人多能干細(xì)胞培養(yǎng)基及人多能干細(xì)胞的培養(yǎng)方法
【專利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種人多能干細(xì)胞培養(yǎng)基及人多能干細(xì)胞的培養(yǎng)方法。該人多能干細(xì)胞培養(yǎng)基包括基礎(chǔ)培養(yǎng)基和添加劑；基礎(chǔ)培養(yǎng)基為DMEM/F12培養(yǎng)基；添加劑包括碳酸氫鈉400～600μg/ml、硒酸鈉8～20ng/ml、重組人胰島素生長(zhǎng)因子10～30ng/ml、重組人堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子80～120ng/ml、重組人乳鐵蛋白7～13μg/ml、抗壞血酸50～70μg/ml以及重組人轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子1ng/ml～3ng/ml。本發(fā)明的培養(yǎng)基成分明確，品質(zhì)穩(wěn)定；不含動(dòng)物源成分，培養(yǎng)過(guò)程中不需要?jiǎng)游镌醇?xì)胞做飼養(yǎng)層，使培養(yǎng)的hES細(xì)胞和hiPS細(xì)胞在移植后不容易產(chǎn)生人體排斥反應(yīng)，且生長(zhǎng)效率高。
【專利說(shuō)明】人多能干細(xì)胞培養(yǎng)基及人多能干細(xì)胞的培養(yǎng)方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及生物醫(yī)學(xué)【技術(shù)領(lǐng)域】，具體而言，涉及一種人多能干細(xì)胞(hES/iPS)培養(yǎng)基及人多能干細(xì)胞的培養(yǎng)方法。
【背景技術(shù)】
[0002]1998 年，美國(guó) Wisconsin 大學(xué) Thomson (Thomson et al., 1998)等米用來(lái)自人工體外受精(in vitro ferlilization, IVF)的囊胚內(nèi)細(xì)胞團(tuán)，首先成功分離人胚胎干細(xì)胞(human embryonic stem cell,hES細(xì)胞)并培養(yǎng)建系。細(xì)胞具有高度自我更新能力，并能在體外培養(yǎng)條件下無(wú)限擴(kuò)增。同時(shí)，hES細(xì)胞還能在一定條件下，分化成三個(gè)胚層來(lái)源的各種細(xì)胞。因此，hES細(xì)胞廣泛應(yīng)用于再生醫(yī)學(xué)、藥物篩選及胚胎發(fā)育生物學(xué)的研究，從建立以來(lái)一直是當(dāng)今研究熱點(diǎn)。
[0003]日本學(xué)者中山申彌(Shinya Yamanaka)于2006年和2007年，首次通過(guò)導(dǎo)入四個(gè)轉(zhuǎn)錄因子(0ct4, Sox2, Klf4和c-Myc)的方法，分別成功將小鼠(Takahashi andYamanaka., 2006)和人(Takahashi et al., 2007)的皮膚成纖維細(xì)胞重編程為誘導(dǎo)多能干細(xì)胞(Induced Pluripotent Stem Cells, iPSCs),并因此獲得了 2012年的諾貝爾醫(yī)學(xué)和生理學(xué)獎(jiǎng)。hiPS細(xì)胞具備hES細(xì)胞的所有分化能力，并且沒(méi)有倫理問(wèn)題，在不久的將來(lái)會(huì)完全取代hES細(xì)胞，成為再生醫(yī)學(xué)的最主要細(xì)胞來(lái)源。
[0004]hES細(xì)胞和hiPS細(xì)胞的最初采用的培養(yǎng)條件，都需要明膠包被和飼養(yǎng)層細(xì)胞(小鼠胚胎成纖維細(xì)胞，mouse embryonic fibroblasts, MEF)的支持。此外,傳統(tǒng)培養(yǎng)基還采用成分復(fù)雜的敲除血清替代品(Knockout Serum Replacement, K0SR)作為主要的培養(yǎng)基添加劑。由傳統(tǒng)培養(yǎng)條件產(chǎn)生的hES細(xì)胞和hiPS細(xì)胞，因?yàn)殚L(zhǎng)期暴露在富含動(dòng)物制品的培養(yǎng)環(huán)境中，在移植后容易產(chǎn)生人體排斥反應(yīng)，不能作為合適的細(xì)胞來(lái)源。同時(shí)，傳統(tǒng)培養(yǎng)條件還很不穩(wěn)定，容易影響實(shí)驗(yàn)進(jìn)度和結(jié)果，造成損失。