專利名稱：改進的β-葡萄糖苷酶基因及其重組酶的制備的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種編碼β -葡萄糖苷酶基因及其重組質(zhì)粒和構(gòu)建方法，克隆、突變及其高效表達，涉及分子生物學(xué)、生物信息學(xué)、酶學(xué)以及基因工程等領(lǐng)域。具體涉及對原始黑曲霉的葡萄糖苷酶基因進行生物信息學(xué)分析和基因的定向改造，以及重組酶的制備。
背景技術(shù)：
β -葡萄糖苷酶(β -glucosidase)又稱β _D_葡萄糖苷水解酶，別名纖維二糖酶、 龍膽二糖酶和苦杏仁苷酶。是一種能催化水解芳基或烴基與糖基原子團之間的糖苷鍵生成葡萄糖的酶。葡萄糖苷酶按其底物特異性可以分為三類第一類是能水解烴基葡萄糖苷或芳香基-葡萄糖苷的酶，此類β -葡萄糖苷酶能水解的底物有纖維二糖、對硝基苯-β -D-葡萄糖苷等；第二類是只能水解烴基-β -葡萄糖苷的酶，這類β -葡萄糖苷酶能水解纖維二糖等；第三類是只能水解芳香基-葡萄糖苷的酶，這類酶能水解對硝基苯-β-D-葡萄糖苷等類似物。而根據(jù)葡萄糖苷酶的基因序列的不同，又可分為葡萄糖苷酶A和葡萄糖苷酶B之分。葡萄糖苷酶在自然界廣泛分布，幾乎在所有的生物體中都有存在，但來源不同，其性質(zhì)各異(J Biological Chemistry，1996，271 (39) 23749-23755)οβ-葡萄糖苷酶在植物纖維原料制備燃料乙醇及食品工業(yè)中具有重要的應(yīng)用。 目前，影響木質(zhì)纖維資源生物轉(zhuǎn)化技術(shù)實用化的主要障礙之一就是纖維素降解酶的生產(chǎn)效率和使用效率都很低，從而導(dǎo)致纖維素酶的使用成本要占到酶糖化纖維材料總成本的 25飛0%。在用于制備生產(chǎn)纖維素酶的微生物大多屬于真菌，如木霉屬、曲霉屬、青霉屬等，其中木霉特別是里氏木霉突變株產(chǎn)生的纖維素酶的活力較高、酶系較全、應(yīng)用最為廣泛。但木霉纖維素酶的高活力主要表現(xiàn)在含有高活力的內(nèi)切型和外切型葡聚糖酶，而β-葡萄糖苷酶的活力明顯。研究表明，天然纖維素的有效降解需要由纖維素酶系中內(nèi)切型葡聚糖酶、外切型葡聚糖酶和葡萄糖苷酶這三大主要組分充分發(fā)揮協(xié)同作用才能完成，僅用木霉纖維素酶降解時，纖維素二糖會大量積累在水解液中，并強烈反饋抑制內(nèi)切型和外切型葡聚糖酶的催化活性。所以，低活力的葡萄糖苷酶是造成酶水解纖維資源得率低、酶用量大、成本高的關(guān)鍵因素之一。此外，葡萄糖苷酶可作為風(fēng)味酶應(yīng)用于(果)酒、茶葉、果汁中起到增香作用；可應(yīng)用于乳品工業(yè)中分解乳糖；也可應(yīng)用于催化葡萄糖發(fā)生轉(zhuǎn)移反應(yīng)和縮合反應(yīng)合成功能性低聚糖等。因此，高活力、低成本的葡萄糖苷酶制備技術(shù)已成為國內(nèi)外在這些領(lǐng)域中的研究熱點(Phytochemistry, 1988，27: 1973-1976)。黑曲霉是葡萄糖苷酶的高產(chǎn)菌株。但是，通過營養(yǎng)條件和培養(yǎng)條件的優(yōu)化，黑曲霉葡萄糖苷酶的活力仍不能滿足工業(yè)上的需要，而且成本較高。研究表明，對葡萄糖苷酶的基因進行克隆、改造和重組表達被認為可以從根本上顯著提高β -葡萄糖苷酶活力的最有效方法。到目前為止，在GenBank和DDJB數(shù)據(jù)庫中已有兩條黑曲霉β -葡萄糖苷酶基因序列(力^/7和力^/J )被報道。國內(nèi)外也有實現(xiàn)了 β-葡萄糖苷酶基因在畢赤酵母中表達的研究報道，但均未進行高效表達的研究(J Biol Chem.，2000，275: 4973-4980)。研究表明，外源蛋白表達的差異，一方面是受到表達條件的影響，另一方面，由外源基因本身的特性決定。從現(xiàn)有的國內(nèi)外研究現(xiàn)狀來看，對外源基因表達的優(yōu)化基本上集中在發(fā)酵條件的優(yōu)化。主要包括(1)酵母菌的生長密度，培養(yǎng)溫度和ρΗ;(2)甲醇誘導(dǎo)的濃度和誘導(dǎo)時間。通過這些培養(yǎng)條件的優(yōu)化，提高了外源目的蛋白的表達量。但實際上，要顯著提高外源目的蛋白的表達量，其上游技術(shù)至關(guān)重要。其技術(shù)主要包括(1)基因內(nèi)部結(jié)構(gòu)的優(yōu)化。外源基因在巴斯德畢赤酵母中能否表達或表達高低首先受到外源基因內(nèi)部結(jié)構(gòu)的影響，也是表達成功的前提和首要因素。