培養(yǎng)皿中，靜置于37°C、4. 5% C02、92%飽和濕度的恒溫培箱中培養(yǎng)；培養(yǎng)24h后全量換 液，去除殘存組織和未貼壁細(xì)胞，之后3天換液一次，至細(xì)胞融合達(dá)到80%時，傳代培養(yǎng)，即 時使用或冷凍保存?zhèn)溆谩?br> [0035] 兔臍帶組織從臍帶沃頓膠、臍帶血管周圍或臍帶血管內(nèi)皮下的任何一處或多處選 取。
[0036] 步驟B中，在無菌條件下，收集兔臍帶組織，用無菌生理鹽水沖洗3次兔臍帶組織， 直至兔臍帶組織內(nèi)無兔血。
[0037] 步驟B中，L-DMEM培養(yǎng)基的用量為5ml ; 1ml的L-DMEM培養(yǎng)基中，F(xiàn)BS的用量為 0. lml，青霉素的用量為100U，鏈霉素的用量為100U。
[0038] 步驟C中，低溫離心機(jī)內(nèi)以2500rmp的轉(zhuǎn)速離心20分鐘。
[0039] 對于按照本發(fā)明上述方法制備的兔臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞，按照"國際細(xì)胞療法協(xié) 會"（ISCT)制定的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行鑒定，表現(xiàn)出以下技術(shù)特征：
[0040] (1)在最佳培養(yǎng)體系條件下細(xì)胞貼壁生長，可形成CFU-F集落，形態(tài)相對均一，呈 平行排列生長或旋渦狀生長的梭形細(xì)胞；
[0041] (2)表達(dá)間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記⑶73、⑶105,干細(xì)胞標(biāo)記物⑶90 ;而不表達(dá)造血干細(xì)胞標(biāo) 志⑶34和白細(xì)胞共同抗原⑶45 ;
[0042] (3)體外可誘導(dǎo)分化為成骨細(xì)胞、成脂細(xì)胞及成軟骨細(xì)胞。
[0043] 上述鑒定結(jié)果表明制備的兔臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞不是造血干細(xì)胞，并且具有上述技 術(shù)特征，符合間充質(zhì)干細(xì)胞產(chǎn)品合格標(biāo)準(zhǔn)。
[0044] 實(shí)施例2
[0045] 一種兔臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的制備方法，選用兔臍帶為原材料，包括以下步驟，
[0046] A.兔臍帶組織采集：取孕21?23d的普通級孕兔，空氣栓塞處死；體積分?jǐn)?shù)為 75%乙醇浸泡消毒10分鐘后，仰臥位固定于清潔的解剖臺上；減去孕兔腹部兔毛，碘伏消 毒孕兔腹部，依次剪開皮膚、皮下組織、肌層、腹膜后，找到狹長子宮，可見有成串胎囊；用無 菌紗布將子宮與腹腔內(nèi)其他器官隔開，從一側(cè)依次剖開胎囊，剪開羊膜，提起胎兔，小心剔 除臍帶周圍羊膜，輕柔擠出臍帶內(nèi)兔血，將臍帶胎盤端和胎兔端離斷，放入無菌等滲生理鹽 水中備用；重復(fù)以上操作，收集足夠量的臍帶；
[0047] B.兔臍帶組織的清洗：在無菌條件下，收集兔臍帶組織，用無菌生理鹽水或無菌 PBS液體沖洗5次兔臍帶組織，直至兔臍帶組織內(nèi)無兔血；
[0048] C.兔臍帶組織的消化：將兔臍帶組織放到100ml的無菌燒杯中，用無菌組織剪將 兔臍帶組織剪成1mm3的兔臍帶組織塊后，加入兔臍帶組織塊體積4倍的0. 1 %無菌膠原酶， 無菌封裝后，置于39°C、體積分?jǐn)?shù)為5. 5% C02培養(yǎng)箱中消化，直至兔臍帶組織塊消化完全； 兔臍帶組織塊消化完全后，用含體積分?jǐn)?shù)為10% FBS、100U/ml青霉素和鏈霉素的L-DMEM培 養(yǎng)基中止消化；
[0049] D.細(xì)胞接種：將中止后的混合液置于低溫離心機(jī)內(nèi)離心后去除上清液，保留沉淀 物，用含10% FBS、100U/ml青霉素和鏈霉素的L-DMEM培養(yǎng)基吹勻；將重懸液接種于培養(yǎng)瓶 或培養(yǎng)皿中，靜置于39°C、5. 5% C02、96%飽和濕度的恒溫培箱中培養(yǎng)；培養(yǎng)24h后全量換 液，去除殘存組織和未貼壁細(xì)胞，之后3天換液一次，至細(xì)胞融合達(dá)到80%時，傳代培養(yǎng)，即 時使用或冷凍保存?zhèn)溆谩?br> [0050] 兔臍帶組織從臍帶沃頓膠、臍帶血管周圍或臍帶血管內(nèi)皮下的任何一處或多處選 取。
