一株鞘氨醇桿菌及其在藍藻水華控制中的應用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一株鞘氨醇桿菌及其在控制藍藻水華中的應用。從太湖水體中分離獲得了一株具有顯著溶藻活性的鞘氨醇桿菌(Sphingobacterium?sp.)Lzh-3，保藏號為CGMCC?No.8281，并且從其發(fā)酵產(chǎn)物中分離純化并鑒定出其有效溶藻成分六氫吡咯并[1,2-a]吡嗪-1,4-二酮和3-異丁基-6-甲基哌嗪-2,5-二酮，其中六氫吡咯并[1,2-a]吡嗪-1,4-二酮和3-異丁基-6-甲基哌嗪-2,5-二酮對銅綠微囊藻9110的半致死量LD50分別為5.7μg/mL和8.2μg/mL。可用于新型生物殺藻劑的研發(fā)和生產(chǎn)，最終應用于湖泊藍藻水華的控制。
【專利說明】一株鞘氨醇桿菌及其在藍藻水華控制中的應用
【技術領域】
[0001]本發(fā)明涉及環(huán)境微生物領域，特別涉及一株分泌溶藻物質(zhì)的鞘氨醇桿菌(Sphingobacterium sp.) Lzh-3及其在藍藻水華控制中的應用。
【背景技術】
[0002]近些年來由于水體富營養(yǎng)化，太湖爆發(fā)了嚴重的藍藻水華，造成的環(huán)境和經(jīng)濟問題日益突出，因此探索控制藍藻水華發(fā)生的有效途徑是非常必要的。
[0003]目前控制藍藻水華的方法可分為物理方法、化學方法和生物方法。但物理方法耗費大量人力物力，化學方法易造成二次污染，生物方法因其高效、專一、環(huán)境友好等優(yōu)點而得到越來越多的關注。之前的報道顯示溶藻菌導致了藍藻水華的消退，因此溶藻菌在控制藍藻水華方面具有很大的應用潛力。
[0004]因此，本領域的技術人員致力于篩選高效溶藻細菌或分離富集溶藻細菌代謝產(chǎn)生的高效溶藻活性物質(zhì)，以開發(fā)微生物殺藻劑，用以安全和高效的控制藍藻水華問題。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]鑒于現(xiàn)有控制藍藻水華技術中物理方法耗費大量人力物力、處理能力有限和化學方法容易造成二次污染的缺陷，本發(fā)明所要解決的技術問題是尋找高效溶藻細菌及分離富集溶藻細菌代謝產(chǎn)生的高效溶藻活性物質(zhì)，用以安全和高效的控制藍藻水華問題。
[0006]為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供了一株具有溶藻活性的鞘氨醇桿菌及其發(fā)酵產(chǎn)物在藍藻水華控制中的應用。
[0007]為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供的技術方案是:提供一株從太湖水體中分離獲得的具有溶藻活性的鞘氨醇桿菌(Sphingobacterium sp.) Lzh_3,該菌株屬革蘭氏染色陰性菌，細胞呈直桿狀，0.6~0.8 μ mX 0.6~4 μ m ;無鞭毛，少有滑行運動；過氧化氫酶陽性，化能異養(yǎng)，無特殊營養(yǎng)需求；室溫下放置數(shù)日后菌落通常呈淡黃色；不產(chǎn)生吲哚，不水解蛋白，不液化明膠，氧化糖醇類產(chǎn)酸。經(jīng)16srRNA基因序列分析和同源性比較,得知其與GenBank中某鞘氨醇桿菌菌株有99%的同源性，故鑒定為鞘氨醇桿菌屬細菌，命名為鞘氨醇桿菌Lzh-3ο
[0008]該菌株已經(jīng)保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏號CGMCC N0.8281，保藏日期為2013年9月27日。保藏機構地址:北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院中科院微生物研究所，郵編:100101，電話:86-10-64807355。該菌種的16S rRNA基因在GenBank中的登錄號是HQ896843。
[0009]進一步地，本發(fā)明提供了上述鞘氨醇桿菌Lzh-3在控制藍藻水華中的應用。
[0010]進一步地，本發(fā)明鞘氨醇桿菌Lzh-3在控制藍藻水華中的應用方式可以是通過其發(fā)酵產(chǎn)物，包括發(fā)酵液、發(fā)酵液濃縮物、發(fā)酵液粗提物或發(fā)酵液提取物。
[0011]鞘 氨醇桿菌Lzh-3發(fā)酵產(chǎn)物的制備步驟如下:
[0012]I)、發(fā)酵鞘氨醇桿菌Lzh-3菌株，獲得發(fā)酵液；[0013]2)、用萃取劑萃取發(fā)酵液，獲得萃取液；
[0014]3)、將萃取液蒸干，獲得粗提物；
[0015]4)、將粗提物溶于水后過濾；
[0016]5)、將步驟4)過濾后的濾液進一步提純得到多組分或單一組分的有效溶藻物質(zhì)，即為發(fā)酵液提取物。
[0017]優(yōu)選地，步驟I)中，發(fā)酵條件為，鞘氨醇桿菌Lzh-3接種于PH7.0的滅菌牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基中，28°C、200rpm環(huán)境條件下發(fā)酵48h。