其中，外源基因在宿主中表達時，同一種氨基酸可有廣6個密碼子，但不同的宿主對編碼同一氨基酸的密碼子使用頻率不同，有些密碼子使用頻率很高，有些幾乎不使用，高效表達的基因傾向于使用部分特定的同義密碼子，這些密碼子即為改種生物高效表達基因的優(yōu)越密碼子。這就是密碼子的偏愛性。目前，國內(nèi)外都有學(xué)者對畢赤酵母部分密碼子的用法進行了分析。以Arg為例，編碼6種密碼子在酵母高效表達基因、低效表達基因使用頻率明顯不同，密碼子CGA和CGG使用頻率為0，密碼子CGC 幾乎不使用，而AGA使用頻率最高。研究表明，在酵母中表達較高的基因往往是采用酵母本身所偏愛的密碼子；那些富含畢赤酵母稀有密碼子的外源基因在畢赤酵母中很難得到高效表達。在不改變氨基酸組成的前提下，將編碼外源蛋白的密碼子優(yōu)化為酵母的偏愛密碼子， 可以實現(xiàn)外源蛋白在酵母體內(nèi)表達或表達量的顯著提高。到目前為止，對黑曲霉葡萄糖苷酶基因進行定向改造以及該重組酶的高效表達在國內(nèi)外還未見研究報道。

發(fā)明內(nèi)容
解決的技術(shù)問題本發(fā)明的目的是大幅度提高黑曲霉葡萄糖苷酶基因的表達水平，獲得在畢赤酵母中超量表達的黑曲霉β-葡萄糖苷酶基因力^·/ II，以及對重組β-葡萄糖苷酶的制備進行研究。因此提供了一種改進的β-葡萄糖苷酶基因及其重組酶的制備。技術(shù)方案
改進的β -葡萄糖苷酶基因，核苷酸序列bglll如SEQ ID NO. 1所述。包含上述核苷酸序列的重組質(zhì)粒。包含上述核苷酸序列的重組質(zhì)粒pPICZ α -bglll。包含SEQ ID NO. 1所述β -葡萄糖苷酶基因的重組質(zhì)粒制備方法，步驟為-.bgl II 的合成設(shè)計一組98條寡核苷酸，所述98條寡核苷酸序列如SEQ ID NO. 2 SEQ ID NO. 99 所述；黑曲霉的葡萄糖苷酶基因力^/ II的獲得，采取兩步PCR擴增技術(shù)；第一步，反應(yīng)體系50 μ L 5 μ L的全部98條寡核苷酸引物100 ηΜ，4 μ L dNTP Mixture，各2. 5 mM，5 μ L 10 X PCR Buffer, 2. 5 U Ex iTaq,加水補足 50 μ L，反應(yīng)條件為94°C預(yù)變性 5 min， 94°C變性 30 s，59°C退火 3 min，72°C延伸 1 min，30 個循環(huán)，72°C延伸 10 min ；第二步，PCR 擴增基因力^·/ II，反應(yīng)體系50 μ L 包含上面的反應(yīng)物2 μ L，引物SEQ ID NO. 2,10 μΜIyL,引物 SEQ ID NO. 99，10 μΜ 1 μ L, dNTP Mixture，各 2.5 mM，4 μ L，5 X PCR Buffer 10 μ L，2. 5 U Ex iTaq,加水補足50 μ L，反應(yīng)條件為94°C預(yù)變性5 min，94°C變性30 s， 59°C退火30 s，72°C 3 min，30個循環(huán)，72°C延伸 10 min ；重組質(zhì)粒pPICZ α-bglll 的構(gòu)建 將獲得的改造后的基因bgl II和pPICZ α -A分別用內(nèi)切酶I.Sac II進行分步酶切， 并分別割膠回收，濃縮后16°C連接過夜，宿主菌使用ToplOF’的感受態(tài)細胞，涂布在LLB平板，LLB平板含25 μ g/mL Zeocin,倒置平板過夜，挑選單菌落到5 mL液體LLB中，液體LLB 中含 25 μ g /mL Zeocin, 37°C, 200 rpm 培養(yǎng) 8 h，得到重組質(zhì)粒 pPICZ α-bglll。含有上述重組質(zhì)粒的宿主細胞為畢赤酵母。利用含有上述改進的葡萄糖苷酶基因宿主細胞制備重組酶的方法，發(fā)酵培養(yǎng)基為質(zhì)量濃度為 85% 的 H3PO4 26. 7 mL, CaSO4 · 2H20 0. 93 g, K2SO4 18. 2 g, MgSO4 · 7H20 14. 9 g, KOH 4. 13 g, Glycerol 50 mL, 100 mM K2PO4-KH2PO4 緩沖液 100 mL，加入超純水至 IL ；PTMl 微量元素=CuSO4 ·5Η20 6.0 g，NaI 0. 08 g, MnSO4 ·Η20 3.0 g, NaMoO4 ·2Η20 0. 2g, H3BO3 0. 02 g, CoCl2 0. 5 g, ZnCl2 20. 0 g, FeSO4 · 7Η20 65. 0 g, H2SO4 5. 0 mL，加入超純水至1 L，用0.22 ym的濾膜過濾除菌；誘導(dǎo)表達β-葡萄糖苷酶的適宜條件為發(fā)酵培養(yǎng)基的PH值6. 0，發(fā)酵溫度，DO值(溶解氧)在30%左右，并適時添加PTMl，組氨酸和甲醇，誘導(dǎo)時間為108 h。具體方案內(nèi)容為