[0051] 步驟B中，在無菌條件下，收集兔臍帶組織，用無菌生理鹽水沖洗3次兔臍帶組織， 直至兔臍帶組織內(nèi)無兔血。
[0052] 步驟B中，L-DMEM培養(yǎng)基的用量為10ml ;lml的L-DMEM培養(yǎng)基中，F(xiàn)BS的用量為 0. 05ml，青霉素的用量為80U，鏈霉素的用量為95U。
[0053] 步驟C中，低溫離心機(jī)內(nèi)以2500rmp的轉(zhuǎn)速離心20分鐘。
[0054] 對于按照本發(fā)明上述方法制備的兔臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞，按照"國際細(xì)胞療法協(xié) 會"（ISCT)制定的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行鑒定，表現(xiàn)出以下技術(shù)特征：
[0055] (1)在最佳培養(yǎng)體系條件下細(xì)胞貼壁生長，可形成CFU-F集落，形態(tài)相對均一，呈 平行排列生長或旋渦狀生長的梭形細(xì)胞；
[0056] (2)表達(dá)間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記⑶73、⑶105,干細(xì)胞標(biāo)記物⑶90 ;而不表達(dá)造血干細(xì)胞標(biāo) 志⑶34和白細(xì)胞共同抗原⑶45 ;
[0057] (3)體外可誘導(dǎo)分化為成骨細(xì)胞、成脂細(xì)胞及成軟骨細(xì)胞。
[0058] 上述鑒定結(jié)果表明制備的兔臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞不是造血干細(xì)胞，并且具有上述技 術(shù)特征，符合間充質(zhì)干細(xì)胞產(chǎn)品合格標(biāo)準(zhǔn)。
[0059] 實(shí)施例3
[0060] 一種兔臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的制備方法，選用兔臍帶為原材料，包括以下步驟，
[0061] A.兔臍帶組織采集：取孕21?23d的普通級孕兔，空氣栓塞處死；體積分?jǐn)?shù)為 75%乙醇浸泡消毒10分鐘后，仰臥位固定于清潔的解剖臺上；減去孕兔腹部兔毛，碘伏消 毒孕兔腹部，依次剪開皮膚、皮下組織、肌層、腹膜后，找到狹長子宮，可見有成串胎囊；用無 菌紗布將子宮與腹腔內(nèi)其他器官隔開，從一側(cè)依次剖開胎囊，剪開羊膜，提起胎兔，小心剔 除臍帶周圍羊膜，輕柔擠出臍帶內(nèi)兔血，將臍帶胎盤端和胎兔端離斷，放入無菌等滲生理鹽 水中備用；重復(fù)以上操作，收集足夠量的臍帶；
[0062] B.兔臍帶組織的清洗：在無菌條件下，收集兔臍帶組織，用無菌生理鹽水或無菌 PBS液體沖洗3-5次兔臍帶組織，直至兔臍帶組織內(nèi)無兔血；
[0063] C.兔臍帶組織的消化：將兔臍帶組織放到100ml的無菌燒杯中，用無菌組織剪將 兔臍帶組織剪成1mm3的兔臍帶組織塊后，加入兔臍帶組織塊體積3-4倍的0. 1 %無菌膠 原酶，無菌封裝后，置于38°C、體積分?jǐn)?shù)為5% C02培養(yǎng)箱中消化，直至兔臍帶組織塊消化 完全；兔臍帶組織塊消化完全后，用含體積分?jǐn)?shù)為10% FBS、100U/ml青霉素和鏈霉素的 L-DMEM培養(yǎng)基中止消化；
[0064] D.細(xì)胞接種：將中止后的混合液置于低溫離心機(jī)內(nèi)離心后去除上清液，保留沉淀 物，用含10% FBS、100U/ml青霉素和鏈霉素的L-DMEM培養(yǎng)基吹勻；將重懸液接種于培養(yǎng)瓶 或培養(yǎng)皿中，靜置于38°C、5% C02、95%飽和濕度的恒溫培箱中培養(yǎng)；培養(yǎng)24h后全量換液， 去除殘存組織和未貼壁細(xì)胞，之后3天換液一次，至細(xì)胞融合達(dá)到80%時，傳代培養(yǎng)，即時 使用或冷凍保存?zhèn)溆谩?br> [0065] 兔臍帶組織從臍帶沃頓膠、臍帶血管周圍或臍帶血管內(nèi)皮下的任何一處或多處選 取。
