專利名稱：漢賽巴爾通體的pcr鑒定方法
技術領域：
本發(fā)明涉及生物檢測技術，具體地說涉及漢賽巴爾通體的PCR鑒定方法。
背景技術：
漢賽巴爾通體(Bartonellahenselae)是引起貓抓病(Cat-Scratch Disease, CSD)的主要病原菌。此病常見(主要臨床表現(xiàn)是淋巴結炎)于兒童，發(fā)病平均年齡為14 歲，高發(fā)年齡在10歲以內。多數(shù)患者表現(xiàn)為被貓抓(或咬)傷后，在傷口處出現(xiàn)紅斑丘疹或膿皰。局部淋巴結紅腫、發(fā)熱，可觸動、較硬，30%自發(fā)性化膿，以頭面部、上肢和腹股溝淋巴結居多。病人還可伴有全身不適、發(fā)熱、咳嗽等癥狀。漢賽巴爾通體還會引起人心內膜炎、 帕里諾眼-腺綜合征(Parinaud，s oculoglandular syndrome, POGS)、腦炎、脊髓炎、周圍神經(jīng)病、單側或雙側視網(wǎng)膜炎、肝脾肉芽腫、骨髓炎和胸膜炎等疾病。貓、狗是此菌的主要宿主，可以通過抓、咬等密切接觸將漢賽巴爾通體傳播給人類。漢賽巴爾通體的檢測鑒定方法有核酸分析、探針雜交、熒光定量PCR和特異性抗體檢測鑒定。目前，主要依靠PCR方法擴增目標基因后測序進行核酸序列分析。探針雜交方法以往有些研究者應用，但是由于操作繁瑣及方法的特異性低等問題，已較少有人應用。 特異性抗體檢測鑒定的方法雖然有人報道應用，但是與其他細菌及巴爾通體交叉反應問題仍然存在。核酸序列分析方法雖然能夠提供確切的鑒定結果區(qū)分巴爾通體的種別，但是此方法需要將目標基因的擴增產(chǎn)物測序、然后進行序列比對以及構建進化樹，分析過程繁瑣， 不僅儀器化程度要求較高，對操作人員的專業(yè)要求也較高，而且耗時、費用較高，僅能在專業(yè)實驗室進行，不利于推廣應用。在少數(shù)專業(yè)實驗室應用的熒光定量PCR方法也存在上述同樣的問題，而且檢測的準確性仍需要大量的實驗研究證實。

發(fā)明內容
為了解決上述問題，本發(fā)明提供漢賽巴爾通體的鑒定方法及其鑒定用引物。本發(fā)明首先提供一種漢賽巴爾通體的PCR鑒定方法，其根據(jù)漢賽巴爾通體外膜蛋白基因BH13010的序列高變區(qū)設計特異性引物，以待測樣品DNA或細菌培養(yǎng)物為模板進行特異性擴增，若能擴增到特異性條帶，即鑒定為漢賽巴爾通體。本發(fā)明通過RAPD-PCR的方法，從漢賽巴爾通體的基因組中篩選出dnaG (引發(fā)酶基因)、BHl 1550(膜整合蛋白基因)、ppdK (丙酮酸磷酸雙激酶基因)、BH13010 (外膜蛋白基因)、nrdl (核糖核苷酸還原酶基因)、rpsK (核糖體蛋白基因)、IpxD (?；D移酶基因)。 再對這些基因片段進行特異性篩選，發(fā)現(xiàn)BH13010特異性地僅存在漢賽巴爾通體和五日熱巴爾通體基因組中，利用序列高變區(qū)可特異性的鑒定漢賽巴爾通體，其核苷酸序列如SEQ ID No. 1 所示。根據(jù)上述結果，本領域技術人員應當理解，所述的序列高變區(qū)是指與五日熱巴爾通體相比，漢賽巴爾通體序列特異性較強的區(qū)域。其中，引物序列為
Cpf GTGACAGCTTATGGCGGTTT,Cpr :CGTCCATTGACCAATTTCC。本發(fā)明還提供一種漢賽巴爾通體的多重PCR鑒定方法，以待測樣品DNA或細菌培養(yǎng)物為模板，特異性地擴增漢賽巴爾通體的dnaG基因、膜整合蛋白基因BH11550、外膜蛋白基因BH13010和IxpD基因，擴增到目的條帶即為漢賽巴爾通體，其中，外膜蛋白基因 BH13010的引物是根據(jù)漢賽巴爾通體外膜蛋白基因BH13010的序列高變區(qū)設計的。其中，擴增引物分別為BhAF:CACGCGCATCAAGATAACGAC(SEQ ID No. 4)，BhAR :TTCAATCCAATCGCCGACA(SEQ ID No. 5)；Cpf GTGACAGCTTATGGCGGTTT(SEQ ID No. 6)，Cpr :CGTCCATTGACCAATTTCC(SEQ ID No. 7)；禾口6fl =ACAGCAGTAGTATGCAAtAA(SEQ ID No. 8),6f2 :ACGTCCACACCACAGCG(SEQ ID No. 9)。用上述引物進行多重PCR的判斷標準為是否擴增出三條特異性條帶，其中片段大小分別為約1171bp、293bp和215bp。其中，PCR反應液中，引物BhAF、BhAR, Cpf和Cpr的濃度分別為0. 2 μ Μ，引物6Π 和6f2的濃度為0. 3 μ M。其中多重PCR反應條件為94°C變性30sJ4 58°C退火30s，72°C延伸lmin，擴增 25個循環(huán)。本發(fā)明還提供如前所述的漢賽巴爾通體PCR鑒定用引物或多重PCR鑒定用引物以及含有該引物的鑒定用試劑盒。