人類子癇前期發(fā)生相關(guān)的外周血白細(xì)胞miRNA標(biāo)志物及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明屬于基因工程及臨床醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，本發(fā)明的目的是提供人類子癇前期發(fā)生相關(guān)的外周血白細(xì)胞miRNA標(biāo)志物。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供上述miRNA標(biāo)志物的應(yīng)用。選自has-miR-15a-3p、has-miR-31-3p、has-miR-451a、has-miR-122-5p中的多種。所述的外周血白細(xì)胞miRNA標(biāo)志物由has-miR-15a-3p、has-miR-31-3p、has-miR-451a和has-miR-122-5p構(gòu)成。外周血白細(xì)胞miRNA標(biāo)志物在制備人類子癇前期診斷或監(jiān)測(cè)試劑中的應(yīng)用。所述試劑是能夠測(cè)定這些外周血白細(xì)胞microRNA標(biāo)志物在外周血白細(xì)胞中表達(dá)量的試劑。本發(fā)明采用符合子癇前期和健康對(duì)照人群的樣本進(jìn)行驗(yàn)證，證明這幾種標(biāo)志物表達(dá)量存在顯著性差異并具有穩(wěn)定性，以說明該標(biāo)志物具有特異性，可作為標(biāo)志物使用。
【專利說明】人類子癇前期發(fā)生相關(guān)的外周血白細(xì)胞miRNA標(biāo)志物及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于基因工程及臨床醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，具體涉及人類子癇前期發(fā)生相關(guān)的外周血白細(xì)胞miRNA標(biāo)志物及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]子癇前期(Preeclampsia，PE)是妊娠期常見的特發(fā)性多臟器損害性疾病，其特征是妊娠20周后出現(xiàn)高血壓、蛋白尿和浮腫，進(jìn)而可能會(huì)導(dǎo)致胎盤早剝、DIC、子癇、HELLP綜合征、腎功能衰竭、腦血管意外和心功能衰竭等嚴(yán)重并發(fā)癥的發(fā)生。PE妊娠期發(fā)生率在全球范圍內(nèi)是2%~8%，并且是目前孕產(chǎn)婦、胎嬰兒發(fā)病率和死亡率的主要原因。PE的臨床表現(xiàn)有明顯的異質(zhì)性，這使得臨床獲得有效的治療難度明顯加大。
[0003]目前主要有兩個(gè)理論來解釋PE的病理生理學(xué)改變。首先是血管炎性病變學(xué)說，包括胎盤缺氧，氧化應(yīng)激，炎癥反應(yīng)，血小板聚集異常增強(qiáng)和全身性血管內(nèi)皮功能障礙等。其中血管內(nèi)皮功能的障礙被認(rèn)為甚至?xí)恢毖由斓疆a(chǎn)后數(shù)周。其次是免疫功能異常學(xué)說，如細(xì)胞免疫異常、母胎免疫異常，保護(hù)性免疫功能失調(diào)等。PE發(fā)生的原因可能包括遺傳因素、免疫因素和生物因素等多個(gè)方面。這一特點(diǎn)說明在臨床實(shí)踐中不僅不容易獲得較為可靠的生物標(biāo)志物，而且很難確定既有利于孕婦又要保證胎兒成熟的有效的療法。雖然已有一些對(duì)患者外周血循環(huán)中相關(guān)細(xì)胞因子的研究，如血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)、可溶性內(nèi)皮糖蛋白(sEng)，可溶性血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體(sFLTl)和胎盤生長(zhǎng)因子(PlGF)等，但均不能較好地早期預(yù)測(cè)的PE的發(fā)生。