包括原始基因的克隆、基因的分析和定向改造以及重組酶的制備。1.參照Genebank上已發(fā)表的黑曲霉β-葡萄糖苷酶基因序列(登錄號為 AJ132386)設(shè)計引物，以提取的黑曲霉的RNA為模板進行RT-PCR，獲得目的基因，并將基因克隆到PMD-18T載體，再以克隆得到的基因為模板，PCR獲得去除信號肽的基因，并將去除信號肽的基因克隆到畢赤酵母表達載體PPICZ α，得到重組質(zhì)粒pPICZ α -bgll，轉(zhuǎn)化畢赤酵母誘導(dǎo)表達后酶活達到4 U/mL (具體見實施例1)。2.根據(jù)以下原則對黑曲霉葡萄糖苷酶基因O^/ I)序列進行人工進化1)選用在畢赤酵母中使用頻率較高的密碼子；2)由于畢赤酵母糖基化程度較低，bgl I基因中的糖基化位點保持不變；幻為降低mRNA二級結(jié)構(gòu)的最小自由能(MFE)，在堿基編排過程中去除了富含GC區(qū)和富含AT區(qū)域；4)使得GC含量接近畢赤酵母自身實際含量；5)提高翻譯終止效率。在DNAWorks軟件的輔助下，以畢赤酵母密碼子使用頻率表為基準(zhǔn)，以提高該基因密碼子使用頻率為主要目的，采用高度或中度使用頻率的密碼子對力W I的密碼子進行優(yōu)化。并通過設(shè)計一組98條用于新基因合成的寡核苷酸，運用DNA合成儀經(jīng)過化學(xué)合成獲得這組寡核苷酸引物，該組寡核苷酸引物在同一條鏈上是相鄰的，而與其互補的鏈有若干堿基是重疊的，重疊區(qū)域的解鏈溫度控制在60°C左右。用兩步PCR法獲得全新的黑曲霉 β-葡萄糖苷酶基因力^/ II (具體見實施例2)。3.為進一步提高降低制備β-葡萄糖苷酶的成本，本研究優(yōu)化了以基礎(chǔ)鹽工業(yè)培養(yǎng)基為原料的發(fā)酵條件。結(jié)果表明，在基礎(chǔ)鹽培養(yǎng)基的發(fā)酵培養(yǎng)時，誘導(dǎo)表達葡萄糖苷酶的適宜條件為初始PH值6.0，發(fā)酵溫度^-30°C，DO值(溶解氧)在30%左右，適時加入 PTMl和組氨酸，并加入甲醇誘導(dǎo)，最終β-葡萄糖苷酶的活力達到137 U/mL (具體見實施例3)。有益效果通過對基因的定向改造和重組菌的高密度發(fā)酵，改造后的黑曲霉葡萄糖苷酶基因力^/ II在畢赤酵母中的表達量較原始基因力^/ I提高了 33. 6倍，酶活達到137 U/mL (圖-2)。


圖1 為重組質(zhì)粒 pPICZ α -bglll ；
圖2為5 L發(fā)酵罐的高密度發(fā)酵結(jié)果，Δ表示菌的濃度(0D_)，〇表示β-葡萄糖苷酶的活性，*表示蛋白濃度；
圖3為重組酵母表達β -葡萄糖苷酶的蛋白電泳圖，1 7泳道分別為48h，60h，72h, 84h, 90h, 96h, 108h發(fā)酵液樣品；第8泳道為Mark。
具體實施例方式實施例1 黑曲霉β -葡萄糖苷酶基因的克隆及重組質(zhì)粒pPICZ α -bgll的構(gòu)建和表達
1.1 RNA提取(精編分子生物學(xué)實驗指南(第四版)北京科學(xué)出版社，2005): (1)耗材處理所用的塑料耗材經(jīng)0.1%的DEPC溶液37°C浸泡處理。過夜后，經(jīng)1.05 kg/cm3、121°C條件下滅菌30 min以去除殘余的DEPC。研缽、玻璃器皿在200°C下干熱法烘 8 h以上滅活RNA酶。(2)提取方法采用 Invitrogen Micro-to-midi Total RNA purification system,具體方法如下用IXPBS洗滌新鮮的菌絲體3 4次，抽干后用錫紙包好后放入液氮中冷凍。(a)用液氮預(yù)冷研缽。取出冷凍好的黑曲霉菌絲體，稱好200 mg放入研缽中，用研杵研磨，其間不斷加入液氮直至研磨成粉狀(無明顯可見顆粒，如沒有研磨徹底會影響RNA 的收率和質(zhì)量)。(b)向研缽中加入500 μ 1 RNA Lysis Solution，將研磨成粉末狀的樣品完全覆
蓋，室溫靜置，直至樣品完全融化，再繼續(xù)研磨至裂解液呈透明狀。(c)把研磨好的液體轉(zhuǎn)移到1. 5 mL離心管中，用ImL注射器反復(fù)吸取3 4次， 然后在25°C、12，000 rpm的條件下離心2 min，將懸浮液轉(zhuǎn)移至新的1. 5 mL離心管。(d)加入70%乙醇于樣品中，反復(fù)吸取5次混勻。(e)將一半的勻漿液(約 500 μ L)加入到 RNA Spin Cartridge，在 25°C、12，000 rpm的條件下離心15 s，棄清液，將剩余的樣品加入同一根離心管中重復(fù)離心。(f)加 700 μ L Wash Buffer I 于 Cartridge 中，在 25°C、12，000 rpm 的條件下離心 15 s，棄清液和 Tube，將 Spin Cartridge 裝入一個干凈的 RNA Wash Tube (2 mL)。(g)在 Cartridge 中加入 500 μ L Wash Buffer II，在 25°C、12，000 rpm 的條件下離心15 s，棄清液。(h)重復(fù)步驟(g) —次，再離心1 min。(i)從 Tbue 中取出 Cartridge，裝入一個 RNA Recovery Tube 中。
