一種從紅斑狼瘡病人外周血在中分離無自身抗原的單個核細(xì)胞的方法
【專利摘要】一種從紅斑狼瘡病人外周血在中分離無自身抗原的單個核細(xì)胞的方法，包括以下步驟：(1)從紅斑狼瘡患者的非發(fā)病期采集100ml外周靜脈血；(2)血液中分離得到單個核細(xì)胞：對抗凝處理后的血液進(jìn)行離心，離心后，得到上層血漿層和下層血細(xì)胞層吸掉上層血漿；(3)用混合酶消化液除去殘留抗原，凈化單個核細(xì)胞。本發(fā)明設(shè)計(jì)蛋白酶和DNA酶混合消化步驟，去除殘余紅斑狼瘡有毒物質(zhì)。
【專利說明】一種從紅斑狼瘡病人外周血在中分離無自身抗原的單個核細(xì)胞的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，具體為一種從紅斑狼瘡病人外周血在中分離無自身抗原的單個核細(xì)胞的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]紅斑狼瘡為全身性、慢性進(jìn)行性反復(fù)發(fā)作和緩解的典型自身免疫性結(jié)締組織病之一。女性發(fā)病多，可侵犯全身多臟器，免疫學(xué)技術(shù)的發(fā)展使早期輕型和不典型的病例能及時診治，因此除少數(shù)重癥或重要器官受損者外，有些病例可自行緩解，有些只呈一次性發(fā)作，經(jīng)數(shù)月或短暫病程后，癥狀完全消失。治療上由于合理應(yīng)用皮質(zhì)類固醇激素、免疫調(diào)節(jié)劑、血漿交換療法、中西醫(yī)結(jié)合等，紅斑狼瘡患者的十年存活率已達(dá)85%。近年有人認(rèn)為本病為病譜性疾病，其兩極為局限性盤狀紅斑狼瘡和系統(tǒng)性紅斑狼瘡，中間為亞急性皮膚型紅斑狼瘡和深部紅斑狼瘡，二者均可向兩端演變。
[0003]紅斑狼瘡的特征是自身抗原驅(qū)動和T細(xì)胞依賴性，疾病活動期往往有自身抗體滴度升高；這些自身抗體的靶抗原位于細(xì)胞(細(xì)胞核、細(xì)胞膜、細(xì)胞漿)的不同位壁，包括核蛋白粒子DNA和其他RNA，后者又包括小核糖核蛋白SnRNAs、胞漿RNA(SSA / Ro)、核糖體，以及帶負(fù)電荷的磷脂。促進(jìn)紅斑狼瘡發(fā)病和加重的因素如感染、妊娠、日曬、藥物等與自身抗體滴度升高密切相關(guān)。
[0004]細(xì)胞免疫治療療法是采集人體自身免疫細(xì)胞,經(jīng)過體外培養(yǎng),使其數(shù)量成千倍增多，靶向性殺傷功能增強(qiáng)，然后再回輸?shù)饺梭w來殺滅血液及組織中的病原體、癌細(xì)胞、突變的細(xì)胞，打破免疫耐受，激活和增強(qiáng)機(jī)體的免疫能力，兼顧治療和保健的雙重功，由于身體內(nèi)外原因形成的自身抗原，是紅斑狼瘡致病的外在根源，對紅斑狼瘡患者的治療和研究過程，需要研究分析自身抗原的起因和本質(zhì)，需要具有對自身抗原的處理能力。同時，基于細(xì)胞免疫治療技術(shù)在紅斑狼瘡治療中的應(yīng)用，獲取有用的無自身抗原污染的正常細(xì)胞，如外周血單核細(xì)胞等，將會對紅斑狼瘡治療產(chǎn)生重要作用?，F(xiàn)有分離外周血單個核細(xì)胞的方法主要采用密度梯度離心法，該技術(shù)僅用于常規(guī)血液單個核細(xì)胞的分離，為了從紅斑狼瘡患者的血液中分離出有效的無抗原、抗體物質(zhì)的單個核細(xì)胞，需要對該產(chǎn)物進(jìn)行消化處理。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明所解決的技術(shù)問題在于提供一種從紅斑狼瘡病人外周血在中分離無自身抗原的單個核細(xì)胞的方法，以解決上述【背景技術(shù)】中提出的問題。
[0006]本發(fā)明所解決的技術(shù)問題采用以下技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn):
