專(zhuān)利名稱(chēng)：一種外周血白細(xì)胞原位雜交實(shí)驗(yàn)新技術(shù)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種簡(jiǎn)便、穩(wěn)定的檢測(cè)外周血白細(xì)胞多種信息分子的信使核糖核酸(mRNA)表達(dá)的原位雜交實(shí)驗(yàn)技術(shù)。
目前，細(xì)胞內(nèi)mRNA表達(dá)的檢測(cè)尚缺少穩(wěn)定的原位雜交操作方法，由于結(jié)果的穩(wěn)定性差，使所獲數(shù)據(jù)的可靠性受到很大影響，甚至有時(shí)做不出結(jié)果，導(dǎo)致時(shí)間、人力、物力的浪費(fèi)。因此，檢測(cè)mRNA的原位雜交實(shí)驗(yàn)很難廣泛應(yīng)用于分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)與臨床醫(yī)學(xué)研究。另外，在臨床上原位雜交實(shí)驗(yàn)也受到組織取材難的限制。外周血是了解人體疾病的窗口，取標(biāo)本容易，便于推廣應(yīng)用。我們針對(duì)特定信息分子mRNA的表達(dá)，進(jìn)行了外周血白細(xì)胞原位雜交實(shí)驗(yàn)方法的探索。通過(guò)反復(fù)實(shí)驗(yàn)，建立了原位雜交流程，并使檢測(cè)方法取得了成功。
本發(fā)明的目的是為分子生物學(xué)、基礎(chǔ)與臨床醫(yī)學(xué)研究等提供一種簡(jiǎn)便、穩(wěn)定、實(shí)用的研究技術(shù)，以供用于多種信息分子mRNA的檢測(cè)。
本發(fā)明所用的探針為地高辛標(biāo)記的35個(gè)堿基的寡核苷酸三項(xiàng)探針；抗體為抗地高辛堿性磷酸酶；顯色底物為硝基四氮唑藍(lán)/5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸鹽(NBT/BCIP)。具體實(shí)施方法如下無(wú)菌取肝素抗凝血0.5ml，置于用0.1％焦碳酸二乙酯(DEPC)蒸餾水處理的離心管中，靜置2小時(shí)。取含白細(xì)胞的血漿0.1ml，用4％多聚甲醛10∶1固定3小時(shí)，離心4000轉(zhuǎn)/分，5分鐘，棄上清。0.05mol/L PBS洗滌2分，離心4000轉(zhuǎn)/分，5分鐘，棄上清，重復(fù)3次。0.05mol/L PBS 0.2ml混勻沉淀，涂片，37℃干燥過(guò)夜。
檢測(cè)白細(xì)胞mRNA的原位雜交流程①0.05mol/L維生素C 30分鐘(滅活內(nèi)源性堿性磷酸酶和過(guò)氧化物酶)②0.1mol/L PBS(pH7.2)3分鐘×2(洗去維生素C，調(diào)整pH至7.2)，蒸餾水洗一次(洗去PBS)③干燥涂片(表面剛干為度)④含探針的雜交液10ul(探針濃度為2ng/ul)，濕盒37℃過(guò)夜⑤2×SSC 30-37℃水浴中沖洗5分鐘×3⑥0.2×SSC 30-37℃水浴中沖洗10分鐘(⑤、⑥洗去非特異結(jié)合的探針)⑦封閉液室溫20分鐘，不洗(封閉抗體的非特異結(jié)合位點(diǎn))⑧稀釋的抗地高辛抗體-堿性磷酸酶[Anti-DIG-AP(抗體以封閉液1∶25稀釋)]10ul，濕盒37℃1小時(shí)⑨0.05mol/L PBS(pH7.2)沖洗，5分鐘×4(洗去非特異結(jié)合的抗體)；buffer1洗5分鐘(為堿性磷酸酶提供鎂離子和適宜的滲透壓)；buffer3洗5分鐘(為堿性磷酸酶提供適宜的pH環(huán)境)⑩稀釋的NBT/BCIP(用buffer3按1∶100稀釋)50ul，37℃避光顯色10-30分鐘，水洗，核固紅復(fù)染，水洗，水溶性封片劑封片。以檢測(cè)糖尿病人外周血白細(xì)胞誘導(dǎo)型一氧化氮合酶mRNA(iNOS-mRNA)及糖尿病人構(gòu)建型一氧化氮合酶mRNA(cNOS-mRNA)的表達(dá)為例，檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)(

圖1)。
圖1.健康人及糖尿病人外周血白細(xì)胞涂片iNOS-mRNA及糖尿病人cNOS-mRNA的表達(dá)。
A健康人外周血白細(xì)胞原位雜交片，胞漿中無(wú)iNOS-mRNA陽(yáng)性雜交信號(hào)，核固紅復(fù)染，100×10B糖尿病患者外周血白細(xì)胞原位雜交陽(yáng)性片，胞漿內(nèi)深藍(lán)色的陽(yáng)性雜交信號(hào)為iNOS-mRNA，核固紅復(fù)染，100×10C糖尿病患者外周血白細(xì)胞原位雜交陽(yáng)性片，胞漿內(nèi)深藍(lán)色的陽(yáng)性雜交信號(hào)為cNOS-mRNA，核固紅復(fù)染，100×10
權(quán)利要求
1.一種檢測(cè)外周血白細(xì)胞多種生物信息分子mRNA的原位雜交實(shí)驗(yàn)技術(shù)，所用探針為地高辛標(biāo)記的寡核苷酸探針。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的原位雜交實(shí)驗(yàn)技術(shù)，其標(biāo)本中內(nèi)源性堿性磷酸酶和過(guò)氧化物酶的滅活，采用0.05mol/L維生素C浸泡30分鐘處理。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的實(shí)驗(yàn)技術(shù)，其雜交前的處理，省略增加探針通透性和蛋白酶消化等步驟。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的實(shí)驗(yàn)技術(shù)，其雜交后用2×SSC于30-37℃水浴中沖洗5分鐘×3，和0.2×SSC于30-37℃水浴中沖洗10分鐘。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所屬的原位雜交實(shí)驗(yàn)技術(shù)，抗地高辛抗體-堿性磷酸酶用封閉液1∶25稀釋后，直接加入玻片上事先滴加的封閉液中。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種簡(jiǎn)便穩(wěn)定的檢測(cè)外周血白細(xì)胞多種生物信息分子mRNA的原位雜交實(shí)驗(yàn)技術(shù)。用原位雜交技術(shù)檢測(cè)細(xì)胞中的信使核糖核酸(mRNA)的表達(dá),要求較高的實(shí)驗(yàn)條件,目前尚缺少穩(wěn)定的操作方法,使該項(xiàng)技術(shù)在科研中應(yīng)用受限。外周血是了解疾病的窗口,取標(biāo)本容易,便于推廣應(yīng)用。本發(fā)明針對(duì)多種特定信息分子mRNA的表達(dá),進(jìn)行了外周血白細(xì)胞原位雜交實(shí)驗(yàn)方法的探索,改良了原位雜交流程,提供了一種簡(jiǎn)便、穩(wěn)定、實(shí)用的研究技術(shù)。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK1358866SQ0113527
公開(kāi)日2002年7月17日 申請(qǐng)日期2001年12月12日 優(yōu)先權(quán)日2001年12月12日
發(fā)明者李瑞峰, 魏樹(shù)珍 申請(qǐng)人:李瑞峰, 魏樹(shù)珍