這主要是由于不同批次MEF的質(zhì)量差異較大，而購(gòu)買商品化MEF則極其昂貴，大多數(shù)培養(yǎng)者采用自制的MEF所致。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明旨在提供一種人多能干細(xì)胞(hES/iPS)培養(yǎng)基及人多能干細(xì)胞的培養(yǎng)方法，以解決現(xiàn)有技術(shù)中人多能干細(xì)胞(hES/iPS)因?yàn)殚L(zhǎng)期暴露在富含動(dòng)物制品的培養(yǎng)環(huán)境中，在移植后容易產(chǎn)生人體排斥反應(yīng)及現(xiàn)有技術(shù)中的培養(yǎng)體系嚴(yán)重影響人多能干細(xì)胞(hES/iPS)體外擴(kuò)增效能的技術(shù)問(wèn)題。
[0006]為了實(shí)現(xiàn)上述目的，根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)方面，提供一種人多能干細(xì)胞培養(yǎng)基。該人多能干細(xì)胞培養(yǎng)基包括基礎(chǔ)培養(yǎng)基和添加劑；其中，基礎(chǔ)培養(yǎng)基為DMEM/F12培養(yǎng)基；添加劑包括碳酸氫鈉400~600 μ g/ml、硒酸鈉8~20ng/ml、重組人胰島素生長(zhǎng)因子10~30ng/ml、重組人堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子80~120ng/ml、重組人乳鐵蛋白7~13 μ g/ml、抗壞血酸50~70 μ g/ml以及重組人轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子lng/ml~3ng/ml。
[0007]進(jìn)一步地，添加劑包括碳酸氫鈉520~580 μ g/ml、硒酸鈉12~16ng/ml、重組人胰島素生長(zhǎng)因子15~25ng/ml、重組人堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子90~110ng/ml、重組人乳鐵蛋白10~12 μ g/ml、抗壞血酸63~66 μ g/ml以及重組人轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子1.5ng/ml~2.5ng/ml。
[0008]進(jìn)一步地，添加劑包括碳酸氫鈉543 μ g/ml、硒酸鈉14ng/ml、重組人胰島素生長(zhǎng)因子20ng/ml、重組人堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子100ng/ml、重組人乳鐵蛋白11 μ g/ml、抗壞血酸65 μ g/ml以及重組人轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子2ng/m。
[0009]進(jìn)一步地，基礎(chǔ)培養(yǎng)基保存在4~8°C，添加劑保存在-20~-80°C冰凍保存。
[0010]進(jìn)一步地，人多能干細(xì)胞培養(yǎng)基在使用前配制，具體包括以下步驟:在2~8°C化凍添加劑；將添加劑與基礎(chǔ)培養(yǎng)基以7:500的體積配混合后形成人多能干細(xì)胞培養(yǎng)基。
[0011]進(jìn)一步地，人多能干細(xì)胞培養(yǎng)基在使用前O~14天配制，并在2~8°C保存。
[0012]根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)方面，提供一種人多能干細(xì)胞的培養(yǎng)方法。該方法包括采用上述人多能干細(xì)胞培養(yǎng)基培養(yǎng)。
[0013]包括以下步驟:S1，將人多能干細(xì)胞接種到鋪有基質(zhì)膠或玻璃粘連蛋白的培養(yǎng)皿中；S2，向培養(yǎng)皿中加入人多能干細(xì)胞培養(yǎng)基，每隔一天換一次人多能干細(xì)胞培養(yǎng)基。
[0014]進(jìn)一步地，培養(yǎng)方法包括:S3，當(dāng)人多能干細(xì)胞匯合度達(dá)到70%~80%進(jìn)行傳代培養(yǎng)，使用0.5mM EDTA消化人多能干細(xì)胞為小團(tuán)塊，將小團(tuán)塊接種到鋪有基質(zhì)膠或玻璃粘連蛋白的培養(yǎng)皿中，用人 多能干細(xì)胞培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)。
[0015]進(jìn)一步地，步驟S2是在溫度為37°C，5% CO2的培養(yǎng)箱中進(jìn)行的。
