專利名稱：一種用肝素酶生產(chǎn)肝素寡糖的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于酶工程技術(shù)領(lǐng)域。主要涉及一種鞘胺醇桿菌(Sphingobacterium sp.HC-6155)CGMCC0660產(chǎn)生的肝素酶和應(yīng)用該酶生產(chǎn)具有抗平滑肌細胞增生活性肝素寡糖的酶工程技術(shù)。
肝素黃桿菌肝素酶也是目前唯一經(jīng)系統(tǒng)研究的肝素酶。Yang V.C.(1985)、Nader H.B.(1990)和Lohse D.L.(1992)都分別報道了肝素黃桿菌肝素酶的純化和性質(zhì)研究結(jié)果。已從肝素黃桿菌中分離純化出三個肝素酶，分別為肝素酶I、II和III。這三種肝素酶的酶學(xué)特性各不相同，酶I、II、III的分子量分別為42.8KD、84.1KD、70.8KD；等電點分別為pH8.5、pH9.0、pH10.0；最適作用溫度分別為35℃、40℃、45℃；最適作用pH分別為7.15、7.30、7.60。更重要的是它們的底物特異性和作用方式不同。肝素酶I是外切型的，具有連續(xù)外切肝素的活性，也含少量的內(nèi)切酶活性(＜10％)。肝素酶II是內(nèi)切型的，但底物專一性不高，既能作用肝素又能作用硫酸乙酰肝素，因而，這兩個酶作用底物的終產(chǎn)物都是二糖，沒有生物活性。肝素酶III是內(nèi)切型的，但只能作用硫酸乙酰肝素，不能降解肝素。擬桿菌肝素酶雖然也進行了純化，但性質(zhì)研究不系統(tǒng)。
肝素酶的用途有多種?？捎糜谠隗w外循環(huán)中肝素的消除、制備低分子肝素或活性肝素寡糖片段，也是肝素精確結(jié)構(gòu)的確定及其結(jié)構(gòu)與功能關(guān)系研究不可缺少的工具酶。
肝素是由糖醛酸(L-艾杜糖醛酸和D-葡萄糖醛酸)和D-葡萄糖胺以1→4糖苷鍵連接起來的大分子的糖胺聚糖(GAG)，其分子結(jié)構(gòu)極為復(fù)雜且不均一，至今其精確結(jié)構(gòu)仍不清楚。但是，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)與其復(fù)雜結(jié)構(gòu)相對應(yīng)的多種生物學(xué)功能。肝素作為抗凝劑和抗血栓藥物在臨床上已經(jīng)應(yīng)用60多年，近些年來，發(fā)現(xiàn)肝素具有抗平滑肌細胞增生、抗炎、抗腫瘤和調(diào)節(jié)脂代謝等生物活性。因此，肝素可用于預(yù)防和治療由外傷、器官移植、哮喘、高血壓、充血性心力衰竭、腎小球腎炎等疾病引起的平滑肌細胞增生，防止血管狹窄；預(yù)防和治療冠心病、動脈粥樣硬化、心肌梗塞、腦栓塞患者經(jīng)血管“搭橋術(shù)”、球囊擴充術(shù)、“按裝支架術(shù)”和“心內(nèi)或顱內(nèi)分流術(shù)”后由于受到刺激的平滑肌細胞迅速增殖引起的血管再狹窄癥；此外，小兒先天性心臟病患者由于血管平滑肌細胞延伸到肺的外周小動脈血管引起的不可逆性的肺動脈高壓，不做手術(shù)有生命危險，手術(shù)后引起平滑肌細胞增生，使血管再狹窄，也是致命的。因此，廣大患者迫切需求能抑制平滑肌細胞增生的藥物。但是，由于肝素具有抗凝活性，使用量大會引起出血和血小板減少等副作用，限制了肝素在這方面的臨床應(yīng)用。
Lippman M.M.(1977)報道的肝素的結(jié)構(gòu)與功能研究結(jié)果表明，肝素的抗增生活性與抗凝活性無關(guān)，只與肝素片段大小和所帶電荷有關(guān)。目前，國內(nèi)外均用化學(xué)方法制備保留抗凝活性的低分子肝素，Conrad H.E.(1995)發(fā)表了用化學(xué)方法制備具有抗平滑肌細胞增生活性肝素寡糖的專利，但至今沒實際應(yīng)用。由于化學(xué)法解聚肝素反應(yīng)劇烈，使肝素分子中的某些功能基團在反應(yīng)過程中或多或少地被破壞，因而，某些生物活性功能也不同程度地降低或喪失。因此，采用酶法制備低分子肝素或活性肝素寡糖片段，成為當今有關(guān)的糖生物學(xué)研究工作者的研究熱點。