(j)添加 50 yL RNase-free water 到離心管的膜上，靜置 1 min，在 25°C、12，000 rpm的條件下離心2 min，棄除Cartridge。(k)立即使用或于-80°C冰箱保存。用紫外分光光度計測定RNA含量A26(1/A28Q。
1.2引物設(shè)計
參照Genebank上已發(fā)表的黑曲霉β -葡萄糖苷酶基因序列(登錄號為AJ132386)設(shè)計引物。(引物 1 :CCCGAATTCATGAGGTTCACTTTGATCG ；引物 2 CCCAAGCTTTTAGTGAACAGTAGGCAG) 1. 3 RT-PCR
RT 反應(yīng)體系為 10 μ L，含有 MgCl2 2 μ L, 10XRT Bufferl μ L, RNase Free dH20 3. 75 μ L, dNTP Mixture 1 μ L, RNase Inhibitor 0. 25 μ L, AMV Reverse Transcriptase, 0. 5μ L, Oligo dT-Adaptor primer 0.5 μ L, total RNA 彡 500 ng。進行反轉(zhuǎn)錄條件為 42°C 20 min, 99°C 5 min, 5°C 5 min。PCR 反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液 40 μ L。含有 5 X PCR Buffer 10 μ L, dH20 28.75 μ L, TaKaRa EX Taq HS, 0. 25 yL，引物 1 (10 μΜ) 0. 5 yL，引物 2 (10 μΜ) 0. 5 μ L，加入上述 RT 反應(yīng)液進行PCR，條件為94°C預(yù)變性 5 min，94°C變性 30 s，58°C退火 30 s，72°C 2.5 min, 30 個循環(huán)，72°C延伸10 min，取5 μ L反應(yīng)產(chǎn)物電泳檢測。反應(yīng)結(jié)束后，PCR反應(yīng)產(chǎn)物采用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，回收與目的片斷大小相近的條帶。
1. 4 TA克隆
采用 TaKaRa 公司的 PMD-18T Vector。反應(yīng)體系 10 yL，其中 pMD_18T Vector DNA IyL, Insert DNA 4μ L, Solution I 5 yL，16°C反應(yīng)過夜。轉(zhuǎn)化大腸桿菌 JM109 的感受態(tài)細胞，并涂布在含X-Gal、IPTG、Amp的LB培養(yǎng)基上，37°C培養(yǎng)，觀察菌落顏色進行平板篩選，挑選若干白色菌落至5 mL LB培養(yǎng)基(含Amp)中，37°C下培養(yǎng)8 h，提取重組質(zhì)粒進行測序驗證，得到含有原始基因力^/ I的重組質(zhì)粒PMD-18T-bglI。
1. 5重組質(zhì)粒pPICZ α -bgll的構(gòu)建和表達
設(shè)計去除黑曲霉β -葡萄糖苷酶基因信號肽的引物(弓丨物3 CCCGAATTCGCTGATGAATTGGCCTACTCCC ；引物 4 CCCCCGCGGTTAGTGAACAGTAGGCAGAGACGCC),以上述構(gòu)建好的pMD18-T-bgl I質(zhì)粒為模板進行PCR擴增，使用TaKaRa公司的I^rime STAR HS DNA 聚合酶，反應(yīng)體系 50 yL。包含 PMD_18T_bglI 0.5 μ L，引物 3 (10 μ]\02μ ，引物 4 (10 μΜ) 2 μ L, dNTP Mixture (各 2· 5 mM) 4μ L,5XPCR Buffer 10 μ L,Prime STARHS 0· 5μ L,力口 ddH20 M 50 μ L。反應(yīng)條件94°C預(yù)變性5 min，94°C變性 30 s，58°C退火 30 s，72°C 2.5 min, 30 個循環(huán)，72°C延伸10 min，取5 μ L反應(yīng)產(chǎn)物電泳檢測。將獲得的目的基因和pPICZ α -A分別用內(nèi)切酶I.Sac II進行分步酶切，并分別割膠回收，濃縮后16°C連接過夜。宿主菌使用ToplOF’的感受態(tài)細胞，涂布在LLB平板 (含25Pg/mL Zeocin),倒置平板過夜，挑選單菌落到5 mL液體LLB (含25Pg/mL Zeocin) 中，37°C，200 rpm培養(yǎng)8 h。提取重組質(zhì)粒進行測序驗證，得到含有原始基因I的重組