[0016]本發(fā)明的人多能干細(xì)胞(hES/iPS)培養(yǎng)基成分明確，品質(zhì)穩(wěn)定；不含動(dòng)物源成分，培養(yǎng)過(guò)程中不需要?jiǎng)游镌醇?xì)胞做飼養(yǎng)層，使培養(yǎng)的hES細(xì)胞和hiPS細(xì)胞在移植后不容易產(chǎn)生人體排斥反應(yīng)，且生長(zhǎng)效率高。
【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0017]構(gòu)成本申請(qǐng)的一部分的說(shuō)明書(shū)附圖用來(lái)提供對(duì)本發(fā)明的進(jìn)一步理解，本發(fā)明的示意性實(shí)施例及其說(shuō)明用于解釋本發(fā)明，并不構(gòu)成對(duì)本發(fā)明的不當(dāng)限定。在附圖中:
[0018]圖1A至圖1D示出了實(shí)驗(yàn)一中實(shí)施例5的培養(yǎng)基培養(yǎng)人的ES細(xì)胞系H9的細(xì)胞形態(tài)圖、多能性標(biāo)記物染色圖和增殖曲線圖；
[0019]圖2A至圖2D示出了實(shí)驗(yàn)二中實(shí)施例5的培養(yǎng)基培養(yǎng)人的IPS細(xì)胞系HIPS的細(xì)胞形態(tài)圖、多能性標(biāo)記物染色圖和增殖曲線圖；
[0020]圖3A至圖3D示出了實(shí)驗(yàn)三中實(shí)施例5、對(duì)比例I和對(duì)比例2的培養(yǎng)基培養(yǎng)人的ES細(xì)胞系H9的細(xì)胞形態(tài)圖和增殖曲線圖；
[0021]圖4A至圖4D示出了實(shí)驗(yàn)三中實(shí)施例5、對(duì)比例I和對(duì)比例2的培養(yǎng)基培養(yǎng)人的IPS細(xì)胞系HIPS的細(xì)胞形態(tài)圖和增殖曲線圖。
【具體實(shí)施方式】
[0022]需要說(shuō)明的是，在不沖突的情況下，本申請(qǐng)中的實(shí)施例及實(shí)施例中的特征可以相互組合。下面將參考附圖并結(jié)合實(shí)施例來(lái)詳細(xì)說(shuō)明本發(fā)明。
[0023]現(xiàn)有技術(shù)中，hES細(xì)胞和hiPS細(xì)胞因?yàn)殚L(zhǎng)期暴露在富含動(dòng)物制品的培養(yǎng)環(huán)境中，在移植后容易產(chǎn)生人體排斥反應(yīng)，且血清替代品不同批次差異較大，很不穩(wěn)定，容易影響實(shí)驗(yàn)進(jìn)度和結(jié)果。
[0024]針對(duì)上述技術(shù)問(wèn)題，根據(jù)本發(fā)明一種典型的實(shí)施方式，提供了一種人多能干細(xì)胞培養(yǎng)基。該人多能干細(xì)胞培養(yǎng)基包括基礎(chǔ)培養(yǎng)基和添加劑；其中，基礎(chǔ)培養(yǎng)基為DMEM/F12培養(yǎng)基；添加劑包括碳酸氫鈉400~600 μ g/ml、硒酸鈉8~20ng/ml、重組人胰島素生長(zhǎng)因子10~30ng/ml、重組人堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子80~120ng/ml、重組人乳鐵蛋白7~13 μ g/ml、抗壞血酸50~70 μ g/ml以及重組人轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子lng/ml~3ng/ml。
[0025]本發(fā)明的人多能干細(xì)胞(hES/iPS)培養(yǎng)基成分明確，品質(zhì)穩(wěn)定；不含動(dòng)物源成分，培養(yǎng)過(guò)程中不需要?jiǎng)游镌醇?xì)胞做飼養(yǎng)層，使培養(yǎng)的hES細(xì)胞和hiPS細(xì)胞在移植后不容易產(chǎn)生人體排斥反應(yīng)，且生長(zhǎng)效率高。
[0026]優(yōu)選的，添加劑包括碳酸氫鈉520~580 μ g/ml、硒酸鈉12~16ng/ml、重組人胰島素生長(zhǎng)因子15~25ng/ml、重組人堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子90~110ng/ml、重組人乳鐵蛋白10~12 μ g/ml、抗壞血酸63~66 μ g/ml以及重組人轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子1.5ng/ml~
2.5ng/ml。