[0004]miRNA是目前研究最廣泛的一類內(nèi)源性非編碼小分子RNA，長(zhǎng)度范圍在18~25個(gè)核苷酸(nt)，是一個(gè)在進(jìn)化上高度保守的、具有發(fā)育時(shí)序性和器官組織特異性的基因負(fù)調(diào)節(jié)劑家族，能夠與編碼蛋白的mRNA的3’ -UTR結(jié)合，導(dǎo)致相應(yīng)的蛋白質(zhì)表達(dá)下調(diào)或完全抑制其表達(dá)。大量的研究結(jié)果證實(shí)，miRNA參與機(jī)體發(fā)生發(fā)育的多種生物學(xué)過程，包括干細(xì)胞的分化、器官和系統(tǒng)發(fā)育、信號(hào)傳導(dǎo)、免疫調(diào)控、疾病和癌癥的發(fā)生、以及生物體對(duì)外界生物和非生物環(huán)境的反應(yīng)。miRNA的作用機(jī)制包括通過翻譯抑制、mRNA降解和miRNA直接誘導(dǎo)的mRNA腺苷酸化三種轉(zhuǎn)錄后抑制效應(yīng)而增加或抑制目標(biāo)基因表達(dá)。最近的研究表明，外周血白細(xì)胞特別是其中的單個(gè)核細(xì)胞miRNA參與調(diào)節(jié)人體各種免疫過程。在人類多種自身免疫性疾病，包括克羅恩病、紅斑性狼瘡、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎和腫瘤等疾病已經(jīng)發(fā)現(xiàn)多種miRNA的差異性表達(dá)。但有關(guān)子癇前期患者外周血白細(xì)胞或單個(gè)核細(xì)胞miRNA在該病發(fā)病機(jī)制中的作用以及作為生物標(biāo)志物的可靠性和效能的研究尚未見報(bào)道，深入研究可為子癇前期的診斷和治療提供新的途徑。 [0005]血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷是目前公認(rèn)的子癇前期發(fā)病的重要環(huán)節(jié)。子癇前期患者一旦發(fā)生血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷，可造成血管通透性增加,血管內(nèi)蛋白和液體外滲；引發(fā)血小板凝聚，激活凝血系統(tǒng)，血液濃縮、凝滯，病情進(jìn)展可造成DIC ;增加血管收縮因子的合成與釋放，減少血管舒張因子的合成與釋放，使血管活性因子失衡，血管收縮，從而引發(fā)一系列的子癇前期病理變化和臨床癥狀。其中患者外周血白細(xì)胞、單核細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞活素、彈性蛋白以及其他蛋白酶，進(jìn)一步加重內(nèi)皮細(xì)胞的損傷，氧自由基和脂質(zhì)過氧化物能抑制前列環(huán)素的產(chǎn)生，增加txa2、no的產(chǎn)生并改變血管通透性，而血管通透性的改變導(dǎo)致臨床上患者表現(xiàn)為水腫和蛋白尿?，F(xiàn)有技術(shù)中顯示血清miRNA在子癇前期患者診斷和預(yù)測(cè)中具有的可行性。由于樣本量較小，研究的重復(fù)性較差，同時(shí)由于研究方法的局限性，未能獲得有臨床意義的結(jié)果。也有應(yīng)用miRNA基因芯片技術(shù)檢測(cè)尋常型銀屑病患者外周血單個(gè)核細(xì)胞與正常人PBMC中差異性表達(dá)的miRNAs，并對(duì)部分差異性miRNAs進(jìn)行熒光實(shí)時(shí)定量PCR驗(yàn)證。研究結(jié)果提示miRNA-146a、miRNA-99a水平與PV皮損癥狀嚴(yán)重程度密切相關(guān)，可以作為判斷病情和臨床療效的生物學(xué)指標(biāo)之一。目如研究表明，子痛如期患者外周血白細(xì)胞的基因表達(dá)與正常妊娠存在著很大的差異，表明子癇前期是一個(gè)復(fù)雜的病理生理過程，涉及細(xì)胞免疫、代謝、細(xì)胞周期、信號(hào)傳導(dǎo)等廣泛和多層次的變化。以上研究表明，子癇前期患者外血白細(xì)胞的miRNA表達(dá)異?？赡艹蔀樵\斷的重要標(biāo)志物和靶向治療新途徑。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明的目的是提供人類子癇前期發(fā)生相關(guān)的外周血白細(xì)胞miRNA標(biāo)志物。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供上述miRNA標(biāo)志物的應(yīng)用。