7質(zhì)粒pPICZa-bgll。使用/ ^ I對重組質(zhì)粒pPICZa-bgll進行單酶切。電泳檢測，酶切完全后，純化酶切產(chǎn)物，用10 μ L ddH20重懸濃縮后的DNA。取80 μ L感受態(tài)畢赤酵母細胞與10 4 1^線性化的重組質(zhì)粒？？扣2(1^^11混合， 轉(zhuǎn)入預(yù)冷的0.2 cm電轉(zhuǎn)杯中。冰浴5 min0根據(jù)所使用裝置推薦的畢赤酵母參數(shù)進行電擊。電擊結(jié)束后，立即加入1 mL預(yù)冷的1 M山梨醇，將內(nèi)容物轉(zhuǎn)移至滅菌離心管中。30°C 水浴靜置1 2 h后，將200 μ L轉(zhuǎn)化后的細胞涂布在含500 Pg/mL Zeocin YPDS平板上， 30°C倒置培養(yǎng)2 4 d。挑取單菌落，在MMH及MDH平板上按順序點轉(zhuǎn)化子。以GSll5/HIS+ Muts Ablumin 及GS115/ HIS+ Mut+β-gal為對照菌株。30°C培養(yǎng)2天。在MDH上生長正常而在MMH上生長緩慢或不生長的轉(zhuǎn)化子為陽性轉(zhuǎn)化子。挑取陽性轉(zhuǎn)化子。將陽性轉(zhuǎn)化子接種到Y(jié)PD平板上活化，培養(yǎng)2 d，接單菌落到10 mL BMGY液體培養(yǎng)基中，30°C，200 rpm搖床培養(yǎng)48 h，當(dāng)OD6tltl達到2 6之間時，離心，棄上清，用無菌超純水洗滌菌體1 2次。將用BMMY誘導(dǎo)培養(yǎng)基稀釋菌體至OD6tltl=I,用4層紗布代替棉塞，于30°C，250 rpm搖床培養(yǎng)。定時取樣1 mL菌液，同時補加1 mL ΒΜΜΥ、0. 5% (V/ V)甲醇。樣品于12000 rpm下離心5 min，取上清檢測酶活，酶活測定采用pNPG(對硝基苯酚-β-D-葡萄糖苷)法測定(Arch. Biochem. Biophys. , 1964，108: 22-29)。
實施例2 黑曲霉β-葡萄糖苷酶基因的定向改造及重組質(zhì)粒pPICZa-bglll的構(gòu)建 2.1黑曲霉葡萄糖苷酶基因的定向改造
畢赤酵母表達系統(tǒng)是近年來發(fā)展很快的一個真核表達系統(tǒng)，非常適合真核蛋白的表達，表現(xiàn)在其很強的真核蛋白質(zhì)修飾功能上，能對蛋白質(zhì)進行翻譯后正確的加工、折疊和糖基化修飾等。不同宿主間密碼子使用頻率的差異是影響基因在異源宿主中表達效率的主要因素。與其他微生物一樣，畢赤酵母表達外源基因具有密碼子偏好性。來源于黑曲霉的 β -葡萄糖苷酶基因bglY中存在有很多畢赤酵母利用率較低的稀有密碼子，從而使得bgl I不能獲得更高效的表達。因此，為實現(xiàn)bgl I在畢赤酵母中的高效表達，在不改變氨基酸序列的前提下，本研究首先對力^/ I進行了密碼子優(yōu)化(生物工程學(xué)報，2000，16(3): 308-311)。在DNAWorks 軟件的輔助下(Nucleic Acids Res.，2002，30(10) e43)，以畢赤酵母密碼子使用頻率表為基準(zhǔn)，以提高該基因密碼子使用頻率為主要目的，采用高度或中度使用頻率的密碼子對β-葡萄糖苷酶基因(力W I)的密碼子進行優(yōu)化。經(jīng)優(yōu)化后，
II的密碼子在畢赤酵母中的最適使用頻率從0. 64增加到0. 84。高頻密碼子使用率在60% 以上。平均GC含量從56. 49%下降至44. 61%，與酵母自身GC含量相近。通過對mRNA 二級結(jié)構(gòu)進行分析，對位于基因1294 bp和1478 bp處的基因進行優(yōu)化，避免了由于出現(xiàn)回文序列而導(dǎo)致翻譯提前終止的可能。同時對葡萄糖苷酶基因 (,bgl I)中出現(xiàn)的重復(fù)序列進行了優(yōu)化，破壞影響核糖體結(jié)合和mRNA穩(wěn)定的莖環(huán)結(jié)構(gòu)。并以來源于黑曲霉的葡萄糖苷酶基因I)序列為基礎(chǔ)，使用DNAMAN軟件，設(shè)計了一組98條寡核苷酸，運用DNA合成儀經(jīng)過化學(xué)合成獲得這組寡核苷酸。