一種雙水相分離純化蒜氨酸酶的方法
【專利摘要】本發(fā)明屬于大蒜精深加工領(lǐng)域，特別公開了一種雙水相分離純化蒜氨酸酶的方法。該方法包括如下步驟：（1）將大蒜鱗莖去皮預(yù)冷，加入預(yù)冷提取液浸泡，勻漿、離心，棄去蒜渣，上清液即為粗酶液；（2）將硫酸銨、磷酸二氫鈉或檸檬酸三鈉溶于伯瑞坦-羅賓森緩沖液中，震蕩完全溶解后，再加入PEG溶液，震蕩混勻，靜置分相，得到雙水相提取劑；（3）將粗酶液置于雙水相提取劑中，震蕩后，離心靜置分相；（4）對(duì)富集蒜氨酸酶的下相超濾，對(duì)截留液真空冷凍干燥，得到蒜氨酸酶固體。本發(fā)明操作簡(jiǎn)單，儀器簡(jiǎn)單，時(shí)間上節(jié)約，成本低廉，蒜氨酸酶純化倍數(shù)和酶活回收率都比現(xiàn)有技術(shù)高，易于放大規(guī)模生產(chǎn)。
【專利說明】一種雙水相分離純化蒜氨酸酶的方法
[0001](一)

【技術(shù)領(lǐng)域】
本發(fā)明屬于大蒜精深加工領(lǐng)域，特別涉及一種雙水相分離純化蒜氨酸酶的方法。
[0002](二)

【背景技術(shù)】
蒜氨酸酶是存在于大蒜中的一種內(nèi)源酶，全稱S-烷基-L-半胱氨酸亞砜酶，大約占蒜中可溶性蛋白的10-12%，由兩個(gè)完全相同的亞基構(gòu)成，每個(gè)亞基由448個(gè)氨基酸組成，蒜氨酸酶和它的天然底物蒜氨酸位于大蒜的不同部位，蒜氨酸酶位于液泡組織中，底物位于細(xì)胞質(zhì)中，當(dāng)大蒜破碎時(shí)，蒜氨酸和蒜氨酸酶接觸生產(chǎn)的硫代亞磺酸酯具有抗癌、抗氧化、抗動(dòng)脈粥樣硬化等作用，可以用蒜氨酸酶和蒜氨酸來制備硫代亞磺酸酯用于大蒜膠囊的生產(chǎn)，因此蒜氨酸酶的分離純化對(duì)于硫代亞磺酸酯的生產(chǎn)很重要。
[0003]目前蒜氨酸酶純化主要采用一系列的蛋白純化技術(shù)，如鹽析、親和色譜、凝膠過濾等，雖然這些方法都能使蒜氨酸酶達(dá)到一定的純化，但是存在諸多缺點(diǎn)，如操作繁瑣，條件苛刻，分離過程容易使蛋白變性，降低酶活以及酶的回收率。蒜氨酸酶在溫度大于30°C時(shí)酶活會(huì)降低，所以純化蒜氨酸酶對(duì)環(huán)境的要求較高，找到一種適合蒜氨酸酶純化的方法尤為重要。本發(fā)明提供了一種雙水相方法，此種方法操作簡(jiǎn)單、操作條件溫和、易于放大、消耗能量小的分離純化方法，是目前人們研究和開發(fā)的主要課題，用這種方法來純化蒜氨酸酶能夠達(dá)到酶活的要求。
[0004](三)
【發(fā)明內(nèi)容】
本發(fā)明為了彌補(bǔ)現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供了一種降低生產(chǎn)成本，提高酶活回收率，提高產(chǎn)品生物活性的雙水相分離純化蒜氨酸酶的方法。
[0005]本發(fā)明是通過如下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的:
一種雙水相分離純化蒜氨酸酶的方法，以大蒜鱗莖為原料，包括如下步驟:
(1)將大蒜鱗莖去皮預(yù)冷，加入4°c的預(yù)冷提取液浸泡，在預(yù)冷的組織勻漿機(jī)中勻漿、離心，棄去蒜渣，上清液即為粗酶液；
(2)將硫酸銨、磷酸二氫鈉或檸檬酸三鈉溶于伯瑞坦-羅賓森緩沖液中，震蕩完全溶解后，再加入PEG溶液，震蕩混勻，靜置分相，得到雙水相提取劑；
(3)將粗酶液置于雙水相提取劑中，震蕩混勻后，離心靜置分相；
(4)對(duì)富集蒜氨酸酶的下相超濾，對(duì)截留液真空冷凍干燥，得到蒜氨酸酶固體。
[0006]本發(fā)明的更優(yōu)技術(shù)方案為:
步驟(1)中，預(yù)冷提取液的pH為7.0，含有0.05mol/L磷酸二氫鈉、0.05mol/L磷酸二氫鉀、5mmol/L的EDTA、25 μ mol/L的PLP、體積比為10%的甘油和重量比為1%的氯化鈉，大蒜鱗莖和預(yù)冷提取液的使用比為Ig:50mL，浸泡時(shí)間為20-40min。
[0007]步驟(2)中，雙水相提取劑為硫酸銨/PEG體系，PEG的分子量為1000-3000，硫酸銨的質(zhì)量濃度為10-18% (w/w), PEG的質(zhì)量濃度為7.5-17.5% (w/w)。
[0008]步驟(3)中，雙水相提取劑的pH為2.0-5.0，粗酶液加入量為3-6% (v/v)。
[0009]酶活測(cè)定方法為:
以合成的S-烯丙基-L-半胱氨酸為底物，用丙酮法測(cè)定酶活性:lmL酶液加IL底物(體系中加入25--mol/LPLP)室溫下反應(yīng)Imin后，加等量10%三氯乙酸終止反應(yīng)，加入ImL0.1%的2，4- 二硝基苯肼25°C恒溫5min,再加入5mL2.5mol/L氫氧化鈉搖勻顯色1min后，用756紫外分光光度計(jì)測(cè)波長(zhǎng)420nm處的光吸收值(OD)。在25°C條件下，蒜氨酸酶催化的反應(yīng)中，每分鐘產(chǎn)生l--mol丙酮酸定義為一個(gè)酶活單位(U)。
[0010]本發(fā)明操作簡(jiǎn)單，儀器簡(jiǎn)單，時(shí)間上節(jié)約，成本低廉，蒜氨酸酶純化倍數(shù)和酶活回收率都比現(xiàn)有技術(shù)高，分離過程經(jīng)濟(jì)，環(huán)境溫和，對(duì)蒜氨酸酶的活性影響較小，可省去反復(fù)沉淀的步驟，易于放大規(guī)模生產(chǎn)。
[0011](四)