[0007]—種從紅斑狼瘡病人外周血在中分離無自身抗原的單個核細(xì)胞的方法，包括以下步驟:
[0008](1)從紅斑狼瘡患者的非發(fā)病期采集100ml外周靜脈血
[0009]針對紅斑狼瘡患者，在患者病情穩(wěn)定期無癥狀時，使用醫(yī)療采血技術(shù)采取100ml血液到采血袋中，如果是初次患者，可以立即采血或者在癥狀穩(wěn)定后，使用醫(yī)療采血技術(shù)采取100ml血液到采血袋中，采血后的采血袋放入4°C環(huán)境中運(yùn)輸，2h內(nèi)使用；
[0010](2)血液中分離得到單個核細(xì)胞
[0011]I)取100ml抗凝處理后的血液，將血液分別加入到4個50ml無菌離心管中；
[0012]2)對抗凝處理后的血液進(jìn)行離心，離心后，得到上層血漿層和下層血細(xì)胞層吸掉上層血漿；
[0013]3)向該4個下層含血細(xì)胞的離心管中加入注射用生理鹽水，用移液器混勻； [0014]4)再取4支含有淋巴細(xì)胞分離液的離心管，緩慢的將血細(xì)胞混合液用移液器轉(zhuǎn)移到淋巴細(xì)胞分離液的上層；
[0015]5)進(jìn)行離心分層；
[0016]6)離心后將中間白膜層吸入到新的離心管中；
[0017]7)用注射用生理鹽水補(bǔ)液后，再次進(jìn)行離心，清洗單核細(xì)胞；
[0018]8)重新加入注射用生理鹽水，混勻后離心清洗單核細(xì)胞；
[0019](3)用混合酶消化液除去殘留抗原，凈化單個核細(xì)胞
[0020]I)準(zhǔn)備胰酶和膠原酶III的混合消化液，加入到步驟(2)中剩下的離心管中，吹勻，消化一段時間后，加入注射用生理鹽水，混勻后，進(jìn)行離心；
[0021]2)準(zhǔn)備DNA酶液，消化上一步剩下的細(xì)胞，再加入注射用生理鹽水，進(jìn)行離心清洗細(xì)胞；
[0022]3)最后得到的即無自身抗原的單個核細(xì)胞，用無血清培養(yǎng)液培養(yǎng)。
[0023]所述外周靜脈血必須按照醫(yī)院進(jìn)行醫(yī)療級別抗凝血處理。
[0024]所述單個核細(xì)胞是一類具有近似密度的細(xì)胞群，是血細(xì)胞層通過密度梯度分離法分離到的白膜層細(xì)胞，密度梯度分離法所用的分離液密度是1.077g / ml ο
[0025]所述注射用生理鹽水屬于醫(yī)療試劑，實(shí)驗(yàn)室可以使用磷酸鹽緩沖液(PBS)代替。
[0026]所述混合酶消化液有兩種，第一種為胰酶和膠原酶III的混合液，第二種為DNA酶，混合消化液中酶的作用是消化液體中細(xì)胞外的游離蛋白和DNA存在，包括可能致病的抗原和抗體，如自身抗原。
[0027]有益效果
[0028]本發(fā)明利用多酶消化法去除殘余紅斑狼瘡有毒物質(zhì):這里的消化液分兩步:第一步是蛋白消化步驟，主要消化酶類為:胰酶和膠原蛋白酶III，屬于常規(guī)的蛋白消化液，對組織細(xì)胞影響較小；第二步消化步驟為DNA消化酶,使用的是DNAase。
【具體實(shí)施方式】
[0029]下面將結(jié)合本發(fā)明實(shí)施例，對本發(fā)明實(shí)施例中的技術(shù)方案進(jìn)行清楚、完整地描述，顯然，所描述的實(shí)施例僅是本發(fā)明一部分實(shí)施例，而不是全部的實(shí)施例?；诒景l(fā)明中的實(shí)施例，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員在沒有做出創(chuàng)造性勞動前提下所獲得的所有其他實(shí)施例，都屬于本發(fā)明保護(hù)的范圍。
[0030]實(shí)施例1
[0031]一種從紅斑狼瘡病人外周血在中分離無自身抗原的單個核細(xì)胞的方法，包括以下步驟:[0032](I)從紅斑狼瘡患者的非發(fā)病期采集100ml外周靜脈血