由于肝素的分子結(jié)構(gòu)復(fù)雜又不均一，起抗凝作用的是肝素分子中不規(guī)則序列區(qū)域中的五糖序列，抗增生活性是由規(guī)則序列區(qū)域中高度硫酸化的部分決定的。因此，需要特異性很強的肝素酶。但是，目前有實用價值的肝素酶很少，肝素黃桿菌肝素酶是唯一的商品肝素酶，但價格昂貴(696美元/11單位，Sigma)，而且降解肝素產(chǎn)生的低分子肝素仍然保留很高的抗凝活性，不適用于制備低抗凝、高抗增生活性的肝素寡糖。本發(fā)明中由鞘胺醇桿菌產(chǎn)生的肝素酶II和肝素酶III能夠特異地作用肝素分子中起抗凝作用的不規(guī)則序列區(qū)域，保留了具有抗增生活性等生物活性的規(guī)則序列區(qū)域中高度硫酸化的部分。因此，本發(fā)明具有很好的應(yīng)用前景。
本發(fā)明中的產(chǎn)酶菌種是從土壤中分離篩選出的一株產(chǎn)生新型肝素酶的菌種。通過外部形態(tài)、生理生化反應(yīng)特征鑒定和根據(jù)以16s rRNA基因序列為基礎(chǔ)的系統(tǒng)發(fā)育學(xué)分析結(jié)果，確認該菌是未見報道的鞘胺醇桿菌屬的一個新種(Sphingobacterium sp.HC-6155)?，F(xiàn)已從這個菌中分離純化出三種肝素酶，即為肝素酶I、肝素酶II和肝素酶III。它們的酶學(xué)性質(zhì)分子量分別為96.8KD、68.0KD、70.1KD；最適作用溫度分別為37℃、45℃、49℃；最適作用pH分別為7.0、6.5、7.0；底物專一性、作用方式和終產(chǎn)物三種肝素酶都能作用肝素，酶I是外切型的，降解肝素的終產(chǎn)物是二糖。本發(fā)明可以用酶II68.0KD或/和酶III70.1KD為催化劑，以用于素為底物制備肝素寡糖，酶II和酶III是內(nèi)切型的，降解肝素的終產(chǎn)物為一系列的肝素寡糖，尤其是肝素酶III，能將肝素降解成較大的寡糖，并且保持了肝素分子中具有抗增生等生物活性的高度硫酸化區(qū)域的完整性，非常適用于具有抗增生活性肝素寡糖的制備。
1.產(chǎn)酶菌種和產(chǎn)酶條件通過富集培養(yǎng)、平板分離、天青A測定的方法，從土壤中選育出一株產(chǎn)生新型肝素酶的菌種，菌株代號為HC-6155，經(jīng)鑒定為鞘胺醇桿菌屬的一個新種(Sphingobactcrium sp.HC-6155)，并于2001年12月6日送交中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物菌種保藏中心(CGMCC)保藏，保藏號為CGMCC 0660。確定了培養(yǎng)基組成和培養(yǎng)條件。鞘胺醇桿菌CGMCC 0660在裝有50ml含蛋白胨1.5-2.0％、酵母粉或牛肉膏0.1-0.5％、蔗糖或葡萄糖1.5-2.5％、NaCl 0.1％、K2HPO40.25％，Na2HPO40.25％、MgCl2或MgSo40.05％、肝素0.1-0.2％，pH7.0-8.5培養(yǎng)基的500ml三角瓶中，于30-33℃，200轉(zhuǎn)/分的搖床上培養(yǎng)36小時。
2.鞘胺醇桿菌肝素酶的純化和酶學(xué)性質(zhì)利用超聲破碎細胞，得到的無細胞粗酶液先用DEAE-纖維素吸附。將DEAE-纖維素用0.02mol/L，pH6.8的磷酸緩沖液充分平衡，加入到粗酶液中吸附雜蛋白，通過離心收集上清液。然后再用羥基磷灰石吸附，將羥基磷灰石用0.02mol/L，pH6.8的磷酸緩沖液充分平衡，加入到經(jīng)DEAE-纖維素處理后的酶液中，離心收集沉淀，被吸附的酶用含1mol/L NaCl的相同緩沖液一次洗脫，洗脫液超濾濃縮并脫鹽，脫鹽后的肝素酶液通過用0.02 mol/L，pH6.8的磷酸緩沖液充分平衡的SP-Sepharose FF柱層析進一步純化，以含0-0.5mol/LNaCl線性梯度的相同緩沖液進行梯度洗脫，分離純化出三種肝素酶，分別為肝素酶I、肝素酶II和肝素酶III，再分別通過超濾濃縮得到三種濃縮的肝素酶。