[0066] 步驟B中，在無菌條件下，收集兔臍帶組織，用無菌生理鹽水沖洗3次兔臍帶組織， 直至兔臍帶組織內(nèi)無兔血。
[0067] 步驟B中，L-DMEM培養(yǎng)基的用量為5ml ;FBS的用量為0. 05-0. 2ml，青霉素的用量 為80-115U，鏈霉素的用量為95-120U。
[0068] 步驟C中，低溫離心機(jī)內(nèi)以2500rmp的轉(zhuǎn)速離心20分鐘。
[0069] 對于按照本發(fā)明上述方法制備的兔臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞，按照"國際細(xì)胞療法協(xié) 會"（ISCT)制定的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行鑒定，表現(xiàn)出以下技術(shù)特征：
[0070] (1)在最佳培養(yǎng)體系條件下細(xì)胞貼壁生長，可形成CFU-F集落，形態(tài)相對均一，呈 平行排列生長或旋渦狀生長的梭形細(xì)胞；
[0071] (2)表達(dá)間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記⑶73、⑶105,干細(xì)胞標(biāo)記物⑶90 ;而不表達(dá)造血干細(xì)胞標(biāo) 志⑶34和白細(xì)胞共同抗原⑶45 ;
[0072] (3)體外可誘導(dǎo)分化為成骨細(xì)胞、成脂細(xì)胞及成軟骨細(xì)胞。
[0073] 上述鑒定結(jié)果表明制備的兔臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞不是造血干細(xì)胞，并且具有上述技 術(shù)特征，符合間充質(zhì)干細(xì)胞產(chǎn)品合格標(biāo)準(zhǔn)。
[0074] 實(shí)施例4
[0075] -種兔臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的制備方法，選用兔臍帶為原材料，包括以下步驟，
[0076] A.兔臍帶組織采集：取孕21?23d的普通級孕兔，空氣栓塞處死；體積分?jǐn)?shù)為 75%乙醇浸泡消毒10分鐘后，仰臥位固定于清潔的解剖臺上；減去孕兔腹部兔毛，碘伏消 毒孕兔腹部，依次剪開皮膚、皮下組織、肌層、腹膜后，找到狄長子宮，可見有成串胎囊；用無 菌紗布將子宮與腹腔內(nèi)其他器官隔開，從一側(cè)依次剖開胎囊，剪開羊膜，提起胎兔，小心剔 除臍帶周圍羊膜，輕柔擠出臍帶內(nèi)兔血，將臍帶胎盤端和胎兔端離斷，放入無菌等滲生理鹽 水中備用；重復(fù)以上操作，收集足夠量的臍帶；
[0077] B.兔臍帶組織的清洗：在無菌條件下，收集兔臍帶組織，用無菌生理鹽水或無菌 PBS液體沖洗3次兔臍帶組織，直至兔臍帶組織內(nèi)無兔血；
[0078] C.兔臍帶組織的消化：將兔臍帶組織放到100ml的無菌燒杯中，用無菌組織剪將 兔臍帶組織剪成1mm3的兔臍帶組織塊后，加入兔臍帶組織塊體積3倍的0. 1 %無菌膠原 酶，無菌封裝后，置于37. 5°C、體積分?jǐn)?shù)為4. 9% C02培養(yǎng)箱中消化，直至兔臍帶組織塊消 化完全；兔臍帶組織塊消化完全后，用含體積分?jǐn)?shù)為10% FBS、100U/ml青霉素和鏈霉素的 L-DMEM培養(yǎng)基中止消化；
[0079] D.細(xì)胞接種：將中止后的混合液置于低溫離心機(jī)內(nèi)離心后去除上清液，保留沉淀 物，用含10% FBS、100U/ml青霉素和鏈霉素的L-DMEM培養(yǎng)基吹勻；將重懸液接種于培養(yǎng)瓶 或培養(yǎng)皿中，靜置于37. 5°C、4. 9% C02、93%飽和濕度的恒溫培箱中培養(yǎng)；培養(yǎng)24h后全量 換液，去除殘存組織和未貼壁細(xì)胞，之后3天換液一次，至細(xì)胞融合達(dá)到80%時，傳代培養(yǎng)， 即時使用或冷凍保存?zhèn)溆谩?br> [0080] 兔臍帶組織從臍帶沃頓膠、臍帶血管周圍或臍帶血管內(nèi)皮下的任何一處或多處選 取。