【具體實(shí)施方式】
粗酶液的制備:稱取大蒜鱗莖100g，去皮，4°c預(yù)冷，加4°C預(yù)冷提取液(PH7.0、
0.05mol/L磷酸二氫鈉、0.05mol/L磷酸二氫鉀、體積比為10%的甘油、1%的氯化鈉、5mmol/L的EDTA、25--mol/L的PLP)浸提30min，在預(yù)冷的組織勻漿機(jī)中勻漿，3000rpm離心10min，棄去蒜渣，上清液即為粗酶液，測(cè)定其中的酶活和蛋白含量。
[0012]實(shí)施例1:
配制質(zhì)量分?jǐn)?shù)為7.5%(w/w)PEG3000/10%(w/w)硫酸銨，pH=5.0的雙水相體系，添加5%(v/v)的蒜氨酸酶粗提液，震蕩15min使相完全分散，離心使相完全分離，記錄上下相體積。對(duì)下相通過超濾除去鹽后，真空冷凍干燥，得酶純化倍數(shù)為5.06，酶活回收率為92.2%。
[0013]實(shí)施例2:
配制質(zhì)量分?jǐn)?shù)為17.5% (w/w)PEG3000/18%(w/w)硫酸銨，pH=5.0的雙水相體系，添加5%(v/v)的蒜氨酸酶粗提液，震蕩15min使相完全分散，離心使相完全分離，記錄上下相體積。對(duì)下相通過超濾除去鹽后，真空冷凍干燥，得酶純化倍數(shù)為5.58，酶活回收率為94.4%。
[0014]實(shí)施例3:
配制質(zhì)量分?jǐn)?shù)為15%(W/W)PEG3000/14%(W/W)硫酸銨，pH=5.0的雙水相體系，添加5%(v/v)的蒜氨酸酶粗提液，震蕩15min使相完全分散，離心使相完全分離，記錄上下相體積。對(duì)下相通過超濾除去鹽后，真空冷凍干燥，得酶純化倍數(shù)為5.95，酶活回收率為96.2%。
【權(quán)利要求】
1.一種雙水相分離純化蒜氨酸酶的方法，以大蒜鱗莖為原料，其特征為，包括如下步驟:(I)將大蒜鱗莖去皮預(yù)冷，加入4°c的預(yù)冷提取液浸泡，在預(yù)冷的組織勻漿機(jī)中勻漿、離心，棄去蒜渣，上清液即為粗酶液；(2)將硫酸銨、磷酸二氫鈉或檸檬酸三鈉溶于伯瑞坦-羅賓森緩沖液中，震蕩完全溶解后，再加入PEG溶液，震蕩混勻，靜置分相，得到雙水相提取劑；(3)將粗酶液置于雙水相提取劑中，震蕩混勻后，離心靜置分相；(4)對(duì)富集蒜氨酸酶的下相超濾，對(duì)截留液真空冷凍干燥，得到蒜氨酸酶固體。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的雙水相分離純化蒜氨酸酶的方法，其特征在于:步驟(1)中，預(yù)冷提取液的PH為7.0,含有0.05mol/L磷酸二氫鈉、0.05mol/L磷酸二氫鉀、5mmol/L的EDTA、25 μ mol/L的PLP、體積比為10%的甘油和重量比為1%的氯化鈉，大蒜鱗莖和預(yù)冷提取液的使用比為Ig:50mL，浸泡時(shí)間為20-40min。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的雙水相分離純化蒜氨酸酶的方法，其特征在于:步驟(2)中，雙水相提取劑為硫酸銨/PEG體系。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的雙水相分離純化蒜氨酸酶的方法，其特征在于:步驟(3)中，雙水相提取劑的PH為2.0-5.0，粗酶液加入量為3-6% (v/v)0
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的雙水相分離純化蒜氨酸酶的方法，其特征在于:步驟(2)中，PEG的分子量為1000-3000，硫酸銨的質(zhì)量濃度為10-18% (w/w), PEG的質(zhì)量濃度為.7.5-17.5% (w/w)。
【文檔編號(hào)】C12N9/88GK104073479SQ201410298149
【公開日】2014年10月1日 申請(qǐng)日期:2014年6月27日 優(yōu)先權(quán)日:2014年6月27日
【發(fā)明者】崔波, 姜秀敏, 檀琮萍, 盧艷敏 申請(qǐng)人:齊魯工業(yè)大學(xué)