3.抗平滑肌細胞增生活性肝素寡糖的制備和分離純化本發(fā)明所述的一種肝素酶生產(chǎn)肝素寡糖的方法是指以商品肝素為原料，用部分純化的肝素酶II或肝素酶III，在一定條件下降解肝素，制備肝素寡糖。用0.05mol/L，pH7.0的磷酸緩沖配制2％的肝素溶液，每克肝素用酶量為0.1單位，于20-30℃反應(yīng)，當A232為0.55-0.65時終止反應(yīng)。得到的反應(yīng)混合物經(jīng)截留分子量10000的濾膜超濾除去大分子的肝素和酶蛋白，再用截留分子量1000的膜超濾濃縮并脫鹽，得到平均分子量4500的肝素寡糖混合物?；旌细嗡毓烟峭ㄟ^Sephadex G-50柱進行分級分離，然后通過濃縮、凍干提取一系列部分純化的肝素寡糖。
圖2是肝素寡糖混合物經(jīng)Sephadex G-50柱層析的部分洗脫圖譜，圖中A、B、C、D、E、F峰分別為12-14糖、10-12糖、8-10糖、6-8糖、4-6糖和2-4糖。
圖3是肝素及肝素寡糖的抗凝活性示意圖，A、B、C、D、E、F、G、H分別表示肝素、肝素寡糖混合物及部分分級的4-6糖、6-8糖、8-10糖、10-12糖、12-14糖和14糖以上部分的抗凝活性。圖4是肝素及肝素寡糖對培養(yǎng)的人體主動脈平滑肌細胞增殖的抑制率。A、B、C、D、E、F、G分別表示肝素、肝素寡糖混合物及部分分級的4-6糖、6-8糖、8-10糖、10-12糖和12-14糖的抑制率。
實施例1.菌種培養(yǎng)和鑒定將產(chǎn)生肝素酶的菌株HC-6155接種在普通的牛肉汁斜面培養(yǎng)基上，于30℃培養(yǎng)48小時，再接入裝有50ml發(fā)酵培養(yǎng)基的500ml三角瓶中，在30℃，200轉(zhuǎn)/分的搖床上培養(yǎng)16小時，然后按2％的接種量轉(zhuǎn)接到裝50ml相同培養(yǎng)基的500ml三角瓶中，在相同條件下培養(yǎng)36小時。通過外部形態(tài)、生理生化反應(yīng)特征和分子生物學(xué)方法進行鑒定。該菌的外部形態(tài)為桿狀，不運動的革蘭氏陰性細菌，產(chǎn)生淺紫色色素，不利用檸檬酸、KNO3、吐溫、丙二酸等，不產(chǎn)生H2S氣體，能利用葡萄糖、蔗糖、阿拉伯糖、鼠李糖。并根據(jù)以16s rRNA基因序列為基礎(chǔ)的系統(tǒng)發(fā)育學(xué)分析結(jié)果，確認該菌種為鞘胺醇桿菌屬的一個新種(Sphingobacterium sp.HC-6155)。該菌株16s rRNA基因圖譜如序列表Seq.No.1所示。
2.酶活力測定按照Langer R.(1981)敘述的方法測定酶活力。粗酶采用天青A法。取適當稀釋的酶液100μl(控制肝素降解量不超過30％)，加入100μl 2％的肝素溶液(用含0.2mol/L NaCl的0.05mol/L，pH7.0的磷酸緩沖液配制)，36℃水浴中反應(yīng)1小時，加入3.8ml 0.05mol/L的HCI終止反應(yīng)。取100μl反應(yīng)液，加入4ml天青A溶液(50mg/L)，測定A505。根據(jù)標準曲線計算出肝素的降解量。酶活力單位定義在上述條件下，每小時降解1mg肝素所需要的酶量為1個酶活力單位。較純的酶用紫外吸收法測定。取100μl適當稀釋的酶液，加100μl 2％的肝素溶液，于36℃反應(yīng)30分鐘，加入3.8ml 0.05mol/L的HCI終止反應(yīng)，測A232。酶活力單位定義在上述條件下，每分鐘生成1μmol不飽和糖醛酸所需要的酶量(以不飽和糖醛酸的摩爾消光系數(shù)為5.1×103cm-1計算)。