[0081] 步驟B中，在無菌條件下，收集兔臍帶組織，用無菌生理鹽水沖洗3次兔臍帶組織， 直至兔臍帶組織內(nèi)無兔血。
[0082] 步驟B中，L-DMEM培養(yǎng)基的用量為9. 5ml ; 1ml的L-DMEM培養(yǎng)基中，F(xiàn)BS的用量為 0. lml，青霉素的用量為100U，鏈霉素的用量為100U。
[0083] 步驟C中，低溫離心機(jī)內(nèi)以2500rmp的轉(zhuǎn)速離心20分鐘。
[0084] 對于按照本發(fā)明上述方法制備的兔臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞，按照"國際細(xì)胞療法協(xié) 會"（ISCT)制定的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行鑒定，表現(xiàn)出以下技術(shù)特征：
[0085] (1)在最佳培養(yǎng)體系條件下細(xì)胞貼壁生長，可形成CFU-F集落，形態(tài)相對均一，呈 平行排列生長或旋渦狀生長的梭形細(xì)胞；
[0086] (2)表達(dá)間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記⑶73、⑶105,干細(xì)胞標(biāo)記物⑶90 ;而不表達(dá)造血干細(xì)胞標(biāo) 志⑶34和白細(xì)胞共同抗原⑶45 ;
[0087] (3)體外可誘導(dǎo)分化為成骨細(xì)胞、成脂細(xì)胞及成軟骨細(xì)胞。
[0088] 上述鑒定結(jié)果表明制備的兔臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞不是造血干細(xì)胞，并且具有上述技 術(shù)特征，符合間充質(zhì)干細(xì)胞產(chǎn)品合格標(biāo)準(zhǔn)。
[0089] 實(shí)施例5
[0090] 一種兔臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的制備方法，選用兔臍帶為原材料，包括以下步驟，
[0091] A.兔臍帶組織采集：取孕21?23d的普通級孕兔，空氣栓塞處死；體積分?jǐn)?shù)為 75%乙醇浸泡消毒10分鐘后，仰臥位固定于清潔的解剖臺上；減去孕兔腹部兔毛，碘伏消 毒孕兔腹部，依次剪開皮膚、皮下組織、肌層、腹膜后，找到狹長子宮，可見有成串胎囊；用無 菌紗布將子宮與腹腔內(nèi)其他器官隔開，從一側(cè)依次剖開胎囊，剪開羊膜，提起胎兔，小心剔 除臍帶周圍羊膜，輕柔擠出臍帶內(nèi)兔血，將臍帶胎盤端和胎兔端離斷，放入無菌等滲生理鹽 水中備用；重復(fù)以上操作，收集足夠量的臍帶；
[0092] B.兔臍帶組織的清洗：在無菌條件下，收集兔臍帶組織，用無菌生理鹽水或無菌 PBS液體沖洗3次兔臍帶組織，直至兔臍帶組織內(nèi)無兔血；
[0093] C.兔臍帶組織的消化：將兔臍帶組織放到100ml的無菌燒杯中，用無菌組織剪將 兔臍帶組織剪成1mm3的兔臍帶組織塊后，加入兔臍帶組織塊體積3倍的0. 1 %無菌膠原 酶，無菌封裝后，置于38. 9°C、體積分?jǐn)?shù)為5.2% C02培養(yǎng)箱中消化，直至兔臍帶組織塊消 化完全；兔臍帶組織塊消化完全后，用含體積分?jǐn)?shù)為10% FBS、100U/ml青霉素和鏈霉素的 L-DMEM培養(yǎng)基中止消化；
[0094] D.細(xì)胞接種：將中止后的混合液置于低溫離心機(jī)內(nèi)離心后去除上清液，保留沉淀 物，用含10% FBS、100U/ml青霉素和鏈霉素的L-DMEM培養(yǎng)基吹勻；將重懸液接種于培養(yǎng)瓶 或培養(yǎng)皿中，靜置于38. 9°C、5. 2% C02、95%飽和濕度的恒溫培箱中培養(yǎng)；培養(yǎng)24h后全量 換液，去除殘存組織和未貼壁細(xì)胞，之后3天換液一次，至細(xì)胞融合達(dá)到80%時，傳代培養(yǎng)， 即時使用或冷凍保存?zhèn)溆谩?br> [0095] 兔臍帶組織從臍帶沃頓膠、臍帶血管周圍或臍帶血管內(nèi)皮下的任何一處或多處選 取。