[0033]針對紅斑狼瘡患者，在患者病情穩(wěn)定期無癥狀時，使用醫(yī)療采血技術(shù)采取100ml血液到采血袋中，如果是初次患者，可以立即采血或者在癥狀穩(wěn)定后，使用醫(yī)療采血技術(shù)采取100ml血液到采血袋中，采血后的采血袋放入4°C環(huán)境中運(yùn)輸，2h內(nèi)使用；
[0034](2)血液中分離得到單個核細(xì)胞
[0035]I)取100ml抗凝處理后的血液，將血液分別加入到4個50ml無菌離心管中；
[0036]2) 300g尚心IOmin,尚心后，得到上層血衆(zhòng)層和下層血細(xì)胞層吸掉上層血衆(zhòng)；
[0037]3)向該4個下層含血細(xì)胞的離心管中加入注射用生理鹽水，直到每管30ml混合液，用移液器混勻；
[0038]4)再取4支含15ml淋巴細(xì)胞分離液的50ml離心管，緩慢的將血細(xì)胞混合液用移液器轉(zhuǎn)移到淋巴細(xì)胞分離液的上層；
[0039]5) 400g 離心 2O 分鐘；
[0040]6)離心后將中間白膜層吸入到新的50ml離心管中；
[0041]7)用注射用生理 鹽水補(bǔ)液到45ml后，300g離心5分鐘，清洗單核細(xì)胞；
[0042]8)重新加入注射用生理鹽水45ml，混勻后離心清洗單核細(xì)胞；
[0043](3)用混合酶消化液除去殘留抗原，凈化單個核細(xì)胞
[0044]I)準(zhǔn)備37°C溫浴的0.25%胰酶和0.1 %膠原酶III的混合消化液1ml，加入到上一步剩下的50ml離心管中，吹勻，消化I分鐘后，加入45ml注射用生理鹽水，混勻后，200g，離心5分鐘；
[0045]2)準(zhǔn)備Iml于37°C溫浴的4%的DNA酶液，消化上一步剩下的細(xì)胞10分鐘。再加入45ml注射用生理鹽水，200g，5分鐘離心清洗細(xì)胞；
[0046]3)最后得到的即無自身抗原的PBMC細(xì)胞，用無血清培養(yǎng)液培養(yǎng)。
[0047]所述外周靜脈血必須按照醫(yī)院進(jìn)行醫(yī)療級別抗凝血處理。
[0048]所述單個核細(xì)胞是一類具有近似密度的細(xì)胞群，是血細(xì)胞層通過密度梯度分離法分離到的白膜層細(xì)胞，密度梯度分離法所用的分離液密度是1.077g / ml ο
[0049]所述注射用生理鹽水屬于醫(yī)療試劑，實(shí)驗(yàn)室可以使用磷酸鹽緩沖液(PBS)代替。
[0050]所述混合酶消化液有兩種，第一種為胰酶和膠原酶III的混合液，第二種為DNA酶，混合消化液中酶的作用是消化液體中細(xì)胞外的游離蛋白和DNA存在，包括可能致病的抗原和抗體，如自身抗原。
[0051]對于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言，顯然本發(fā)明不限于上述示范性實(shí)施例的細(xì)節(jié)，而且在不背離本發(fā)明的精神或基本特征的情況下，能夠以其他的具體形式實(shí)現(xiàn)本發(fā)明。因此，無論從哪一點(diǎn)來看，均應(yīng)將實(shí)施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本發(fā)明的范圍由所附權(quán)利要求而不是上述說明限定，因此旨在將落在權(quán)利要求的等同要件的含義和范圍內(nèi)的所有變化囊括在本發(fā)明內(nèi)。
[0052]此外，應(yīng)當(dāng)理解，雖然本說明書按照實(shí)施方式加以描述，但并非每個實(shí)施方式僅包含一個獨(dú)立的技術(shù)方案，說明書的這種敘述方式僅僅是為清楚起見，本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)將說明書作為一個整體，各實(shí)施例中的技術(shù)方案也可以經(jīng)適當(dāng)組合，形成本領(lǐng)域技術(shù)人員可以理解的其他實(shí)施方式。