3.蛋白含量的測定采用Bradford(1976)法，以牛血清白蛋白為標準。
4.肝素抗凝活性的測定采用冷煒主編的《肝素的生物測定》(1994)中敘述的豬血漿法。將肝素標準品和待測樣品分別用生理鹽水稀釋到3-8IU/ml，再按1∶0.8的比例分級稀釋為高中低三種不同的濃度。取12支潔凈的小試管，使標準品和待測樣品的高中低各濃度均為雙管。每支管各加入豬血漿0.8ml，在37℃水浴中保溫5分鐘，分別加入標準品和待測樣品0.1ml和1％CaCl20.1ml，迅速混勻并記時?；靹蚝蟮脑嚬芰⒓粗糜诤銣厮≈?，開始觀察并記錄各管的凝結(jié)時間。根據(jù)標準品和樣品的凝結(jié)時間計算出樣品的抗凝活性。
5.粘均分子量的測定采用楊春雷在《中國藥學(xué)雜志》(1995)中敘述的方法。通過測定不同濃度下肝素樣品的粘度η，推算出肝素樣品的特征粘度[η](樣品濃度為零時的粘度)。根據(jù)經(jīng)驗公式[η]＝3.2×10-5×Mr0.906計算出肝素樣品的平均分子量。
6.肝素酶的生產(chǎn)將鞘胺醇桿菌(Sphingobacterium sp.HC-6155)CGMCC 0660接種在普通牛肉汁斜面上，在30℃培養(yǎng)48小時。按已確定的發(fā)酵培養(yǎng)基組成(％)蔗糖2、蛋白胨1.5、酵母粉0.4、NaCl 0.1、K2HPO40.25、Na2HPO40.25、MgSO40.05、肝素0.2，pH8.0，配制5.5升培養(yǎng)基，其中500ml用于種子培養(yǎng)。按每瓶50ml分裝在500ml三角瓶中，1.05kg/cm2滅菌30分鐘。將在斜面上培養(yǎng)的種子接入裝有上述培養(yǎng)基的500ml三角瓶中，于30℃，200轉(zhuǎn)/分的搖床上培養(yǎng)16小時，然后按2％的接種量將種子液轉(zhuǎn)接到裝有相同培養(yǎng)基的500ml三角瓶中，在相同條件下培養(yǎng)36小時。培養(yǎng)液在4℃，10000轉(zhuǎn)/分離心10分鐘，收集菌體，并用0.02mol/L，pH6.8的磷酸緩沖液洗滌菌體2次。按0.2克濕菌體加1ml緩沖液的比例，將菌體懸浮在相同的緩沖液中，在冰浴中以脈沖方式超聲破碎細胞10分鐘。細胞破碎液在4℃，15000轉(zhuǎn)/分離心40分鐘，得無細胞粗提酶液，用天青A法測定酶活力，達4401單位/升發(fā)酵液。
7.酶的部分純化(1)DEAE一纖維素吸附取400ml用0.02mol，pH6.8的磷酸緩沖液平衡過并予冷到4℃的DEAE一纖維素(濕態(tài))加入到393ml粗酶液中，置于4℃1小時，并輕輕攪動，避免起泡沫。在4℃5000轉(zhuǎn)/分離心5分鐘，收集上清液528ml，測定酶活力和蛋白含量，比活力為10.37U/mg。
(2)羥基磷灰石吸附將50克經(jīng)酸堿處理過的羥基磷灰石用0.02mol/L，pH6.8的磷酸緩沖液充分平衡并予冷到4℃，加到經(jīng)DEAE-纖維素去雜后的酶液中，在4℃放置1小時，并不時地輕輕攪拌。然后，在4℃5000轉(zhuǎn)/分離心5分鐘，棄去上清，用4℃的相同緩沖液洗滌羥基磷灰石，至無蛋白檢出為止。用含有1mol/L NaCl的相同緩沖液一次洗脫，洗脫液在冰浴中超濾濃縮并脫鹽，得135ml酶液，比活力為20.8U/mg(天青A法測定)，紫外吸收法(A232)測定的比活力為0.94IU/mg，是粗酶液的4.7倍。而且酶的穩(wěn)定性大有提高，在4℃放置三個月，酶活性無明顯地變化。
(3)SP-Sepharose FF離子交換柱層析用0.02mol/L，pH6.8的磷酸緩沖液充分平衡SP-Sepharose柱(1.6×30cm)，將經(jīng)羥基磷灰石純化得到的132ml酶液(蛋白為2.4mg/ml，活力為1.92IU/ml)上柱，并用相同的緩沖液充分淋洗柱，至無蛋白檢出。用1200ml含0-0.5mol/L NaCl線性梯度的相同緩沖液進行梯度洗脫。流速為2ml/分，每管收集6ml(40管以后開始收集)，洗脫圖譜如