[0096] 步驟B中，在無菌條件下，收集兔臍帶組織，用無菌生理鹽水沖洗3次兔臍帶組織， 直至兔臍帶組織內(nèi)無兔血。
[0097] 步驟B中，L-DMEM培養(yǎng)基的用量為9. 5ml ; 1ml的L-DMEM培養(yǎng)基中，F(xiàn)BS的用量為 0. 18ml，青霉素的用量為114U，鏈霉素的用量為115U。
[0098] 步驟C中，低溫離心機(jī)內(nèi)以2500rmp的轉(zhuǎn)速離心20分鐘。
[0099] 對于按照本發(fā)明上述方法制備的兔臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞，按照"國際細(xì)胞療法協(xié) 會"（ISCT)制定的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行鑒定，表現(xiàn)出以下技術(shù)特征：
[0100] (1)在最佳培養(yǎng)體系條件下細(xì)胞貼壁生長，可形成CFU-F集落，形態(tài)相對均一，呈 平行排列生長或旋渦狀生長的梭形細(xì)胞；
[0101] (2)表達(dá)間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記⑶73、⑶105,干細(xì)胞標(biāo)記物⑶90 ;而不表達(dá)造血干細(xì)胞標(biāo) 志⑶34和白細(xì)胞共同抗原⑶45 ;
[0102] (3)體外可誘導(dǎo)分化為成骨細(xì)胞、成脂細(xì)胞及成軟骨細(xì)胞。
[0103] 上述鑒定結(jié)果表明制備的兔臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞不是造血干細(xì)胞，并且具有上述技 術(shù)特征，符合間充質(zhì)干細(xì)胞產(chǎn)品合格標(biāo)準(zhǔn)。
[0104] 實(shí)施例6
[0105] 兔臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的細(xì)胞特征：
[0106] (1)流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞免疫表型：選取P4代生長狀態(tài)良好的細(xì)胞，0. 25%胰酶 消化，lOOOrpm離心5min，PBS清洗細(xì)胞2遍，細(xì)胞計(jì)數(shù)，分5組，為I組（⑶90組）、II組 (⑶105組）、III組（⑶73組）、IV組（⑶34組）、V組（⑶45組），每組各含3管，分別為A 管（相應(yīng)陽性抗體管）、B管（同型對照抗體管）、C管（不加任何抗體的空白對照管），共計(jì) 15管，每管加入的細(xì)胞總數(shù)相同，為IX 106個細(xì)胞/管,離心后棄上清，用4°C PBS重懸，各 組的A管中加入相應(yīng)陽性抗體5ul，B管中加入同型對照抗體5ul，C管中不加入任何抗體和 試劑，同時在4°C下孵育30min。因考慮到人和兔表面抗原具有較高同源性，流式檢測抗體 選用抗人流式抗體。孵育完成后，每管加入lmlPBS300g離心5min，棄上清，加入500ulPBS 重懸。封好流式管口，置于泡沫冰盒中，迅速進(jìn)行流式儀檢測分析。⑶73、⑶105、⑶90為陽 性標(biāo)記，⑶34、⑶45為陰性標(biāo)記，圖3。
[0107] (2)PCR檢測細(xì)胞表面標(biāo)記mRNA表達(dá)：
[0108] ①引物設(shè)計(jì)：從美國國立生物技術(shù)信息中心（National Center of Biotechnology Information，NCBI)中查詢兔 CD90、CD73、CD105、CD45、CD34mRNA 序列進(jìn) 行引物設(shè)計(jì)，管家基因?yàn)镚APDH基因，引物序列、產(chǎn)物大小見表1。
[0109] 表1 RT-PCR和qPCR引物信息
[0110]

【權(quán)利要求】