人工進化的黑曲霉β-葡萄糖苷酶基因力^·/ II的獲得采取兩步PCR擴增技術(shù)。第一步，反應(yīng)體系50 yL:5 μ L的全部98條寡核苷酸引物(100 ηΜ)，4 μ L dNTPMixture (各 2. 5 mmol/L) ,5μ L 10 X PCR Buffer, 2. 5 U Ex Taq，加水補足 50 μ L，反應(yīng)條件為94°C預(yù)變性 5 min，94°C變性 30 s，59°C退火 3 min，72°C 1 min，30 個循環(huán)，72°C延伸 10 min ；第二步，PCR擴增基因力^·/ II，反應(yīng)體系50ul 包含上面的反應(yīng)物2 yL，引物SEQ ID NO. 2,10 μΜ 1 μ L，引物 SEQ ID NO. 99，10 μΜ 1 μ L, dNTP Mixture (各 2· 5 mM)4y L, 5 X PCR BufferlOy L, 2. 5 U Ex Taq，加水補足 50 μ L，反應(yīng)條件為94°C預(yù)變性 5 min, 94°C變性 30 s，59°C退火 30 s，72°C 3 min，30 個循環(huán)，72°C延伸 10 min，取 5 μ L 反應(yīng)產(chǎn)物電泳檢測。
2.2重組質(zhì)粒pPICZ α -bglll的構(gòu)建
將獲得的改造后的基因力^/ II和pPICZ α-A分別用內(nèi)切酶I.Sac II進行分步酶切，并分別割膠回收，濃縮后16°C連接過夜。宿主菌使用ToplOF’的感受態(tài)細胞，涂布在 LLB平板(含25 Pg/mL Zeocin)，倒置平板過夜，挑選單菌落到5 mL液體LLB (含25 μδ/ mL Zeocin)中，37°C，200 r/min培養(yǎng)8 h。提取重組質(zhì)粒進行測序驗證，得到含有優(yōu)化后的基因知7 II的重組質(zhì)粒pPICZa-bglll (圖-1)。
實施例3 重組質(zhì)粒pPICZ a -bglll轉(zhuǎn)化畢赤酵母及重組酶的制備
3.1表達載體的酶切線性化及其質(zhì)粒的回收
將鑒定正確的陽性轉(zhuǎn)化子大量培養(yǎng)，采用大提質(zhì)粒的方法提取重組質(zhì)粒 pPICZ a-bglll。使用/ ^ I對重組質(zhì)粒pPICZ a-bglll進行單酶切。電泳檢測，酶切完全后，純化酶切產(chǎn)物，用10 μ L ddH20重懸濃縮后的DNA。
3.2畢赤酵母的電擊轉(zhuǎn)化
將畢赤酵母菌株GS115活化后，接種到500 mL YPD培養(yǎng)基中，30°C培養(yǎng)至OD6tltl為1. 3 1.5。4°C, 1500 rpm條件下離心5 min，收集細胞，分別用500 mL、250 mL預(yù)冷的滅菌水洗滌細胞。4°C，1500 rpm條件下離心，用20 mL預(yù)冷的1 M山梨醇懸浮、洗滌細胞。最后用 1 mL預(yù)冷的1 M山梨醇懸浮細胞，至終體積約1.5 mL。取80 μ L上述細胞與10 μ L線性化的重組質(zhì)粒pPICZ a-bglll混合，轉(zhuǎn)入預(yù)冷的0.2 cm電轉(zhuǎn)杯中。冰浴5 min。根據(jù)所使用裝置推薦的畢赤酵母參數(shù)進行電擊。電擊結(jié)束后，立即加入ImL預(yù)冷的1 M山梨醇，將內(nèi)容物轉(zhuǎn)移至滅菌離心管中。30°C水浴靜置1 2 h后，將200 μ L轉(zhuǎn)化后的細胞涂布在含 500 Pg/mL Zeocin YPDS 平板上，30°C倒置培養(yǎng) 2 4 d。
3. 3重組畢赤酵母的篩選和鑒定
挑取單菌落，在MMH及MDH平板上按順序點轉(zhuǎn)化子。以GS115/HIS+ Muts Ablumin及 GS115/ HIS+ Mut+β-gal為對照菌株。30°C培養(yǎng)2天。在MDH上生長正常而在MMH上生長緩慢或不生長的轉(zhuǎn)化子為陽性轉(zhuǎn)化子。挑取陽性轉(zhuǎn)化子。
3. 4重組畢赤酵母工程菌株的誘導(dǎo)表達
將陽性轉(zhuǎn)化子接種到Y(jié)PD平板上活化，28°C培養(yǎng)2 d，接單菌落到10 mL BMGY液體培養(yǎng)基中，30°C，200 r/min搖床培養(yǎng)48h，當(dāng)OD6tltl達到2 6之間時，離心，棄上清，用無菌超純水洗滌菌體1 2次。將用BMMY誘導(dǎo)培養(yǎng)基稀釋菌體至0D_=1，用4層紗布代替棉塞， 于30°C，250 r/min搖床培養(yǎng)。定時取樣1 mL菌液，同時補加1 mL ΒΜΜΥ,Ο. 5% (V/V)甲醇。樣品于12000 rpm下離心5 min，取上清貯存于4°C用于檢測酶活。