[0027]進(jìn)一步優(yōu)選的，添加劑包括碳酸氫鈉543 μ g/ml、硒酸鈉14ng/ml、重組人胰島素生長(zhǎng)因子20ng/ml、重組人堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子100ng/ml、重組人乳鐵蛋白11 μ g/ml、抗壞血酸65 μ g/ml以及重組人轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子2ng/ml。
[0028]根據(jù)本發(fā)明一種典型的實(shí)施方式，基礎(chǔ)培養(yǎng)基保存在4~8°C，添加劑保存在-20~-80-°C單獨(dú)冰凍保存。添加劑含有生長(zhǎng)因子，在-20~-80-°C保存可以保持穩(wěn)定在一年以上。
[0029]優(yōu)選的，人多能干細(xì)胞培養(yǎng)基在使用前配制，具體包括以下步驟:在2~8°C化凍添加劑；將添加劑與基礎(chǔ)培養(yǎng)基以7:500的體積配混合后形成人多能干細(xì)胞培養(yǎng)基。優(yōu)選的，人多能干細(xì)胞培養(yǎng)基在使用前O~14天配制，并在2~8°C保存。
[0030]根據(jù)本發(fā)明一種典型的實(shí)施方式，提供一種人多能干細(xì)胞的培養(yǎng)方法。該培養(yǎng)方法是采用上述人多能干細(xì)胞培養(yǎng)基培養(yǎng)。
[0031]優(yōu)選的，包括以下步驟:SI，將人多能干細(xì)胞接種到鋪有基質(zhì)膠或玻璃粘連蛋白的培養(yǎng)皿中；S2，向培養(yǎng)皿中加入人多能干細(xì)胞培養(yǎng)基，每隔一天換一次人多能干細(xì)胞培養(yǎng)基。在此種條件下培養(yǎng)細(xì)胞，更有利于細(xì)胞的生長(zhǎng)。
[0032]進(jìn)一步地，培養(yǎng)方法包括:S3，當(dāng)人多能干細(xì)胞匯合度達(dá)到70%~80%可以進(jìn)行傳代培養(yǎng)，使用0.5mM EDTA消化人多能干細(xì)胞為小團(tuán)塊，將小團(tuán)塊接種到鋪有基質(zhì)膠或玻璃粘連蛋白的培養(yǎng)皿中，用人多能干細(xì)胞培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)。
[0033]下面將結(jié)合實(shí)施例進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明的有益效果。
[0034]在下列實(shí)施例中，通過(guò)以下步驟配置(下文中沒(méi)有具體描述的實(shí)驗(yàn)條件，是采用本領(lǐng)域常規(guī)的實(shí)驗(yàn)條件進(jìn)行的):
[0035]添加劑:
[0036]第一步:配制各種成分的儲(chǔ)備液:①碳酸氫鈉75mg/ml、②硒酸鈉70 μ g/ml、③重組人胰島素生長(zhǎng)因子IOOng/μ L、④重組人堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子200ng/y 1、⑤重組人乳鐵蛋白50mg/ml、⑥抗壞血酸64mg/ml以及⑦重組人轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子IOOng/ μ L。
[0037]第二步:在室溫下將以上各種成分的儲(chǔ)備液按照以上儲(chǔ)備液編號(hào)順序依次混合，成為終濃度為碳酸氫鈉400~600 μ g/ml、硒酸鈉8~20ng/ml、重組人胰島素生長(zhǎng)因子O 10~30ng/ml、重組人堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子80~120ng/ml、重組人乳鐵蛋白7~13 μ g/ml、抗壞血酸(L-Ascorbic acid) 50~70 μ g/ml以及重組人轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子l_3ng/ml的工作液。
[0038]實(shí)施例1-5中的干細(xì)胞培養(yǎng)基的組分如表1所示。
[0039]表1
[0040]
【權(quán)利要求】