[0007]本發(fā)明由如下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的:人類子癇前期發(fā)生相關(guān)的外周血白細(xì)胞miRNA標(biāo)志物，選自 has-miR-15a_3p、has-miR-31_3p、has_miR-451a、has-miR-122_5p 中的多種。所述的外周血白細(xì)胞 miRNA 標(biāo)志物由 has-miR-15a_3p、has-miR-31_3p、has_miR-451a 和has-miR-122_5p 構(gòu)成。其中 has-miR-15a_3p 的序列為 SEQ ID N0.1, has-miR-31_3p 的序列為 SEQ ID N0.2，has-miR-451a 的序列為 SEQ ID N0.3，has-miR-122_5p 的序列為 SEQ IDN0.4。
[0008]所述的外周血白細(xì)胞miRNA標(biāo)志物在制備人類子癇前期診斷或監(jiān)測(cè)試劑中的應(yīng)用。所述試劑是能夠測(cè)定這些外周血白細(xì)胞microRNA標(biāo)志物在外周血白細(xì)胞中表達(dá)量的試劑。
[0009]本發(fā)明詳細(xì)描述如下:
系統(tǒng)收集完整的人群基礎(chǔ)信息和臨床資料，以標(biāo)準(zhǔn)操作程序(SOP)采集符合標(biāo)準(zhǔn)的血液樣本，并采用TRIz0I法提取外周血白細(xì)胞總RNA，采用miRNA高通量HiSeq2000測(cè)序，Genbank數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)結(jié)果,或?qū)⑼庵苎准?xì)胞總RNA逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA,采用Real-time qPCR方法進(jìn)行檢測(cè)。
[0010]具體來說研究的實(shí)驗(yàn)方法主要包括以下幾個(gè)部分:
一、研究對(duì)象納入和排除依據(jù)
A組:實(shí)驗(yàn)組，子癇前期患者5人，無其他全身性重大疾病出組:健康對(duì)照組:5人，無其他全身性重大疾??；兩組測(cè)序完成后做組間分析。
[0011]I組:正常年齡子癇前期患者(PE)組13人，平均年齡為25.69±1.32歲；2組:高齡子癇前期患者(PA)組13人，平均年齡為34.84±3.18歲；3組:子癇前期有合并癥(PC)組13人，平均年齡為30.08±2.65歲；4組:正常同時(shí)期孕婦(N)對(duì)照組13人，平均年齡為29.07 ±2.59歲。4組外周血白細(xì)胞總RNA逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，Real-time qPCR方法進(jìn)行檢測(cè)后分析結(jié)果。[0012]二、外周血白細(xì)胞的分離及前處理
1.外周血采集:采集參與患者8ml血液分別裝于EDTA采血管，采集完畢后，輕柔顛倒混勻10次，然后置于4°c冰箱暫存；
2.對(duì)采集的血樣離心，收集白細(xì)胞:4°C3000rpm/min離心15min,離心后樣本分層,將上層的血漿分裝于2mlDEPC-treated water處理過的凍存管中，采血管中保留少量血漿，用一次性吸管緊貼液面自上而下吸取中間的白細(xì)胞層:將上層剩余的血漿及白細(xì)胞層以下4mm內(nèi)的血細(xì)胞層一起吸取在2ml的EP管中；
3.除去紅細(xì)胞:將上述裝有白細(xì)胞樣品的2ml的EP管中加入1ml紅細(xì)胞裂解液，上下顛倒混勻，靜置IOmin,然后4°C, 12000~13000rpm/min離心2 min,棄去上層紅色清液,收集白色沉淀，如果紅細(xì)胞裂解不完全，重復(fù)上述裂解過程1-3次，直至離心后的沉淀顏色為白色；
4.將離心后的上清液倒掉,并用吸頭吸去殘留的液體。然后加入PBS溶液Iml輕輕吹打混勻；4°C, 12000~13000rpm/min離心5min ;棄去上清,加入1.5ml Trizol溶液輕輕吹打混勻，室溫放置5min，使其充分裂解；將裂解的樣品_80°C保存。
[0013]本發(fā)明實(shí)驗(yàn)中使用的PBS溶液來自鈕因華信科技發(fā)展有限公司，Trizol溶液來自Invitrogen 公司。
[0014]三、外周血白細(xì)胞總RNA提取
(1)將在_80°C冰箱 保存的已經(jīng)TRIzol裂解液處理的EP管取出，室溫151:~301:下放置5min ;按每1ml TRIzol加0.2ml氯仿的量加入氯仿，蓋上EP管蓋子，在手中用力震蕩15秒，室溫15°C~30°C下放置2~3min后，2°C~8°C 12000rpm/min離心15min ;取上層水相置于新EP管中，重復(fù)上述步驟，加入0.2ml氯仿抽提；
