專利名稱：Dna微陣列的質(zhì)量控制方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及DNA微陣列，更具體地涉及DNA芯片的質(zhì)量控制方法。
背景技術(shù)：
DNA微陣列指的是通過使寡核苷酸探針(每個(gè)探針具有幾個(gè)至數(shù)百個(gè)核苷酸的已知序列)固定在固體表面上的數(shù)百至成千上萬個(gè)適當(dāng)位置而制備的DNA芯片，其中所述固體表面由，例如，硅，表面-改性的玻璃，聚丙烯，或活化的聚丙烯酰胺制成。當(dāng)將待分析的靶DNA上樣于DNA芯片時(shí)，靶DNA的片段與固定于DNA芯片上的寡核苷酸探針互補(bǔ)雜交。通過光學(xué)或放射化學(xué)可以檢測(cè)和分析雜交，從而鑒定出靶DNA的核苷酸序列，這就是所謂的雜交測(cè)序(SBH)。
利用制備成微陣列的DNA芯片能使DNA分析系統(tǒng)的規(guī)模變小，并且能夠用極少量的樣品進(jìn)行遺傳學(xué)分析。另外，還可以同時(shí)分析靶DNA的多個(gè)序列，從而能經(jīng)濟(jì)快速地提供靶DNA的遺傳信息。DNA微陣列芯片可以在短時(shí)間內(nèi)分析大量遺傳信息，并可分析基因的相關(guān)性。因此，DNA芯片有望能廣泛應(yīng)用于例如遺傳疾病和癌癥的診斷，突變體和病原體的檢測(cè)，基因表達(dá)分析，藥物篩選等。此外，DNA芯片也可用作微生物或污染物的檢測(cè)器(detector)，以找出解毒基因，并進(jìn)一步基于基因重組技術(shù)大規(guī)模生產(chǎn)解毒劑。DNA芯片可大大改善包括藥用作物或低脂肉類生產(chǎn)在內(nèi)的大多數(shù)生物產(chǎn)業(yè)。
根據(jù)其表面所固定的探針類型，將DNA微陣列分為寡核苷酸-芯片(oligo-chip)和cDNA芯片。根據(jù)制備方法，可將DNA微陣列分為平版影印芯片(lithography chip)，針式點(diǎn)樣芯片(pin-type spotting chip)和噴墨式點(diǎn)樣芯片(ink-jet spotting chip)。根據(jù)固定化探針的類型，采用各式各樣的復(fù)雜的化學(xué)方法來制備DNA微陣列。由于極少量的DNA探針被固定于玻璃表面很小的區(qū)域內(nèi)，點(diǎn)與點(diǎn)和芯片與芯片之間探針的量有相當(dāng)大的差異，因此雜交結(jié)果不一致。
為了著手解決這一問題，有人提出了在雜交前對(duì)DNA芯片進(jìn)行質(zhì)量控制的技術(shù)。Brown等(“Quantitative Monitoring of Gene Expression Pattemswith a Complimentary DNA Microarray″M.Schena，D.Shalon，R.W Davis andP.O.Brown.Science 270467-470(1995).)研究出一種通過用激光掃描玻璃表面上因固定化DNA探針斑點(diǎn)中存在的鹽所導(dǎo)致的光散射，來檢查DNA探針斑點(diǎn)的均一性(uniformity)和玻璃表面損害的方法。該方法僅方便在DNA探針點(diǎn)樣后立即使用，在完成DNA芯片制備之后使用受限，因?yàn)辄c(diǎn)樣之后，通過固定化和清洗過程從DNA探針斑點(diǎn)中除去了鹽。
