快速制備人外周血淋巴細(xì)胞早熟凝集染色體的方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及快速制備人外周血淋巴細(xì)胞早熟凝集染色體的方法，其主要步驟包括：(1)、血樣經(jīng)植物凝血素處理后置于37℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)靜置45-90分鐘；(2)、將植物血凝素處理后的血樣中淋巴細(xì)胞置于含有秋水仙素、ATP、5％胎牛血清、CalyculinA以及CDK1/CyclinB的混合培養(yǎng)液中37℃培養(yǎng)3-12小時；(3)、細(xì)胞混合培養(yǎng)后，使用0.075mol?KCl低滲10-20分鐘；(4)、向含有低滲處理細(xì)胞的低滲液中加入固定液預(yù)固定1次，再加入固定液固定2次，每次固定10-15分鐘，最后將細(xì)胞懸于固定液中。本發(fā)明與常規(guī)早熟凝集染色體制備方法相比，大大縮短了時間，僅需要3-12小時。
【專利說明】快速制備人外周血淋巴細(xì)胞早熟凝集染色體的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于細(xì)胞遺傳學(xué)領(lǐng)域，具體涉及人外周血淋巴細(xì)胞早熟凝集染色體的制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002]早熟凝集染色體(Premature Condensed Chromosome, PCC)最經(jīng)典的概念是指將處于分裂期(M期)的細(xì)胞與處于細(xì)胞周期其他階段的細(xì)胞融合，其他期細(xì)胞的染色質(zhì)提早包裝成染色體。由于G1、S、G2的DNA復(fù)制狀態(tài)不同，早熟凝集的染色體的形態(tài)各異，如與M期細(xì)胞融合的Gl期的染色體為單線狀，S期為粉末狀，G2期染色體為雙線。
[0003]早熟凝集染色體PCC作為輻射劑量估算的方法，受到了廣泛的關(guān)注和認(rèn)可。早熟凝集染色體比常規(guī)染色體法具有很強(qiáng)的優(yōu)勢:①可誘導(dǎo)靜止期細(xì)胞的分裂，可大大增加分析細(xì)胞的數(shù)量，避免了常規(guī)染色體畸變分析中只對分裂期細(xì)胞進(jìn)行選擇性分析的不足；②得出的染色體損傷為原始損傷，有利于觀察到局部照射或“旁效應(yīng)”輻射能量在細(xì)胞內(nèi)的直接或間接沉積，增加了適用的劑量評估范圍，提高了方法的敏感性和結(jié)果的準(zhǔn)確性；?PCC操作簡便、省時，而常規(guī)染色體分析需要豐富的經(jīng)驗和熟練的技巧，且給出劑量的時間需4-5d，對大批傷員不能及時提供劑量估算。因此使用PCC用于估算受照人員的輻射劑量，在大劑量的輻射事故中，可以提供足夠的可供分析的染色體。④PCC還有其它優(yōu)勢，比如與受照劑量有嚴(yán)格的定量關(guān)系，以及用離體實驗建立的劑量效應(yīng)刻度曲線與整體實驗所得到的劑量效應(yīng)曲線無顯著性差異(Gotoh E, Tanno Y, Takakura K.Simple biodosimetry methodfor use in cases ofhigh—dose radiation exposure that scores the chromosomenumber ofGiemsa-stained drug-1nduced prematurely condensed chromosomes (PCC).1nt J Radiat Biol.2005，81(I):33-40.)。
[0004]但是早期的細(xì)胞融合 方法制備PCC細(xì)胞費(fèi)時、技術(shù)要求高、PCC產(chǎn)額低、不穩(wěn)定等限制了它作為生物劑量計的應(yīng)用。最近，一些具有促進(jìn)細(xì)胞分裂作用物質(zhì)的發(fā)現(xiàn)和應(yīng)用，取代了過去傳統(tǒng)PCC中的細(xì)胞融合技術(shù)，使制備PCC對技術(shù)的要求大為降低，縮短了分析時間，如岡田酸(okadaicacid)和花萼海綿誘癌素A(calyculin A)。岡田酸可使外周血淋巴細(xì)胞在Gl、G2和M期發(fā)生PCC，但是，誘導(dǎo)PCC過程中的淋巴細(xì)胞培養(yǎng)階段都需要至少48小時。calyculin A可誘導(dǎo)任一時相的細(xì)胞發(fā)生PCC，大大提高了可用于分析細(xì)胞的數(shù)目(Prasanna PG, Escalada ND, Blakely WF.1nduction of premature chromosomecondensation by a phosphataseinhibitor and a protein kinase in unstimulatedhuman peripheralblood lymphocytes:a simple and rapid technique to studychromosomeaberrations using specific whoIe-chromosome DNA hybrid.Mutat Res,2000,466(2):131-41.)，但誘導(dǎo)PCC過程中的淋巴細(xì)胞培養(yǎng)階段時間仍需大約48小時。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的在于建立快速制備人外周血淋巴細(xì)胞早熟凝集染色體的方法，以解決現(xiàn)有技術(shù)制備人外周血淋巴細(xì)胞早熟凝集染色體耗時長的問題。