3. 5重組畢赤酵母的高密度發(fā)酵
發(fā)酵培養(yǎng)基(FM21) :(85% wt) H3PO4 26. 7 mL，CaSO4 · 2H20 0. 93 g，K2SO4 18. 2 g, MgSO4 ·7Η20 14. 9 g，K0H 4. 13 g, Glycerol 50 mL, 100 mM K2PO4-KH2PO4 緩沖液 100 mL，力口入超純水至1L。PTMl 微量元素=CuSO4 · 5H20 6. 0 g, NaI 0. 08 g, MnSO4 · H2O 3. 0 g, NaMoO4 · 2H20 0. 2g, H3BO3 0. 02 g，CoCl2 0.5 g，ZnCl2 20. 0 g，F(xiàn)eSO4 · 7H20 65. 0 g，H2SO4 5. OmL，加入超純水至1L，用0.22μπι的濾膜過濾除菌。
3. 5. 1種子培養(yǎng)
1)將重組畢赤酵母在YPD瓊脂板上劃線培養(yǎng)。2)至菌落長到2 mm左右，挑取單克隆菌落加入到10 mL YPD培養(yǎng)液(種子培養(yǎng)基) 中，28°C，190 rpm震蕩培養(yǎng)16 M h。3)將上述培養(yǎng)物加入到300 mL BMGY培養(yǎng)液中，28°C，190 rpm震蕩培養(yǎng)24h左右，OD600 7。3. 5. 2生物量的累積
1)調(diào)校設(shè)備校準(zhǔn)發(fā)酵罐的PH計、溶氧計(在時進行)，并進行蠕動泵的流量校準(zhǔn)。2)配制2. 5 L FM21培養(yǎng)基，加入5L發(fā)酵罐，121°C，30 min高壓滅菌培養(yǎng)基、發(fā)酵
罐及管道。3)待發(fā)酵罐內(nèi)培養(yǎng)基冷卻到室溫時，用觀％的氨水調(diào)節(jié)FM21培養(yǎng)基的pH值為 6. 0，而后加入0. 8%(V/V) PTMl微量元素。4)將上述300 mL BMGY培養(yǎng)菌種加入發(fā)酵罐，開始發(fā)酵罐培養(yǎng)，此為第一階段， 即甘油培養(yǎng)擴增菌體。5)此階段每隔6 h取樣1次，測0D_和細胞濕重，分析酵母菌生長狀態(tài)，肉眼和鏡下觀察菌液，排除雜菌污染，并留上清用于蛋白及酶活分析。6)約18 h后DO值上升至接近100%，說明培養(yǎng)基中甘油已消耗殆盡，轉(zhuǎn)入補充甘油階段以進一步增加菌體密度。7)在高壓滅菌后的50%甘油中加入1. (V/V) PTMl微量元素，混勻后，以18.2 mL/h/L初始發(fā)酵液即M6 mL/h的速率加入到發(fā)酵罐中，至菌體濕重達180 220 g/L。在接種20小時左右，向發(fā)酵液中加入組氨酸，至終濃度為0. 1%。8)此階段適時調(diào)整發(fā)酵罐的攪拌速度，維持DO值(溶解氧)在30%以上；自動調(diào)控溫度、PH是其值分別為28°C、6. 0。9)停止補加甘油后，觀測DO值上升至接近100%后，繼續(xù)維持“甘油饑餓”狀態(tài) 30min，轉(zhuǎn)入甲醇誘導(dǎo)表達階段。3. 5. 3甲醇誘導(dǎo)β -葡萄糖苷酶的合成1)在甲醇中加入1. 2% PTMl微量元素，混勻后，以3. 6 mL/h/L初始發(fā)酵液即108 mL/h 的速率加入到發(fā)酵罐中誘導(dǎo)表達，維持此低速率2 3 h，以使酵母適應(yīng)以甲醇為唯一碳源的環(huán)境。2)在首次流加甲醇的同時，向發(fā)酵液中加入組氨酸，至終濃度為0. 1%。3)當(dāng)酵母適應(yīng)以甲醇為唯一碳源的環(huán)境后，DO值即保持穩(wěn)定，繼續(xù)維持此低速率補加甲醇lh。補加甲醇的速率升為7.2 mL/h/L初始發(fā)酵液即216 mL/h，以此速率維持2 h。4)升高補加甲醇的速率為llmL/h/L初始發(fā)酵液即330 mL/h,同時監(jiān)測DO值和發(fā)酵液溫度并判斷甲醇是否過量(停補甲醇觀測DO值變化，若停補甲醇后，DO值在Imin內(nèi)上升幅度大于10%，說明碳源受限，反之說明甲醇過量)，若碳源受限，則加快補甲醇的速率， 若甲醇過量則應(yīng)調(diào)慢補甲醇的速率，直到合適的速度。5)開始誘導(dǎo)表達后，每隔6 h取樣1次，測0D_和細胞濕重，分析酵母菌生長狀態(tài)，并留上清用于蛋白分析(圖3)。6)此階段適時調(diào)整發(fā)酵罐的攪拌速度，維持DO值(溶解氧)在30%以上；自動調(diào)控溫度、PH使其值分別為30°C、5. 0。7)當(dāng)發(fā)現(xiàn)酶活和目的蛋白量維持穩(wěn)定，即結(jié)束發(fā)酵，最終酶活達到137 U/mL (圖 _2)。