最近，有人研究出使用能與DNA探針結(jié)合的熒光材料染色玻璃表面上的DNA斑點(diǎn)(spot)的方法(Battaglia C，Salani G，Consolandi C，RossiBernardi L，De Bellis G.，Analysis of DNA Microarrays by Non-destructiveFluorescent Staining Using SYBR Green II，Biotechniques，2000 July，2978-81)。根據(jù)此方法，用對(duì)單鏈DNA(ssDNA)具有高親和力的熒光SYBR GreenII處理DNA芯片玻璃表面上固定化的DNA探針，并通過激光掃描進(jìn)行檢測(cè)。據(jù)報(bào)道，通過清洗可以完全除去與DNA探針結(jié)合的熒光材料。與Brown的方法相比，熒光染色方法可在芯片制備完畢之后用于檢查DNA微陣列，但染色和除去染料時(shí)需要多個(gè)清洗過程。不幸的是，清洗之后，熒光材料仍然很可能殘留在玻璃表面，從而會(huì)影響隨后的雜交過程。

發(fā)明內(nèi)容
因此，本發(fā)明提供了一種便利的，非破壞性的控制DNA微陣列上DNA斑點(diǎn)的質(zhì)量和大小的方法，該方法無需染色和除去染料的過程。
一方面，本發(fā)明的DNA芯片質(zhì)量控制方法包括制備含有熒光染料的DNA點(diǎn)樣溶液；將DNA點(diǎn)樣溶液點(diǎn)樣于基質(zhì)以制備DNA芯片；和檢測(cè)DNA斑點(diǎn)發(fā)出的熒光信號(hào)。


通過參照附圖詳細(xì)描述本發(fā)明例舉的實(shí)施方案，本發(fā)明的上述目的和優(yōu)點(diǎn)將更加顯而易見，其中圖1顯示了實(shí)施例1中進(jìn)行的，在與靶DNA雜交之前(質(zhì)量控制檢驗(yàn)(QCTest))和之后(應(yīng)用檢驗(yàn)(Use Test))對(duì)固定于DNA微陣列上的寡核苷酸探針斑點(diǎn)進(jìn)行掃描的結(jié)果；和圖2顯示了實(shí)施例2中進(jìn)行的，在與靶DNA雜交之前(QC Test)和之后(Use Test)對(duì)固定于DNA微陣列上的cDNA探針斑點(diǎn)進(jìn)行掃描的結(jié)果。
具體實(shí)施例方式
常規(guī)的DNA芯片質(zhì)量控制方法是將DNA探針點(diǎn)樣于DNA芯片基質(zhì)上，然后使熒光染料與DNA探針結(jié)合，與之不同的是，在本發(fā)明的DNA芯片質(zhì)量控制方法中，用熒光染料制備將要上樣于DNA芯片基質(zhì)的DNA點(diǎn)樣溶液，熒光染料與基質(zhì)表面共價(jià)結(jié)合，而DNA探針被固定于DNA芯片基質(zhì)上。DNA芯片制備完畢之后，掃描DNA斑點(diǎn)發(fā)出的熒光，從而非-破壞性地測(cè)定DNA斑點(diǎn)的均一性。
通過DNA探針斑點(diǎn)的直徑和外形以及熒光的強(qiáng)度，測(cè)定DNA探針斑點(diǎn)發(fā)出的熒光信號(hào)的均一性。
本發(fā)明所用熒光染料具有用于產(chǎn)生熒光信號(hào)的染料基團(tuán)(F)和與固體基質(zhì)共價(jià)結(jié)合的官能團(tuán)(R)，其結(jié)構(gòu)式如下所示 FFITC，熒光素，Cy3，Cy5，德克薩斯紅，TAMRAR胺，活化酯，異硫氰酸鹽，醛用于產(chǎn)生熒光信號(hào)的適當(dāng)染料基團(tuán)，對(duì)于用來標(biāo)記靶DNA，以便在DNA芯片制備完畢之后用于檢測(cè)雜交的染料沒有光譜干擾，其包括無光譜干擾作用的異硫氰酸熒光素(FITC)，熒光素，Cy3，Cy5，德克薩斯紅(Texas Red)，N，N，N’，N’-四甲基-6-羧基羅丹明(TAMRA)等。
根據(jù)DNA微陣列的類型，與固體基質(zhì)結(jié)合的官能團(tuán)應(yīng)能與固體基質(zhì)表面的官能團(tuán)，如胺，醛或聚-賴氨酸共價(jià)結(jié)合。熒光染料的適當(dāng)官能團(tuán)包括胺，異硫氰酸鹽(-NCS)，活化酯和醛。