[0006]本發(fā)明的目的可以通過采用以下技術(shù)方案來實現(xiàn):
[0007]快速制備人外周血淋巴細(xì)胞早熟凝集染色體的方法，包括如下步驟:
[0008](I)、植物凝血素處理(PHA):采集3_5ml血樣，向血樣中加入植物凝血素至終濃度80-120 μ g/ml，混勻后置于37°C恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)靜置45-90分鐘；
[0009](2)、混合培養(yǎng):將植物血凝素處理后的血樣離心，取中層分界處的淋巴細(xì)胞，置于含有 250μ g/ml 秋水仙素、10mmol/L ATP、5 % 胎牛血清、500nmol/L CalyculinA 以及
0.2mg/ml CDKl/CyclinB的混合培養(yǎng)液中，混勻后置于37°C恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)靜置培養(yǎng)3_12小時；
[0010](3)、細(xì)胞低滲處理:細(xì)胞混合培養(yǎng)后，離心棄上清，使用0.075molKC13-5ml低滲10-20分鐘；
[0011](4)、細(xì)胞固定:向含有低滲處理細(xì)胞的低滲液中加入0.5-lml固定液預(yù)固定，混勻后立即離心棄上清，再加入4-6ml固定液固定2次，每次固定10-15分鐘后離心棄上清，最后將細(xì)胞懸于0.5-lml固定液中；其中固定液是甲醇與冰醋酸按體積比為3: I配制。
[0012]其中，步驟⑵所述離心采用300_400rpm離心3-5分鐘；步驟⑶所述離心采用800-1000rpm離心8-10分鐘；步驟(4)所述離心米用800-1000rpm離心8-10分鐘。
[0013]本發(fā)明建立的快速制備人外周血淋巴細(xì)胞早熟凝集染色體的方法，其優(yōu)點在于制備PCC耗時短，其中人外周血淋巴細(xì)胞植物血凝素(PHA)處理后混合培養(yǎng)過程僅需3-12小時，比現(xiàn)有技術(shù)制備PCC過程中`的淋巴細(xì)胞培養(yǎng)時間(大約48小時)明顯縮短，從而為PCC的制備提供了快速途徑。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0014]圖1為淋巴細(xì)胞經(jīng)混合培養(yǎng)3小時后早熟凝集染色體M期分裂相圖。
[0015]圖2為淋巴細(xì)胞經(jīng)混合培養(yǎng)6小時后早熟凝集染色體M期分裂相圖。
[0016]圖3為淋巴細(xì)胞經(jīng)混合培養(yǎng)12小時后早熟凝集染色體M期分裂相圖。
【具體實施方式】
[0017]以下通過實施例詳細(xì)描述本發(fā)明提供的快速制備人外周血淋巴細(xì)胞早熟凝集染色體的方法。下面實施例中所涉及的生物技術(shù)沒有特別描述之處均采用細(xì)胞遺傳學(xué)常規(guī)技術(shù)，如《分子克隆實驗指南》中提供的常規(guī)技術(shù)方法。
[0018]實施例1:
[0019](I)、采集正常志愿者血樣3ml，向血樣中加入PHA(廣州市醫(yī)藥工業(yè)研究所)至終濃度80 μ g/ml,混勻后置于含5% CO2的37°C恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)靜置I小時；
[0020](2)、血樣在上述37 °C恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)靜置I小時后，經(jīng)300rpm離心3分鐘，取
0.5ml中層分界處血淋巴細(xì)胞,置于含有3ml 250 μ g/ml秋水仙素(sigma公司)、10mmol/LATP(sigma 公司)、5%胎牛血清、500nmolCalyculinA(sigma 公司)以及 0.2mg/ml 的 CDKl/CyclinB (細(xì)胞周期素依賴性激酶I/細(xì)胞周期素B，Invitrogen公司)混合培養(yǎng)液中，混勻后置于37°C恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)靜置3小時；
[0021](3)、淋巴細(xì)胞經(jīng)混合培養(yǎng)3小時后1000rpm離心10分鐘，加入5ml的0.075molKCl低滲液在含5% CO2的37 °C條件下低滲20分鐘；
[0022](4)、向含有低滲處理淋巴細(xì)胞的低滲液中加入0.5ml固定液預(yù)固定，混勻后立即1000rpm離心10分鐘棄上清，再加入5ml固定液固定2次,每次固定15分鐘后1000rpm離心10分鐘棄上清，最后將細(xì)胞懸于Iml固定液中；其中固定液是甲醇與冰醋酸按體積比為3: I配制。
[0023]在95°C溫度下于熱蒸汽上烘干制片，經(jīng)空氣干燥后用5%姬姆薩染色，顯微鏡觀察PCC指數(shù)和形態(tài)，圖1為淋巴細(xì)胞經(jīng)混合培養(yǎng)3小時后早熟凝集染色體M期分裂相圖。
[0024]實施例2:
[0025](I)、采集正常志愿者血樣3ml，向血樣中加入PHA(廣州市醫(yī)藥工業(yè)研究所)至終濃度100 μ g/ml,混勻后置于含5% CO2的37°C恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)靜置I小時；