[0018]優(yōu)選地，步驟2)中，萃取劑為乙酸乙酯，萃取體系中乙酸乙酯與發(fā)酵液的體積比為1:1，混合后，放入振蕩器中振蕩24h，分離出的上層乙酸乙酯溶液即鞘氨醇桿菌Lzh-3發(fā)酵液的萃取液。
[0019]優(yōu)選地,步驟3)中，過濾為使用0.22 μ m孔徑濾膜過濾。
[0020]優(yōu)選地，步驟4)中，進一步提純手段為組層析，具體為:將濾液通過半制備柱，用HPLC進行初步純化，得到溶藻成分；將得到的溶藻成分通過分析柱，用HPLC進行進一步純化，得到兩種有效溶藻成分S-3A和S-3B。
[0021]鞘氨醇桿菌Lzh-3的發(fā)酵產(chǎn)物中有效的溶藻成分S-3A和S_3B的化學結構通過LC-MS、GC-MG和NMR分析獲得。
[0022]有效溶藻成分S-3A的分子尚子峰為155.0820m/z,樣品分子量為154.0742,分子式為C7HltlN2O2，GC-MS分析結果顯示S-3A與GC-MS數(shù)據(jù)庫中六氫吡咯并[I，2_a]吡嗪-1，4- 二酮的結構相似，核磁共振氫譜結果是1H NMR (400MHz, D2O) 54.31 (dd, J =
11.5，4.7Hz, 1H)，4.15 (dd, J = 17.3，2.6Hz, 1H)，3.86 (d, J = 17.3Hz, 1H)，3.53 (dd, J =
8.7，4.8Hz, 2H), 2.31 (dd, J = 8.5, 3.2Hz, 1H)，2.05 (dd, J = 7.3, 3.2Hz, 1H)，1.94 (ddd, J =16.6，6.6，4.6Hz, 2H)。
[0023]有效溶藻成分S-3B的分子離子峰為185.1288m/z，樣品分子量為184.1212，分子式為C9H16N2O2, GC-MS分析結果顯示S-3B與已知文獻中3-異丁基-6-甲基哌嗪-2，5- 二酮的結構相似，核磁共振氫譜結果是1H NMR (400MHz, D2O) δ 4.16 (d, J =
7.2Hz, 2H)，1.74 (s, 3H)，1.49 (d, J = 7.1Hz, 3H)，0.95 (s, 6H)。
[0024]由此可以確定，上述鞘氨醇桿菌Lzh-3的發(fā)酵提取物中兩種具有溶藻活性的有效成分分別為具有結構式⑴的六氫吡咯并[l，2-a]吡嗪-1，4-二酮和具有結構式(II)的3-異丁基-6-甲基哌嗪-2，5- 二酮。
[0025]
【權利要求】
1.一株具有溶藻活性的鞘氨醇桿菌(Sphingobacterium sp.) Lzh_3,保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏號CGMCC N0.8281，保藏日期為2013年9月27曰。
2.如權利要求1所述的鞘氨醇桿菌Lzh-3在控制藍藻水華中的應用。
3.如權利要求1所述的鞘氨醇桿菌Lzh-3的發(fā)酵產(chǎn)物在控制藍藻水華中的應用。
4.一種具有結構式(II)所示結構的化合物在控制藍藻水華中的應用。
5.一種溶藻菌劑，其特征在于，所述溶藻菌劑中包含權利要求1所述的鞘氨醇桿菌(Sphingobacterium sp.)Lzh_3。
6.一種溶藻藥劑，其特征在于，所述溶藻藥劑中包含權利要求1所述的鞘氨醇桿菌(Sphingobacterium sp.)Lzh-3的發(fā)酵產(chǎn)物,所述發(fā)酵產(chǎn)物為發(fā)酵液、發(fā)酵液濃縮物、發(fā)酵液粗提物或發(fā)酵液提取物。
7.一種制備鞘氨醇桿菌Lzh-3發(fā)酵產(chǎn)物的方法，包括如下步驟: 1)、發(fā)酵權利要求1所述的鞘氨醇桿菌Lzh-3，獲得發(fā)酵液； 2)、用萃取劑萃取發(fā)酵液，獲得萃取液； 3)、將萃取液蒸干，獲得粗提物； 4)、將粗提物溶于水后過濾； 5)、將步驟4)過濾后的濾液進一步提純得到多組分或單一組分的有效溶藻物質(zhì)，即為發(fā)酵液提取物。
8.如權利要求7所述的方法，其中步驟I)中，發(fā)酵條件為，鞘氨醇桿菌Lzh-3接種于PH7.0的滅菌牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基中，28°C、200rpm環(huán)境條件下發(fā)酵48h。
9.如權利要求7所述的方法，其中步驟2)中，萃取劑為乙酸乙酯，乙酸乙酯與發(fā)酵液的體積比為1:1。
10.如權利要求7所述的方法，其中步驟4)中，所述進一步提純手段為:將濾液通過半制備柱，用HPLC進行初步純化，得到溶藻成分；將得到的溶藻成分通過分析柱，用HPLC進行進一步純化，得到單一組分的有效溶藻成分。
【文檔編號】C12R1/01GK103992970SQ201410190528
【公開日】2014年8月20日 申請日期:2014年5月7日 優(yōu)先權日:2014年5月7日
【發(fā)明者】楊虹, 李正華, 林升欽 申請人:上海交通大學