圖1所示。經(jīng)SP-Sepharose柱層析后出現(xiàn)三個肝素酶活峰，按洗脫順序分別稱為酶I、酶II和酶III。根據(jù)酶II和酶III降解肝素產(chǎn)生系列肝素寡糖的特性，將酶II和酶III的活性峰分別合并，然后超濾濃縮，得到部分純化的肝毒酶II和肝素酶III的濃縮酶液。
8.抗增生活性肝素寡糖的制備以商品肝素(160IU/mg)為原料，用0.05mol/L，pH7.0的磷酸緩沖液配制2％的肝素，按每克肝素加0.1單位酶的比例加入部分純化的肝素酶III，于25℃搖床上反應(yīng)，每隔8小時取出100μl反應(yīng)液，加3.9ml 0.05mol/L HCl終止反應(yīng)，測定A232。當A232為0.6時終止反應(yīng)。反應(yīng)液經(jīng)截留分子量10000的膜超濾除去大分子的肝素和酶蛋白等，濾液再用截留分子量1000的膜超濾濃縮并除鹽。然后，用75％的乙醇沉淀，離心收集沉淀并在真空下蒸發(fā)干，得到平均分子量4500左右的肝素寡糖混合物。
9.肝素寡糖的部分純化配制10％的混合肝素寡糖溶液，上予先用10％乙醇平衡過的Sephadex G-50柱(2.6×100cm)，用10％乙醇溶液洗柱，分部收集。流速為12ml/h，6ml/管，測定A232。通過Sephadex G-50凝膠排阻層析，將肝素寡糖混合物分級成聚合度分別為2-4、4-6、6-8、8-10、10-12、12-14和14糖以上的幾部分(圖2)。各部分通過旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮后凍干，得到白色粉末狀的肝素寡糖。
10.肝素寡糖抗凝活性和抗增生活性的檢測采用豬血漿法測定抗凝活性。以制備肝素寡糖的商品肝素(標準效價160IU/mg)為標準品，分別測定肝素、肝素寡糖混合物和部分分級的系列寡糖的抗凝活性。結(jié)果表明(圖3)，肝素寡糖混合物的抗凝活性只有商品肝素的25％，而部分純化的肝素寡糖的抗凝活性更低，4-6、6-8、8-10、10-12、12-14和14糖以上的肝素寡糖的抗凝活性分別是商品肝素的0.8％、2.4％、5.8％、10.6、19.4％和81％。由此可見，混合肝素寡糖的抗凝活性主要集中在14糖以上的部分。
采用3H標記胸腺嘧啶參入法測定肝素、肝素寡糖混合物和部分純化的系列寡糖對體外培養(yǎng)的胎兒主動脈平滑肌細胞增殖的影響，糖醛酸的濃度為70μg/ml，以培養(yǎng)液中不加肝素和寡糖的細胞為對照。結(jié)果表明(圖4)，未經(jīng)分離的平均分子量4500的混合肝素寡糖對人體主動脈平滑肌細胞增殖的抑制程度與商品肝素很接近，但是抗凝活性只是商品肝素的25％。部分純化的4-6、6-8、8-10、10-12、12-14五部分肝素寡糖對平滑肌細胞增殖均有抑制作用，其中的8-10糖(八糖或十糖)的抑制效果最好，對平滑肌細胞增殖的抑制率是商品肝素的121.9％，而抗凝活性只有商品肝素的5.8％，12-14糖也有抗增生活性，但抗凝活性也比較高。
序列表<110>中國科學(xué)院微生物研究所<120>一種用肝素酶生產(chǎn)肝素寡糖的方法<160>1<170>Patent In Version 3.1<210>1<211>1482<212>DNA<213>Sphingobacterium sp.HC-6155<400>1gatgaacgct agcggcaggc ctaatacatg caagtcgaac gggattacca ccagagcttg 60ctctggaggt atgagagtgg cgaacgggtg cgtaacgcgt atgcaacctg cccatgacag 120ggggatagcc cggagaaatc cggattaaga