可根據(jù)所用熒光染料的類型改變按上述制備的DNA芯片上的DNA斑點(diǎn)的質(zhì)量控制方法。例如，當(dāng)熒光染料的染料基團(tuán)是FITC或熒光素時(shí)，用氬離子激光可在波長(zhǎng)為488nm時(shí)激發(fā)該染料基團(tuán)，使用520nm波長(zhǎng)的濾光片可分析熒光信號(hào)。
本發(fā)明的DNA微陣列質(zhì)量控制方法可適用于另一種類型的微陣列，如RNA芯片或蛋白質(zhì)芯片。
下文將參照實(shí)施例詳細(xì)描述本發(fā)明。給出下列實(shí)施例是為了闡明本發(fā)明，并不想限制本發(fā)明的范圍。在下列實(shí)施例中，實(shí)驗(yàn)性地測(cè)定了，制備DNA芯片時(shí)與DNA探針一起被固定于基質(zhì)上的熒光染料，在DNA探針與經(jīng)熒光標(biāo)記的靶DNA在DNA芯片上雜交之后，是否會(huì)影響DNA斑點(diǎn)發(fā)出的熒光強(qiáng)度。使用了兩種DNA芯片，即寡核苷酸探針-固定化DNA芯片和cDNA-固定化DNA芯片。
實(shí)施例1寡核苷酸探針-固定化DNA芯片的斑點(diǎn)質(zhì)量控制A.使用凝膠基質(zhì)制備DNA-寡核苷酸芯片在凝膠基質(zhì)溶液中攪拌加入兩種寡核苷酸探針(精確匹配的(PM)-5’-TGTAGACACGCACCTCCGTG-3’；或錯(cuò)配的(MM)-5’-TGTAGACACCCACCTCCGTG-3’)和熒光染料4’-(氨基甲基)熒光素(0μM，1μM，和2μM)，于37℃放置14小時(shí)以形成基質(zhì)-DNA綴合物(conjugate)。將所得溶液用作點(diǎn)樣溶液。將點(diǎn)樣溶液點(diǎn)在經(jīng)處理已暴露出胺基團(tuán)的玻璃表面，于37℃的濕槽(wet chamber)中放置4小時(shí)。接著，對(duì)玻璃表面未加載點(diǎn)樣溶液的區(qū)域進(jìn)行處理，使該區(qū)域的胺基團(tuán)帶負(fù)電，從而防止靶DNA吸附于非一點(diǎn)樣區(qū)域，這是控制背景噪聲所必需的過程。為此，將5g琥珀酐溶解于315ml 1-甲基-2-吡咯烷酮(NMP)，在溶液中攪拌加入35ml硼酸鈉。用該溶液處理玻璃表面，用蒸餾水清洗并置于干燥器中。
用作熒光材料的4-(氨基甲基)熒光素具有下式 B.通過Cy3的熒光測(cè)定雜交敏感性使用掃描僅(ScanArray Scanner，GSI Lunonics)，以10-μm-象素的分辨率檢測(cè)經(jīng)熒光標(biāo)記的靶物質(zhì)發(fā)出的熒光信號(hào)，所述靶物質(zhì)與DNA微陣列上的探針雜交。使用GenePix軟件得出斑點(diǎn)的強(qiáng)度。
圖1顯示了在與靶DNA雜交之前掃描按上述使用凝膠基質(zhì)制備的DNA微陣列上斑點(diǎn)的結(jié)果(質(zhì)量控制(QC)檢驗(yàn)(Test))，以及與靶DNA雜交之后掃描DNA微陣列上斑點(diǎn)的結(jié)果(應(yīng)用檢驗(yàn)(Use Test))。
對(duì)QC Test而言，在掃描DNA斑點(diǎn)時(shí)，通過用氬離子激光在波長(zhǎng)為488nm時(shí)進(jìn)行掃描而激發(fā)DNA斑點(diǎn)，使用520nm波長(zhǎng)的濾光片獲得熒光發(fā)射信號(hào)。在Use Test中，與DNA斑點(diǎn)雜交的靶DNA在550nm處被激發(fā)，使用570nm波長(zhǎng)的濾光片獲得熒光發(fā)射信號(hào)。在Use Test中，將20個(gè)核苷酸長(zhǎng)的序列用作靶DNA，該序列中間(middle)具有對(duì)應(yīng)于肝細(xì)胞核因子(HNF)-1α基因外顯子4的密碼子264的核苷酸C(胞苷)堿基，5’-末端結(jié)合有Cy3，被表示為(5’-Cy3-CACGGAGGTGCGTGTCTACA-3’)。