權(quán)利要求
1.改進的β-葡萄糖苷酶基因，其特征在于核苷酸序列bglII如SEQ ID NO. 1所述。
2.包含權(quán)利要求1所述核苷酸序列的重組質(zhì)粒。
3.包含權(quán)利要求1所述核苷酸序列的重組質(zhì)粒PPICZα -bglll。
4.包含SEQID NO. 1所述β -葡萄糖苷酶基因的重組質(zhì)粒制備方法，其特征在于步驟為bgl II的合成設(shè)計一組98條寡核苷酸，所述98條寡核苷酸序列如SEQ ID NO. 2 SEQ ID NO. 99所述；黑曲霉的β-葡萄糖苷酶基因II的獲得，采取兩步PCR擴增技術(shù)； 第一步，反應(yīng)體系50 μ L 5 μ L的全部98條寡核苷酸引物100 ηΜ，4 μ L dNTP Mixture, 各 2. 5 mM，5 μ L 10 X PCR Buffer, 2. 5 U Ex Taq，加水補足 50 μ L，反應(yīng)條件為94°C預(yù)變性 5 min，94°C變性 30 s，59°C退火 3 min，72°C 1 min，30 個循環(huán)，72°C延伸 10 min ；第二步，PCR擴增基因bgl II，反應(yīng)體系50 μ L 包含上面的反應(yīng)物2 μ L，引物SEQ ID NO. 2， 10 μΜ 1 μ L，引物 SEQ ID Ν0· 99，10 μΜ 1 μ L, dNTP Mixture,各 2.5 mM,4 μ L，5 XPCR Buffer 10 μ L,2. 5 U Ex Taq，加水補足50 μ L，反應(yīng)條件為:94°C預(yù)變性5 min，94°C變性 30 s，59°C退火 30 s，72°C 3 min，30 個循環(huán)，72°C延伸 10 min ；重組質(zhì)粒pPICZa -bglll的構(gòu)建將獲得的改造后的基因II和pPICZa -A分別用內(nèi)切酶feoR I.Sac II進行分步酶切，并分別割膠回收，濃縮后16°C連接過夜，宿主菌使用 ToplOF'的感受態(tài)細胞，涂布在LLB平板，LLB平板含25 μ g/mL Zeocin，倒置平板過夜，挑選單菌落到5 mL液體LLB中，液體LLB中含25 μ g /mL Zeocin, 37°C, 200 rpm培養(yǎng)8 h, 得到重組質(zhì)粒pPICZ a -bglll。
5.含有權(quán)利要求3所述重組質(zhì)粒的宿主細胞為畢赤酵母。
6.利用含有權(quán)利要求1所述改進的葡萄糖苷酶基因宿主細胞制備重組酶的方法， 其特征在于發(fā)酵培養(yǎng)基為質(zhì)量濃度為85%的H3PO4 26. 7 mL, CaSO4 · 2H20 0. 93 g，K2SO4 18. 2 g,MgSO4 ·7Η20 14. 9 g，K0H 4. 13 g, Glycerol 50 mL, 100 mM K2PO4-KH2PO4 緩沖液 100 mL，加入超純水至 IL ；PTMl 微量元素=CuSO4 · 5H20 6. 0 g, NaI 0. 08 g, MnSO4 · H2O 3. 0 g, NaMoO4 · 2H20 0. 2g, H3BO3 0. 02 g, CoCl2 0. 5 g, ZnCl2 20. 0 g, FeSO4 · 7H20 65. 0 g, H2SO4 5.0!^，加入超純水至11^，用0.22 ym的濾膜過濾除菌；誘導(dǎo)表達β-葡萄糖苷酶的適宜條件為發(fā)酵培養(yǎng)基的PH值6. 0，發(fā)酵溫度28-30°C，DO值在30%左右，并添加誘導(dǎo)量的 PTMl，組氨酸和甲醇，誘導(dǎo)時間為108 h。
全文摘要
改進的β-葡萄糖苷酶基因及其重組酶的制備，改進的β-葡萄糖苷酶基因核苷酸序列bglII如SEQIDNO.1所述。本發(fā)明同時提供了以基礎(chǔ)鹽為培養(yǎng)基的該重組菌表達β-葡萄糖苷酶的方法。通過對基因的人工進化和高密度發(fā)酵，改造后的黑曲霉β-葡萄糖苷酶基因bglII在畢氏酵母中的表達量較原始基因bglI提高了36倍。本發(fā)明可用于β-葡萄糖苷酶基因的分子改造及其重組畢赤酵母基因工程菌的高密度發(fā)酵，能顯著提高β-葡萄糖苷酶的表達水平。
文檔編號C12N9/42GK102399803SQ20111030193
公開日2012年4月4日 申請日期2011年9月30日 優(yōu)先權(quán)日2011年9月30日
發(fā)明者周潭澈, 李迅, 趙林果 申請人:南京林業(yè)大學(xué)