ccgcatgaca ctacagtatg gcatcatatt 180gtagtcaaat ctgaggaggt catggatggg catgcgtgcc attagctaat tggcggggta 240acggcccacc aaggcgacga tggctagggg atctgagagg attgcccccc acactggtac 300tgagacacgg accagactcc tacgggaggc agcagtaagg aatattggtc aatggaggga 360actctgaacc agccatgccg cgtgcaggat gactgcccta tgggttgtaa actgcttttg 420ttagggaata aacctttcta cgagtagaga gctgaatgta cctaaagaat aaggatcggc 480taactccgtg ccagcagccg cggtaatacg gaggatccga gcgttatccg gatttattgg 540gtttaaaggg agcgtaggcg gcctattaag tcagtggtga aagacggcag ctcaactgtc 600gcagtgccat tgatactgat gggctagaat gtagctgagg taggcggaatgtgacaagta 660gcggtgaaat gcatagatat gtcacagaac accgattgcg aaggcagctt gctaaactat 720aattgacgct gaggctcgaa agcgtgggta tcgaacagga ttagataccc tggtagtcca 780cgccctaaac gatgatgact cgatgttagc gatataccgt tagcgtccaa gcgaaagcgt 840taagttatcc acctggggag tacgtccgca agggtgaaac tcaaaggaat tgacgggggc 900ccgcacaagc ggaggagcat gtggtttaat tcgatgatac gcgaggaacc ttacccgggc 960ttgaaagtta ctgaagaacg cagagacgcg ttcgtccttc gggacaggaa actaggtgct1020gcatggctgt cgtcagctcg tgccgtgagg tgttgggtta agtcccgcaa cgagcgcaac1080ccctatgttt agttgccaac gagtaaagtc ggggactcta aacagactgc ccgcgcaagc1140ggagaggaag gatgggacga cgtcaagtca tcatggccct tacgtccggg gctacacacg1200tgctacaatg gtcggtacag agggccgcta cccagcaatg ggatgccaat ctcaaaaagc1260cgatcacagt tcggatcggg gcctgcaact cggccccgtg aagttggatt cgctagtaat1320cgcgtatcag caatgacgcg gtgaatacgt tcccgggcct tgtacacacc gcccgtcaag1380ccatggaaat tgggggtgcc taaagtccgt aaccgcaagg agcggcctag ggcaagaccg1440ataactgggg ctaagtcgta acaaggtagc cgtaccggaa gg 148權(quán)利要求