如圖1所示，用精確匹配的和錯(cuò)配的探針各點(diǎn)9個(gè)斑點(diǎn)。斑點(diǎn)的直徑為170±15μm，將斑點(diǎn)之間的間隔調(diào)整為375μm。
C.實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖1所示，在Use Test中，與4’-(氨基甲基)熒光素一起被固定化的探針斑點(diǎn)的熒光強(qiáng)度與無染料的探針斑點(diǎn)的熒光強(qiáng)度沒有顯著差異。顯然，使用4’-(氨基甲基)熒光素不會(huì)影響靶DNA與探針斑點(diǎn)的雜交。
表1.QC Test和Use Test中使用凝膠基質(zhì)的DNA微陣列上的探針斑點(diǎn)的熒光強(qiáng)度

實(shí)施例2cDNA芯片的斑點(diǎn)質(zhì)量控制A.通過聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)擴(kuò)增探針基因使用DNA提取試劑盒(GAIGEN)分離能產(chǎn)生甘油醛孑-磷酸脫氫酶(GAPDH)的重組基因。在終體積為100μL的反應(yīng)溶液中，通過PCR選擇性擴(kuò)增經(jīng)分離的重組GAPDH基因。
使用50g純的重組GAPDHDNA，2.5U熱穩(wěn)定的DNA聚合酶，每種dNTP(dATP，dTTP，dGTP和dCTP)各200μM，50mM Tris-HCl，40mMKCl，1.5mMMgCl2，以及有義引物(5’-CTGGTAAGTTTAGTCTTTTTGTC-3’)和反義引物(5’-CAGTGCCAAGCTTGCATGCCT-3’)各100pmol。進(jìn)行35輪PCR循環(huán)，每輪循環(huán)包括94℃變性30秒，55℃退火60秒，和72℃延伸90秒。于94℃預(yù)變性5分鐘，最后于72℃再延伸5分鐘。使用DNA提取試劑盒(GAIGEN)純化擴(kuò)增子，并將其用作探針固定于玻璃基質(zhì)上。
B.點(diǎn)樣經(jīng)擴(kuò)增的GAPDH基因制備cDNA微陣列在兩個(gè)獨(dú)立的試管中將擴(kuò)增的GAPDH基因與50％ DMSO混合，使基因的終濃度為0.25mg/mL。在其中一個(gè)試管中加入FITC染料至終濃度為8uM。用Voltex混合器充分混合每個(gè)試管中的擴(kuò)增基因，DMSO和FITC染料。將試劑混合物轉(zhuǎn)移至384-孔板中以進(jìn)行點(diǎn)樣。以20×4的陣列將點(diǎn)樣溶液點(diǎn)在經(jīng)處理具有胺基團(tuán)的玻璃基質(zhì)上，80℃加熱4小時(shí)。接著，處理玻璃表面未加載點(diǎn)樣溶液的區(qū)域，使該區(qū)域的胺基團(tuán)帶負(fù)電，從而防止靶DNA吸附于非-點(diǎn)樣區(qū)域，這是控制背景噪聲所必需的過程。為此，將5g琥珀酐溶解于315ml1-甲基-2-吡咯烷酮(NMP)，在該溶液中攪拌加入35ml硼酸鈉。玻璃表面用該溶液處理，用蒸餾水清洗并置于干燥器中。
用作熒光染料的FITC具有下式 C.通過PCR制備經(jīng)熒光標(biāo)記的靶DNA將上述實(shí)驗(yàn)中使用DNA提取試劑盒分離得到的，產(chǎn)生GAPHD的重組基因用于制備經(jīng)熒光標(biāo)記的靶DNA。在終體積為50μL的反應(yīng)溶液中，通過PCR選擇性擴(kuò)增經(jīng)分離的重組GAPDH基因。
