專利名稱：人工線蟲抗凝蛋白及其編碼基因與該基因的高效表達方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及基因工程領(lǐng)域中人工線蟲抗凝蛋白及其編碼基因與該基因的高效表達方法。
背景技術(shù)：
血栓是血管腔內(nèi)血液發(fā)生凝固或血液中的某些有形成分互相凝集形成的固體凝塊。影響血栓形成的因素可分為血管和血液兩大類。血管因素主要與血管內(nèi)膜的完整性受破壞有關(guān)。血液因素則包含多種凝血因子和血小板的互相作用，導(dǎo)致血液內(nèi)纖維蛋白的形成與聚集的血小板和其它有形成分共同形成血栓。血液內(nèi)的凝血因子包括因子I至因子XII等多種，其中最常見的抗凝藥物影響的是因子II、VII、IX和X。
干擾血液凝固過程的藥物，稱為抗凝藥，已被臨床上廣泛用于血栓塞性疾病的預(yù)防與治療。目前在臨床上使用的抗凝劑，如肝素，水蛭素，雙香豆素，抗凝血酶III等，使用過程中均顯示拌有一些不良反應(yīng)，如肝素所致的血小板減少性紫癜。因此，尋找新的有效的，且不良反應(yīng)少的抗凝劑具有重要意義。
從狗線蟲中提取的抗凝蛋白C2具有明顯的抗凝作用(見美國專利5866543)，其作用與抑制活化的因子VIIa有關(guān)，但對因子IIa(凝血酶)的活性無影響。該蛋白是由91個氨基酸殘基組成的多肽，可延長凝血時間，活性優(yōu)于肝素。目前該蛋白已通過生物提取和基因工程表達的方式獲得，但表達效率均較低，難以形成規(guī)模化生產(chǎn)。
畢赤酵母表達系統(tǒng)是用于表達外源蛋白的最成功的表達系統(tǒng)之一，近年來發(fā)展非常迅速，目前已有幾百種蛋白在該表達系統(tǒng)中得以表達。畢赤酵母是一種甲醇營養(yǎng)型酵母菌，其生長迅速，培養(yǎng)條件簡單，可以高密度連續(xù)培養(yǎng)，遺傳操作與釀酒酵母相似，技術(shù)已相當(dāng)成熟，是工業(yè)生產(chǎn)中常用的高表達菌種。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種新的人工合成的線蟲抗凝蛋白及其編碼基因。
本發(fā)明提供的線蟲抗凝蛋白，是具有序列表中序列4氨基酸殘基序列的蛋白質(zhì)，或者是將序列4的氨基酸殘基序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代、缺失或添加且具有與序列4的氨基酸殘基序列相同活性的由序列4衍生的蛋白質(zhì)。
序列表中序列4的蛋白質(zhì)由84個氨基酸殘基組成。
本發(fā)明選用了畢赤酵母菌優(yōu)選密碼子，并用計算機模擬計算了翻譯起始區(qū)和線蟲抗凝蛋白基因5’端二級結(jié)構(gòu)最小生成自由能，設(shè)計并合成了線蟲抗凝蛋白基因序列。
線蟲抗凝蛋白的編碼基因，是下列核苷酸序列之一1)序列表中序列1的DNA序列；2)與序列表中序列1限定的DNA序列具有90％以上同源性，且編碼相同功能蛋白質(zhì)的DNA序列。
序列表中序列1的DNA序列由255個核苷酸組成，編碼序列表中序列4的蛋白質(zhì)。
含有本發(fā)明線蟲抗凝蛋白編碼基因的表達載體、細胞系均屬于本發(fā)明的保護范圍。
本發(fā)明的第二個目的是提供一種高效表達上述人工合成的線蟲抗凝蛋白基因的方法。
為實現(xiàn)這一目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案線蟲抗凝蛋白基因的高效表達方法，是將上述人工合成的線蟲抗凝蛋白基因?qū)氲疆叧嘟湍妇?，表達獲得線蟲抗凝蛋白，具體的說包括以下步驟1)合成線蟲抗凝蛋白基因序列；2)將合成的基因片段與載體pPIC9K連接，得到表達質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化畢赤酵母菌后獲得表達工程菌；3)培養(yǎng)工程菌，表達產(chǎn)物分泌到培養(yǎng)液中，獲得目標蛋白。
為了使表達更加高效，畢赤酵母菌的表達過程中用甲醇進行誘導(dǎo)。誘導(dǎo)過程中的甲醇終濃度優(yōu)選為1％-5％。
用本發(fā)明的方法得到的線蟲抗凝蛋白占培養(yǎng)液總蛋白的92％以上，表達過程操作簡單，產(chǎn)品成本較低，可用于規(guī)?；a(chǎn)。
本發(fā)明的線蟲抗凝蛋白具有顯著的抗凝血作用，對于開發(fā)新的抗凝藥物具有重要意義。


圖1為本發(fā)明線蟲抗凝蛋白PCR擴增后的電泳圖譜。
圖2為載體pGEM-ACP2的圖譜。
圖3為pGEM-ACP2表達質(zhì)粒的圖譜。
圖4為pGEM-ACP2表達質(zhì)粒酶切凝膠電泳圖譜。
圖5為誘導(dǎo)前后培養(yǎng)液電泳圖。