1. 一種兔臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的制備方法，其特征在于：選用兔臍帶為原材料，包括以 下步驟， A. 兔臍帶組織的清洗：在無菌條件下，收集兔臍帶組織，用無菌生理鹽水或無菌PBS液 體沖洗3-5次兔臍帶組織，直至兔臍帶組織內(nèi)無兔血； B. 兔臍帶組織的消化：將兔臍帶組織放到100ml的無菌燒杯中，用無菌組織剪將兔臍 帶組織剪成1mm3的兔臍帶組織塊后，加入兔臍帶組織塊體積3-4倍的0. 1 %無菌膠原酶，無 菌封裝后，置于37-39°C、體積分?jǐn)?shù)為4. 5-5. 5% C02培養(yǎng)箱中消化，直至兔臍帶組織塊消化 完全； 兔臍帶組織塊消化完全后，用含體積分?jǐn)?shù)為10% FBS、100U/ml青霉素和鏈霉素的 L-DMEM培養(yǎng)基中止消化； C. 細(xì)胞接種：將中止后的混合液置于低溫離心機(jī)內(nèi)離心后去除上清液，保留沉淀物， 用含10% FBS、100U/ml青霉素和鏈霉素的L-DMEM培養(yǎng)基吹勻；將重懸液接種于培養(yǎng)瓶或 培養(yǎng)皿中，靜置于37-39°C、4. 5-5. 5% C02、92-96%飽和濕度的恒溫培箱中培養(yǎng)；培養(yǎng)24h 后全量換液，去除殘存組織和未貼壁細(xì)胞，之后3天換液一次，至細(xì)胞融合達(dá)到80 %時，傳 代培養(yǎng)，即時使用或冷凍保存?zhèn)溆谩?br> 2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種兔臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的制備方法，其特征在于：兔臍帶 組織從臍帶沃頓膠、臍帶血管周圍或臍帶血管內(nèi)皮下的任何一處或多處選取。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種兔臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的制備方法，其特征在于：步驟A 中，在無菌條件下，收集兔臍帶組織，用無菌生理鹽水沖洗3次兔臍帶組織，直至兔臍帶組 織內(nèi)無兔血。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種兔臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的制備方法，其特征在于：步驟B 中，低溫離心機(jī)內(nèi)以2500rmp的轉(zhuǎn)速離心20分鐘。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種兔臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的制備方法，其特征在于：步驟B 中，無菌封裝后，置于37°C、體積分?jǐn)?shù)為5% C02培養(yǎng)箱中消化，直至兔臍帶組織塊消化完 全。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種兔臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的制備方法，其特征在于：步驟B 中，L-DMEM培養(yǎng)基的用量為5?10ml ;lml的L-DMEM培養(yǎng)基中，F(xiàn)BS的用量為0. 05-0. 2ml， 青霉素的用量為80-115U，鏈霉素的用量為95-120U。
7. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種兔臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的制備方法，其特征在于：步驟C 中，將重懸液接種于培養(yǎng)瓶或培養(yǎng)皿中，靜置于37°C、5% C02、95%飽和濕度的恒溫培箱中 培養(yǎng)。
【文檔編號】C12N5/0775GK104099296SQ201410325874
【公開日】2014年10月15日 申請日期:2014年7月9日 優(yōu)先權(quán)日:2014年7月9日
【發(fā)明者】董有海, 何益群, 林榮強(qiáng) 申請人:復(fù)旦大學(xué)附屬上海市第五人民醫(yī)院