使用50g純的重組GAPDHDNA，2.5U熱穩(wěn)定性的DNA聚合酶，每種dNTP(dATP，dGTP，和dCTP)200μM，65μM dTTP，130μMCy3-dUTP，50mMTris-HCl，40mMKCl(pH8，3)，1.5mMMgCl2，以及有義引物(5’-CTGGTAAGTTTAGTCTTTTTGTC-3’)和反義引物(5’-CAGTGCCAAGCTTGCATGC CT-3’)各為100pmol。按照與上述實(shí)驗(yàn)相同的條件進(jìn)行PCR。擴(kuò)增子使用DNA提取試劑盒(GAIGEN)純化，通過分光光度法測(cè)定其濃度。為了保持雜交的有效性，將純化的GAPDH DNA的濃度恒定地調(diào)節(jié)至50ng/μL。在PCR過程中，通過加入Cy3-dUTP，用Cy3對(duì)GAPDH基因靶DNA進(jìn)行熒光標(biāo)記，所述靶DNA包括600個(gè)堿基對(duì)。
D.經(jīng)熒光標(biāo)記的靶DNA與cDNA微陣列雜交于50℃，在4X SSC(標(biāo)準(zhǔn)的鹽水-檸檬酸鹽)，0.1％ SDS(十二烷基硫酸鈉)，和10mg/mL BSA(牛血清白蛋白)的溶液中，將按上述制備的cDNA芯片預(yù)雜交45分鐘，并用異丙醇和純水洗滌。通過以500rpm離心3分鐘從cDNA芯片上除去水。
于95℃將1μg上述實(shí)驗(yàn)中制備的經(jīng)熒光標(biāo)記的靶DNA變性5分鐘，于冰上放置3分鐘，與3XSSC，0.1％SDS，0.5mg/mL酵母tRNA和30μg/mL鯡精(herring sperm)DNA的溶液混合，并滴在cDNA芯片上。用蓋玻片覆蓋cDNA芯片以便所述溶液擴(kuò)散，于50℃雜交過夜。于25℃用0.1XSSC(1.5mM檸檬酸鈉，15mMNaCl，pH7.0)和0.1％ SDS的溶液將芯片基質(zhì)洗滌1次，時(shí)間為5分鐘，并用0.1XSSC洗滌2次，每次5分鐘。接著，按照與上述相同的條件通過離心除去芯片基質(zhì)中的水。
E.通過Cy3的熒光測(cè)定雜交敏感性按照與實(shí)施例1相同的方法測(cè)定雜交敏感性。
圖2顯示了按上文所述進(jìn)行的，在與靶DNA雜交之前掃描cDNA微陣列上斑點(diǎn)的結(jié)果(QC Test)，和與靶DNA雜交之后掃描cDNA微陣列上斑點(diǎn)的結(jié)果(Use Test)。
對(duì)QC Test而言，在掃描DNA斑點(diǎn)時(shí)，通過用氬離子激光在波長(zhǎng)為488nm時(shí)進(jìn)行掃描而激發(fā)DNA斑點(diǎn)，使用520nm波長(zhǎng)的濾光片獲得熒光發(fā)射信號(hào)。在Use Test中，與DNA斑點(diǎn)雜交的靶DNA在550nm處被激發(fā)，使用570nm波長(zhǎng)的濾光片獲得熒光發(fā)射信號(hào)。
如圖2所示，在每個(gè)DNA芯片上點(diǎn)80個(gè)斑點(diǎn)。斑點(diǎn)的直徑為170±15μm，將斑點(diǎn)之間的間隔調(diào)整為375μm。
F.實(shí)驗(yàn)結(jié)果根據(jù)圖2的結(jié)果，比較兩種情況，即，使用FITC染料和不使用熒光染料時(shí)的熒光強(qiáng)度，結(jié)果示于下表2。
如表2所示，與FITC一起被固定的探針斑點(diǎn)的熒光強(qiáng)度與無染料的探針斑點(diǎn)的熒光強(qiáng)度沒有顯著差異。顯然，使用FITC不會(huì)影響靶DNA與探針斑點(diǎn)的雜交。
表2.QC Test和Use Test中使用GAPDH擴(kuò)增子的cDNA微陣列上探針斑點(diǎn)的熒光強(qiáng)度

如上所述，在本發(fā)明的DNA微陣列質(zhì)量控制方法中，檢測(cè)與DNA探針一起共價(jià)固定于DNA芯片固體表面的熒光染料所發(fā)出的信號(hào)，并將其用于DNA微陣列的質(zhì)量控制。與包括獨(dú)立染色過程的常規(guī)質(zhì)量控制方法相比，本發(fā)明的方法無需進(jìn)行染色和除去染料的過程。