1.一種人多能干細(xì)胞培養(yǎng)基，其特征在于，包括基礎(chǔ)培養(yǎng)基和添加劑； 其中，所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基為DMEM/F12培養(yǎng)基； 所述添加劑包括碳酸氫鈉400~600 μ g/ml、硒酸鈉8~20ng/ml、重組人胰島素生長(zhǎng)因子10~30ng/ml、重組人堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子80~120ng/ml、重組人乳鐵蛋白7~13 μ g/ml、抗壞血酸50~70 μ g/ml以及重組人轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子lng/ml~3ng/ml。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的人多能干細(xì)胞培養(yǎng)基，其特征在于，所述添加劑包括碳酸氫鈉520~580 μ g/ml、硒酸鈉12~16ng/ml、重組人胰島素生長(zhǎng)因子15~25ng/ml、重組人堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子90~110ng/ml、重組人乳鐵蛋白10~12 μ g/ml、抗壞血酸63~66 μ g/ml以及重組人轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子1.5ng/ml~2.5ng/ml。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的人多能干細(xì)胞培養(yǎng)基，其特征在于，所述添加劑包括碳酸氫鈉543 μ g/ml、硒酸鈉14ng/ml、重組人胰島素生長(zhǎng)因子20ng/ml、重組人堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子100ng/ml、重組人乳鐵蛋白11 μ g/ml、抗壞血酸65 μ g/ml以及重組人轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子2ng/m。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的人多能干細(xì)胞培養(yǎng)基，其特征在于，所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基在4~8°C下保存，所述添加劑在-20~-80°C下冰凍保存。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的人多能干細(xì)胞培養(yǎng)基，其特征在于，所述人多能干細(xì)胞培養(yǎng)基在使用前配制，具體包括以下步驟: 在2~8 °C下化凍所述添加劑； 將所述添加劑與所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基以7:500的體積配混合后形成所述人多能干細(xì)胞培養(yǎng)基。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的人多能干細(xì)胞培養(yǎng)基，其特征在于，所述人多能干細(xì)胞培養(yǎng)基在使用前O~14天配制，并在2~8°C下保存。
7.一種人多能干細(xì)胞的培養(yǎng)方法，其特征在于，采用如權(quán)利要求1至6中任一項(xiàng)所述的人多能干細(xì)胞培養(yǎng)基培養(yǎng)。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的培養(yǎng)方法，其特征在于，包括以下步驟: SI，將人多能干細(xì)胞接種到鋪有基質(zhì)膠或玻璃粘連蛋白的培養(yǎng)皿中； S2，向所述培養(yǎng)皿中加入人多能干細(xì)胞培養(yǎng)基，每隔一天換一次所述人多能干細(xì)胞培養(yǎng)基。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的培養(yǎng)方法，其特征在于，所述培養(yǎng)方法進(jìn)一步包括: S3，當(dāng)所述人多能干細(xì)胞匯合度達(dá)到70%~80%時(shí)進(jìn)行傳代培養(yǎng)，使用0.5m MEDTA消化所述人多能干細(xì)胞為小團(tuán)塊，將所述小團(tuán)塊接種到鋪有基質(zhì)膠或玻璃粘連蛋白的培養(yǎng)皿中，用所述人多能干細(xì)胞培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)。
10.根據(jù)權(quán)利要求8所述的培養(yǎng)方法，其特征在于，所述步驟S2是在溫度為37°C，5%CO2的培養(yǎng)箱中進(jìn)行的。
【文檔編號(hào)】C12N5/074GK103952374SQ201410190561
【公開(kāi)日】2014年7月30日 申請(qǐng)日期:2014年5月7日 優(yōu)先權(quán)日:2014年5月7日
【發(fā)明者】李揚(yáng), 蘭峰, 李厚鵬 申請(qǐng)人:北京賽貝生物技術(shù)有限公司