1.一種用微生物肝素酶生產(chǎn)肝素寡糖的方法，該方法涉及如下步驟一種用于生產(chǎn)肝素酶的鞘胺醇桿菌(Sphingobacterium sp.HC-6155)CGMCCNo 0660菌種及其培養(yǎng)；培養(yǎng)后的無細胞粗酶液的制備和通過吸附、離子交換層析法純化提取肝素酶；以肝素為底物，采用肝素酶在20-30℃恒溫條件下降解肝素，生成肝素寡糖混合物；通過凝膠過濾分離、蒸發(fā)濃縮和膜超濾濃縮、脫鹽提取肝素寡糖。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述的培養(yǎng)鞘胺醇桿菌(Sphingobacterium sp.HC-6155)CGMCC No 0660的培養(yǎng)基組成為蔗糖或葡萄糖1.5-2.5％、蛋白胨1.5-2.0％、酵母粉或牛肉膏0.1-0.5％、NaCl0.1％、K2HPO40.25％、Na2HPO40.25％、MgCl2或MgSO40.05％、肝素0.1-0.2％，pH7.0-8.5；培養(yǎng)溫度為30-33℃，200轉(zhuǎn)/分搖床培養(yǎng)36小時。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述的無細胞粗酶液的制備方法是采用在冰浴中以脈沖方式超聲破碎細胞。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述的離子交換吸附的方法，首先是采用DEAE-纖維素吸附的方法，將DEAE-纖維素用0.02mol/L，pH6.8的磷酸緩沖液充分平衡，加入到粗酶液中吸附雜蛋白，通過離心收集上清液。然后再用羥基磷灰石吸附，將羥基磷灰石用0.02mol/L，pH6.8的磷酸緩沖液充分平衡，加入到經(jīng)DEAE-纖維素處理后的酶液中，離心收集沉淀，被吸附的酶用含1mol/L NaCl的相同緩沖液一次洗脫，洗脫液超濾濃縮并脫鹽，脫鹽后的肝素酶液通過用0.02mol/L，pH6.8的磷酸緩沖液充分平衡的SP-Sepharose FF柱層析進一步純化，以含0-0.5mol/L NaCl線性梯度的相同緩沖液進行梯度洗脫，收集具有酶活性部分，通過超濾濃縮得到濃縮的肝素酶。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述的以肝素為底物制備肝素寡糖的方法，是采用酶分子量為68.0KD的肝素酶II或/和70.1KD肝素酶III為催化劑，用0.05mol/L，pH7.0的磷酸緩沖液配制2％的肝素為底物，每克肝素用酶量為0.1單位，于20-30℃反應(yīng)，當A232為0.55-0.65時終止反應(yīng)。反應(yīng)液用截留分量10000的膜超濾除去大分子的肝素和酶蛋白，再用截留分子量1000的膜超濾濃縮和脫鹽，最終得到平均分子量4500的肝素寡糖混合物。
6.根據(jù)權(quán)力要求5所述的方法，其中所述的肝素寡糖混合物通過Sephadex G-50進行分級分離，通過旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮、凍干，制得肝素寡糖。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，在制備肝素寡糖中的應(yīng)用。
8.根據(jù)權(quán)利要求2.3.4.5.和6所述的方法，任選其中一項或多項在制備肝素寡糖中的應(yīng)用。
全文摘要
一種用于生產(chǎn)肝素酶的鞘胺醇桿菌(Sphingobacterium sp.HC－6155)CGMCC No 0660菌種及其培養(yǎng)；培養(yǎng)后的無細胞粗酶液的制備和通過吸附、離子交換層析法純化提取肝素酶；以肝素為底物，采用肝素酶在20－30℃恒溫條件下降解肝素，生成肝素寡糖混合物；通過超濾和凝膠過濾進行分級分離和蒸發(fā)濃縮提取一系列具有抗平滑肌細胞增生活性而抗凝活性很低的肝素寡糖。
文檔編號C12P19/00GK1429913SQ0214806
公開日2003年7月16日 申請日期2002年10月24日 優(yōu)先權(quán)日2001年12月30日
發(fā)明者程秀蘭, 楊敬, 高寧國, 張樹政 申請人:中國科學(xué)院微生物研究所