[0026](2)血樣在上述37°C恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)靜置I小時后，經(jīng)400rpm離心3分鐘后，取
0.8ml中層分界處淋巴細(xì)胞，置于含有3ml 250 μ g/ml秋水仙素、10mmol/L ATP、5%胎牛血清、500nmol CalyculinA以及0.2mg/mlCDKl/CyclinB混合培養(yǎng)液中，混勻后置于37°C恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)靜置6小時；
[0027](3)淋巴細(xì)胞經(jīng)混合培養(yǎng)6小時后1000rpm離心10分鐘，加入5ml的0.075molKCl低滲液在含5% CO2的37 °C條件下低滲20分鐘；
[0028](4)、向含有低滲 處理淋巴細(xì)胞的低滲液中加入0.8ml固定液預(yù)固定，混勻后立即1000rpm離心10分鐘棄上清，再加入5ml固定液固定2次,每次固定10分鐘后1000rpm離心10分鐘棄上清，最后將細(xì)胞懸于0.5ml固定液中；其中固定液是甲醇與冰醋酸按體積比為3:1配制。
[0029]在95°C溫度下于熱蒸汽上烘干制片，經(jīng)空氣干燥后用5%姬姆薩染色，顯微鏡觀察PCC指數(shù)和形態(tài)，圖2為淋巴細(xì)胞經(jīng)混合培養(yǎng)6小時后早熟凝集染色體M期分裂相圖。
[0030]實施例3:
[0031](I)采集正常志愿者血樣5ml，向血樣中加入PHA(廣州市醫(yī)藥工業(yè)研究所)至終濃度100 μ g/ml，混勻后置于含5% CO2的37°C恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)靜置90分鐘；
[0032](2)血樣在上述37 °C恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)靜置90分鐘后，300rpm離心3分鐘，取0.5ml中層分界處淋巴細(xì)胞，置于含有3ml 250μ8/πι1秋水仙素、lOmmol/L ATP、5%胎牛血清、500nmol CalyculinA以及0.2mg/mlO)Kl/CyclinB混合培養(yǎng)液中，混勻后置于37°C恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)靜置12小時；
[0033](3)淋巴細(xì)胞經(jīng)混合培養(yǎng)12小時后800rpm離心10分鐘，加入4ml的0.075molKCl低滲液在含5% CO2的37 °C條件下低滲20分鐘；
[0034](4)、向含有低滲處理淋巴細(xì)胞的低滲液中加入Iml固定液預(yù)固定，混勻后立即800rpm離心10分鐘棄上清,再加入5ml固定液固定2次,每次固定10分鐘后800rpm離心10分鐘棄上清，最后將細(xì)胞懸于0.5ml固定液中；其中固定液是甲醇與冰醋酸按體積比為
3: I配制。
[0035]在95°C溫度下于熱蒸汽上烘干制片，經(jīng)空氣干燥后用5%姬姆薩染色，顯微鏡觀察PCC指數(shù)和形態(tài)，圖3為淋巴細(xì)胞經(jīng)混合培養(yǎng)12小時后早熟凝集染色體M期分裂相圖。
【權(quán)利要求】
1.快速制備人外周血淋巴細(xì)胞早熟凝集染色體的方法，其特征包括如下步驟: (1)、植物凝血素處理:采集3-5ml血樣，向血樣中加入植物凝血素至終濃度80-120 μ g/ml，混勻后置于37°C恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)靜置45-90分鐘； (2)、混合培養(yǎng):將植物血凝素處理后的血樣離心，取中層分界處的淋巴細(xì)胞，置于含有250 μ g/ml 秋水仙素、10mmol/L ATP、5%胎牛血清、500nmol/L CalyculinA 以及 0.2mg/ml⑶K/CyclinB的混合培養(yǎng)液中，混勻后置于37°C恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)靜置培養(yǎng)3_12小時； (3)、細(xì)胞低滲處理:細(xì)胞混合培養(yǎng)后，離心棄上清，使用0.075molKC13-5ml低滲10-20分鐘； (4)、細(xì)胞固定:向含有低滲處理細(xì)胞的低滲液中加入0.5-lml固定液預(yù)固定，混勻后立即離心棄上清，再加入4-6ml固定液固定2次，每次固定10-15分鐘后離心棄上清，最后將細(xì)胞懸于0.5-lml固定液中；其中固定液是甲醇與冰醋酸按體積比為3: I配制。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟(2)所述離心具體為:300-400rpm離心3-5分鐘。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟(3)所述離心具體為:800-1000rpm尚心8-10分鐘。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟(4)所述離心具體為:800-1000rpm尚心8-10分鐘。
【文檔編號】C12N5/0783GK103805564SQ201210444240
【公開日】2014年5月21日 申請日期:2012年11月9日 優(yōu)先權(quán)日:2012年11月9日
【發(fā)明者】劉青杰, 高玲, 陸雪, 陳德清 申請人:中國疾病預(yù)防控制中心輻射防護(hù)與核安全醫(yī)學(xué)所