此外，在與靶DNA雜交之后，與DNA探針一起共價(jià)結(jié)合于DNA芯片固體基質(zhì)上的熒光染料幾乎不會(huì)影響DNA斑點(diǎn)的熒光強(qiáng)度，從而消除了常規(guī)方法中熒光染料影響雜交的可能性。
通過上述方法制備的DNA微陣列無需染色過程即可進(jìn)行質(zhì)量控制，所述DNA微陣列可提供可靠的，穩(wěn)定的雜交結(jié)果。
與常規(guī)的質(zhì)量控制方法不同的是，由于熒光染料與DNA探針一起與玻璃芯片表面的反應(yīng)性基團(tuán)共價(jià)結(jié)合，熒光信號(hào)的強(qiáng)度不會(huì)受DNA探針序列和長(zhǎng)度的影響，從而能對(duì)不同的DNA探針斑點(diǎn)進(jìn)行準(zhǔn)確的質(zhì)量比較。
盡管參照本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方案具體顯示和描述了本發(fā)明，但本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)理解在形式和細(xì)節(jié)上的多種變化并不偏離所附權(quán)利要求書中限定的本發(fā)明的精神和范圍。
權(quán)利要求
1.DNA芯片的質(zhì)量控制方法，其包括制備含有DNA探針和第一種熒光染料的DNA點(diǎn)樣溶液，所述熒光染料具有特定的激發(fā)和發(fā)射波長(zhǎng)；將DNA點(diǎn)樣溶液上樣于DNA芯片基質(zhì)以形成DNA斑點(diǎn)，其中第一種熒光染料與基質(zhì)結(jié)合，和檢測(cè)DNA斑點(diǎn)發(fā)出的熒光信號(hào)。
2.權(quán)利要求1的質(zhì)量控制方法，其中第一種熒光染料對(duì)標(biāo)記靶DNA所用的第二種熒光染料的激發(fā)和發(fā)射波長(zhǎng)沒有光譜干擾。
3.權(quán)利要求1的質(zhì)量控制方法，進(jìn)一步包括測(cè)定所測(cè)熒光信號(hào)的均一性。
4.權(quán)利要求3的質(zhì)量控制方法，其中所測(cè)熒光信號(hào)的均一性通過DNA斑點(diǎn)的直徑和外形以及熒光信號(hào)的熒光強(qiáng)度來測(cè)定。
5.權(quán)利要求1的質(zhì)量控制方法，其中第一種熒光染料包括異硫氰酸熒光素(FITC)，熒光素，Cy3，Cy5，德克薩斯紅和N，N，N’，N’-四甲基-6-羧基羅丹明(TAMRA)。
全文摘要
本發(fā)明提供了DNA微陣列的質(zhì)量控制方法，其包括制備含有第一種熒光染料的DNA點(diǎn)樣溶液，所述熒光染料具有特定的激發(fā)和發(fā)射波長(zhǎng)，將DNA點(diǎn)樣溶液上樣于DNA芯片的基質(zhì)上以形成DNA斑點(diǎn)，其中第一種熒光染料與基質(zhì)結(jié)合，和檢測(cè)DNA斑點(diǎn)發(fā)出的熒光信號(hào)。在DNA微陣列的質(zhì)量控制方法中，由于與DNA探針一起共價(jià)結(jié)合于固體芯片表面的熒光染料發(fā)出的信號(hào)被用于質(zhì)量控制，因此無需進(jìn)行常規(guī)質(zhì)量控制方法中的染色和除去染料的過程。
文檔編號(hào)C12N15/09GK1443854SQ02147199
公開日2003年9月24日 申請(qǐng)日期2002年10月25日 優(yōu)先權(quán)日2002年3月7日
發(fā)明者趙俊衡, 許楠, 沈儲(chǔ)暎, 金敬姬, 樸佳永 申請(qǐng)人:三星電子株式會(huì)社