圖6為目標產(chǎn)物的活性鑒定。
具體實施例方式
實施例1、表達基因的合成1、小片段的人工合成將序列1線蟲抗凝蛋白基因分為二段，第一段序列為cDNA正鏈，第二段序列為cDNA互補鏈。在第一段的3’端外加8個與第二段3’互補的堿基，總長150個堿基，為序列表中的序列2，在第二段的3’端外加8個與第一段3’端互補的堿基，總長147個堿基，為序列表中的序列3。在兩片段5’端分別加上NdeI和NotI酶切位點，用DNA合成儀合成。
將DNA合成儀合成的片段，用單一循環(huán)的PCR反應(yīng)連接合成序列1的全序列線蟲抗凝蛋白基因，如圖1所示，表明得到的序列正確。
實施例2、線蟲抗凝蛋白體外表達1、切取該PCR片段，裝入pGEM-T-EASY質(zhì)粒內(nèi)，構(gòu)建pGEM-ACP2克隆載體，其結(jié)構(gòu)圖譜如圖2所示。
2、pGEM-ACP2表達質(zhì)粒的構(gòu)建采用購自美國Invitrogen公司的高效表達質(zhì)粒pPIC9K，用NdeI和NotI分別酶切pGEM-ACP2質(zhì)粒和pPIC9K質(zhì)粒，凝膠電泳收集目標片段，用T4連接酶16℃過夜連接。經(jīng)常規(guī)方法的轉(zhuǎn)化，挑菌，擴增獲得表達質(zhì)粒pGEM-ACP2，其結(jié)構(gòu)圖譜如圖3所示。如圖4所示，酶切鑒定，證明表達質(zhì)粒的結(jié)構(gòu)正確。
3、將質(zhì)粒pGEM-ACP2用SacI線性化.采用浙江新芝公司電基因?qū)雰x，將線性化的pGEM-ACP2導(dǎo)入GS115畢赤酵母菌(購自Invitrogen公司)內(nèi)，經(jīng)培養(yǎng)，挑選，篩選等過程，獲得抗G418mg/ml的單克隆菌。
4、挑選單克隆菌，接種于5ml培養(yǎng)基中，30℃過夜，然后轉(zhuǎn)入250ml培養(yǎng)基中，繼續(xù)培養(yǎng)至OD600＝10-20，收集菌體，用無碳源培養(yǎng)基稀釋至OD600＝50，繼續(xù)培養(yǎng)24小時，加入甲醇至終濃度為1％誘導(dǎo)表達，每隔24小時加甲醇一次，至96小時。離心取上清液，進行凝膠電泳分析和功能測定。取10ml上清液，用12％SDS-PAGE電泳，并經(jīng)考馬斯亮蘭染色。結(jié)果可見，在15KD的位置，有誘導(dǎo)的蛋白表達，并根據(jù)BSA對照，估測表達量為150mg/L。
在本實施例中，培養(yǎng)單克隆菌體時用甲醇進行誘導(dǎo)意義很大，在沒有誘導(dǎo)之前，培養(yǎng)液中目標蛋白的含量很低，如圖5所示，誘導(dǎo)后的培養(yǎng)液中有顯著的目標蛋白帶，大小與序列4的蛋白相同，而誘導(dǎo)前的培養(yǎng)液中沒有顯著的目標蛋白帶。
實施例3、本發(fā)明線蟲抗凝蛋白的功能測定取5支試管，分別標為磷酸緩沖液、甲醇誘導(dǎo)前上清、甲醇誘導(dǎo)后上清1、上清2、上清3，加入對應(yīng)液體10ul/管，然后加入新鮮采集的兔動脈血90ul/管，混勻，記錄血液凝固時間，結(jié)果如圖6所示，其中血凝抑制率的計算公式為反應(yīng)1小時時，測定組血液凝固管數(shù)/磷酸緩沖液組血液凝固管數(shù)，磷酸緩沖液組和誘導(dǎo)前上清分別于1.62分和1.58分形成血凝塊，誘導(dǎo)后上清于12小時后仍無血凝塊形成，表明表達產(chǎn)物具有良好的抗凝活性。
序列表<160>4<210>1<211>255<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>
<400>1aaggctacca tgcagtgtgg tgagaatgag aagtacgact cctgcggtag caaggagtgt 60gacaagaagt gtaagtacga cggtgttgag gaggaggacg acgaggagcc aaatgtccca120tgcctagttc gtgtctgtca ccaagactgc gtttgcgagg agggtttcta cagaaacaag180gacgacaagt gtgtttctgc tgaggactgc gagcttgaca atatggactt catttaccca240ggtactcgaa actga 255<210>2<211>150<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>
<400>2gaagcttacg taaaggctac catgcagtgt ggtgagaatg agaagtacga ctcctgcggt 60agcaaggagt gtgacaagaa gtgtaagtac gacggtgttg aggaggagga cgacgaggag120ccaaatgtcc catgcctagt tcgtgtctgt 150<210>3<211>147<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>