【權(quán)利要求】
1.一種從紅斑狼瘡病人外周血在中分離無自身抗原的單個核細(xì)胞的方法，其特征是，包括以下步驟: (1)從紅斑狼瘡患者的非發(fā)病期采集100ml外周靜脈血 針對紅斑狼瘡患者，在患者病情穩(wěn)定期無癥狀時，使用醫(yī)療采血技術(shù)采取100ml血液到采血袋中，如果是初次患者，可以立即采血或者在癥狀穩(wěn)定后，使用醫(yī)療采血技術(shù)采取100ml血液到采血袋中，采血后的采血袋放入4°C環(huán)境中運(yùn)輸，2h內(nèi)使用； (2)血液中分離得到單個核細(xì)胞 1)取100ml抗凝處理后的血液，將血液分別加入到4個50ml無菌離心管中； 2)對抗凝處理后的血液進(jìn)行離心，離心后，得到上層血漿層和下層血細(xì)胞層吸掉上層血漿； 3)向該4個下層含血細(xì)胞的離心管中加入注射用生理鹽水，用移液器混勻； 4)再取4支含有淋巴細(xì)胞分離液的離心管，緩慢的將血細(xì)胞混合液用移液器轉(zhuǎn)移到淋巴細(xì)胞分離液的上層； 5)進(jìn)行離心； 6)離心后將中間白膜層吸入到新的離心管中； 7)用注射用生理鹽水補(bǔ)液后，再次進(jìn)行離心，清洗單核細(xì)胞； 8)重新加入注射用生理鹽水，混勻后離心清洗單核細(xì)胞； (3)用混合酶消化液除去殘留抗原，凈化單個核細(xì)胞 1)準(zhǔn)備胰酶和膠原酶III的混合消化液，加入到上一步中剩下的離心管中，吹勻，消化一段時間后，加入注射用生理鹽水，混勻后，進(jìn)行離心； 2)準(zhǔn)備DNA酶液，消化上一步剩下的細(xì)胞，再加入注射用生理鹽水，進(jìn)行離心清洗細(xì)胞； 3)最后得到的即無自身抗原的單個核細(xì)胞，用無血清培養(yǎng)液培養(yǎng)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種從紅斑狼瘡病人外周血在中分離無自身抗原的單個核細(xì)胞的方法，其特征是，所述外周靜脈血必須按照醫(yī)院進(jìn)行醫(yī)療級別抗凝血處理。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種從紅斑狼瘡病人外周血在中分離無自身抗原的單個核細(xì)胞的方法，其特征是，所述單個核細(xì)胞是一類具有近似密度的細(xì)胞群，是血細(xì)胞層通過密度梯度分離法分離到的白膜層細(xì)胞，密度梯度分離法所用的分離液密度是1.077g / ml ο
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種從紅斑狼瘡病人外周血在中分離無自身抗原的單個核細(xì)胞的方法，其特征是，所述注射用生理鹽水屬于醫(yī)療試劑，實(shí)驗(yàn)室使用磷酸鹽緩沖液代替。
5.根據(jù)權(quán)利要求1或4所述的一種從紅斑狼瘡病人外周血中分離無自身抗原的單個核細(xì)胞的方法，其特征是，所述混合酶消化液有兩種，第一種為胰酶和膠原酶III的混合液，第二種為DNA酶?；旌舷褐忻傅淖饔檬窍后w中細(xì)胞外的游離蛋白和DNA存在，包括可能致病的抗原和抗體。
6.根據(jù)權(quán)利要求5中所述的DNA酶可以是任何降解DNA，使其完全失去鏈狀結(jié)構(gòu)，且同時對細(xì)胞沒有影響的蛋白酶類，可以是一種或者多種酶的組合。
【文檔編號】C12N5/078GK103725647SQ201310500133
【公開日】2014年4月16日 申請日期:2013年10月13日 優(yōu)先權(quán)日:2013年10月13日
【發(fā)明者】易銀沙, 張萬明, 朱海強(qiáng), 鄒義洲, 許澎, 李娜, 劉彩云, 袁炳秋, 吳小寧 申請人:長沙贏潤生物技術(shù)有限公司