(2)取上層水相置于新的EP管中，按照每1mlTRIzol加0.5ml異丙醇的量加入異丙醇，室溫 15°C~30°C下放置 IOmin, 2°C~8°C 12000rpm/min 離心 IOmin ；
(3)棄上清，按每1mlTRIzol加Iml DEPC水配制的75%乙醇進(jìn)行洗滌，渦旋混合，2°C~8°C 7500rpm/min離心5min,棄上清，沉淀的RNA室溫下自然干燥；用RNase-free water溶解RNA沉淀；
(4)Nanodrop2000超微量分光光度計(jì)測(cè)RNA濃度及260/280比值；瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)總RNA質(zhì)量。
[0015]四、用miRNA高通量HiSeq2000測(cè)序，Genbank數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)結(jié)果
取提取的外周血白細(xì)胞總RNA,使其溶于DEPC-treated water (Ambion),濃度控制在25-500ng/ul，制備RNA文庫(kù)；通過RNA逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)得到cDNA樣品。
[0016]1.逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系和條件:首先加入0.5μ I RT-Primer(100yM)，65°C放置IOmin,離心冷卻至室溫后再依次加入:①5x first strand buffer 2.0 μ I IOmM dNTP0.6μ I IOOmM DTT I μ I Rnase OUT (40U/μ I) I μ 1，混勻后離心于 42°C 放置 3 分鐘，最后加入I μ I Superscript (200U/ μ I)，總體積為20 μ 1，混勻點(diǎn)離，42°C反應(yīng)I個(gè)小時(shí)再7°C變性15分鐘。
[0017]2.RT-PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系見表1，RT-PCR擴(kuò)增反應(yīng)條件見表2:
表1
【權(quán)利要求】
1.人類子癇前期發(fā)生相關(guān)的外周血白細(xì)胞miRNA標(biāo)志物，選自has-miR-15a_3p、has-miR-31_3p、has_miR-451a、has-miR-122_5p 中的多種。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的人類子癇前期發(fā)生相關(guān)的外周血白細(xì)胞miRNA標(biāo)志物，其特征在于:所述的外周血白細(xì)胞miRNA標(biāo)志物由has-miR-15a_3p、has-miR-31_3p、has_miR-451a 和 has-miR-122_5p 構(gòu)成。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的人類子癇前期發(fā)生相關(guān)的外周血白細(xì)胞miRNA標(biāo)志物，其特征在于:has-miR-15a-3p 的序列為 SEQ ID N0.l，has-miR-31_3p 的序列為 SEQ ID N0.2，has-miR-451a 的序列為 SEQ ID N0.3，has-miR-122_5p 的序列為 SEQ ID N0.4。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的外周血白細(xì)胞miRNA標(biāo)志物在制備人類子癇前期確定或監(jiān)測(cè)試劑中的應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】C12Q1/68GK103993015SQ201410219920
【公開日】2014年8月20日 申請(qǐng)日期:2014年5月23日 優(yōu)先權(quán)日:2014年5月23日
【發(fā)明者】王永紅, 郝敏, 楊元元, 王文君 申請(qǐng)人:山西醫(yī)科大學(xué)