<400>3attcgcggcc gctcagtttc gagtacctgg gtaaatgaag tccatattgt caagctcgca 60gtcctcagca gaaacacact tgtcgtcctt gtttctgtag aaaccctcct cgcaaacgca120gtcttggtga cagacacgaa ctaggca147<210>4<211>84<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>
<400>4Lys Ala Thr Met Gln Cys Gly Glu Asn Glu Lys Tyr Asp Ser Cys1 5 10 15Gly Ser Lys Glu Cys Asp Lys Lys Cys Lys Tyr Asp Gly Val Glu20 25 30Glu Glu Asp Asp Glu Glu Pro Asn Val Pro Cys Leu Val Arg Val35 40 45Cys His Gln Asp Cys Val Cys Glu Glu Gly Phe Tyr Arg Asn Lys50 55 60Asp Asp Lys Cys Val Ser Ala Glu Asp Cys Glu Leu Asp Asn Met65 70 75Asp Phe Ile Tyr Pro Gly Thr Arg Asn80 8權(quán)利要求
1.線蟲抗凝蛋白，是具有序列表中序列4氨基酸殘基序列的蛋白質(zhì)，或者是將序列4的氨基酸殘基序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代、缺失或添加且具有與序列4的氨基酸殘基序列相同活性的由序列4衍生的蛋白質(zhì)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的線蟲抗凝蛋白，其特征在于它是具有序列表中序列2氨基酸殘基序列的蛋白質(zhì)。
3.線蟲抗凝蛋白的編碼基因，是下列核苷酸序列之一1)序列表中序列1的DNA序列；2)與序列表中序列1限定的DNA序列具有90％以上同源性，且編碼相同功能蛋白質(zhì)的DNA序列。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的基因，其特征在于所述線蟲抗凝蛋白的編碼基因是序列表中序列1的DNA序列。
5.含有權(quán)利要求3或4所述基因的表達載體。
6.含有權(quán)利要求3或4所述基因的細胞系。
7.線蟲抗凝蛋白基因的高效表達方法，是將權(quán)利要求3的基因?qū)氲疆叧嘟湍妇校磉_獲得線蟲抗凝蛋白。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于包括以下步驟1)合成線蟲抗凝蛋白基因序列；2)將合成的基因片段與載體pPIC9K連接，得到表達質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化畢赤酵母菌后獲得表達工程菌；3)培養(yǎng)工程菌，表達產(chǎn)物分泌到培養(yǎng)液中，獲得目標蛋白。
9.根據(jù)權(quán)利要求7或8所述的方法，其特征在于畢赤酵母菌的表達過程中用甲醇進行誘導(dǎo)。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的方法，其特征在于誘導(dǎo)過程中的甲醇終濃度為1％-5％。
全文摘要
本發(fā)明公開了人工線蟲抗凝蛋白及其編碼基因與該基因的高效表達方法，本發(fā)明提供的線蟲抗凝蛋白，是具有序列表中序列4氨基酸殘基序列的蛋白質(zhì)，或者是將序列4的氨基酸殘基序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代、缺失或添加且具有與序列4的氨基酸殘基序列相同活性的由序列4衍生的蛋白質(zhì)。線蟲抗凝蛋白的編碼基因，是下列核苷酸序列之一1)序列表中序列1的DNA序列；2)與序列表中序列1限定的DNA序列具有90％以上同源性，且編碼相同功能蛋白質(zhì)的DNA序列。本發(fā)明的線蟲抗凝蛋白具有顯著的抗凝血作用，對于開發(fā)新的抗凝藥物具有重要意義。
文檔編號C12N15/81GK1498900SQ02146789
公開日2004年5月26日 申請日期2002年11月8日 優(yōu)先權(quán)日2002年11月8日
發(fā)明者劉鳳鳴, 折志剛 申請人:劉鳳鳴