本發(fā)明還提供漢賽巴爾通體PCR鑒定用引物或多重PCR鑒定用引物還可用于制備鑒定漢賽巴爾通體的試劑。本發(fā)明以dnaG、BH11550 (膜整合蛋白基因)、BH13010 (膜蛋白基因)、IpxD基因為擴增目標，設計針對漢賽巴爾通體菌株的PCR引物，進行多重PCR擴增。通過優(yōu)化反應體系、擴增參數(shù)，能夠準確、靈敏地檢測單個菌落鑒定出漢賽巴爾通體。上述基因中dnaG、 BH11550(膜整合蛋白基因)和IpxD基因的核苷酸序列具有巴爾通體屬特異性，即可以在屬水平區(qū)別巴爾通體與其他菌；BH13010(膜蛋白基因)是漢賽巴爾通體和五日熱巴爾通體特有基因，在序列高變區(qū)設計引物可以在種水平上區(qū)別五日熱巴爾通體和其他巴爾通體；上述基因聯(lián)合應用時增加鑒定方法的特異性，保證了漢賽巴爾通體鑒定的準確性。


圖 1RAPD-PCR 電泳圖。圖2單個菌落為模板的多重PCR反應電泳圖。F, QIAGEN Fast Cycling PCR Kit 反應體系；T，TaKaRa Ex Taq反應體系；S，賽百盛Taq DNA聚合酶反應體系；M，IOObp DNA ladder marker ；N，空白對照；h，試劑盒提取漢賽巴爾通體DNA模板；Ch，漢賽巴爾通體單個菌落模板；Cg，格拉漢姆巴爾通體單個菌落模板。圖3PCR反應的特異性檢測電泳圖。M，IOObp DNA ladder marker ;N，空白對照； h，漢賽巴爾通體；q，五日熱巴爾通體；C，克氏巴爾通體；k，克勒巴爾通體；vb，文森巴爾通體博格霍夫亞種；va，文森巴爾通體阿魯潘亞種；e，伊麗莎白巴爾通體；g，格拉漢姆巴爾通體；t，特利波契巴爾通體；d，道志巴爾通體；b，桿菌樣巴爾通體。圖4其他革蘭陽性、陰性菌及動物模板為模板的PCR反應的特異性檢測電泳圖。 M, IOObp DNA ladder marker ;1，12，空白對照；2，13，漢賽巴爾通體；3，莫氏立克次體；4， 恙蟲病東方體；5，嗜吞噬細胞無形體；6，日本立克次體；7，普氏立克次體；8，金黃色葡萄球菌；9，結核分枝桿菌；10，鼠疫耶爾森菌(疫苗株)；11，鉤端螺旋體；14，伯氏疏螺旋體；15， 鮑曼不動桿菌；16，根癌土壤桿菌；17，豬種布魯菌；18，羊種布魯菌；19，大腸桿菌；20，志賀菌；21，幽門螺桿菌；22，空腸彎曲菌；23，霍亂弧菌；24，傷寒桿菌；25，鼠傷寒沙門菌；26， 副流感嗜血桿菌；27，軍團菌；28，腦膜炎奈瑟菌C群；29，腦膜炎奈瑟菌A群；30，肺炎鏈球菌；31，肺炎克雷伯菌；32，人 DNA ；33 JgDNA ；34，犬 DNA ；35，鼠 DNA。
具體實施例方式以下實施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。實施例中所涉及的菌不限于具體的菌株，均可市售獲得，如可購自中國藥品生物制品檢定所、美國ATCC等微生物菌種保藏機構。實施例1多重PCR引物篩選(I)RAPD-PCR應用3 條隨機引物 S15 :5 ‘ -GGAGGGTGTT-3 ‘ (SEQ ID No. 16)、S18 5' -CCACAGCAGT-3‘ (SEQ ID No. 17)和 S103 :5‘ -AGACGTCCAC-3‘ (SEQ ID No. 18)進行 RAPD-PCR擴增。反應體系采用 QIAGEN Fast Cycling PCR Kit 20 μ L，上述引物各 lOpmol， 漢賽巴爾通體(購自美國菌種保藏中心，ATCC49882)基因組DNA 50ng。擴增條件為94°C 解鏈5分鐘；94°C變性40秒，40°C退火40秒，72°C延伸1分鐘，35個循環(huán)；72°C延伸5min。(2) RAPD-PCR擴增產(chǎn)物克隆測序將漢賽巴爾通體RAPD-PCR擴增帶A、B、C、D、E和F (圖1)分別切膠純化，克隆到質粒上測序。序列分析顯示擴增帶A、B、C、D、E和F分別是dnaG、BH11550 (膜整合蛋白基因)、ppdK、BH13010 (外膜蛋白基因)、nrdl、rpsK、IpxD0(3)多重PCR組合基因篩選依據(jù)上述各基因序列分別設計引物(表1)，分為不同組合擴增漢賽巴爾通體 (B. henselae)、和與其最為近緣的五日熱巴爾通體(B. quintana)。A-B-D-E組合在一起， 對于漢賽巴爾通體和五日熱巴爾通體4個基因均能擴增出來；再擴增A-B-C-F、A-B-F和 A-C-F組合，其中A-B-C-F對于漢賽巴爾通體各個基因均能擴增出來，對于五日熱巴爾通體C擴增不出來。再進行生物信息學分析后發(fā)現(xiàn)，發(fā)現(xiàn)BH13010特異性地僅存在漢賽巴爾通體和五日熱巴爾通體基因組中，因此，利用序列高變區(qū)可特異性的鑒定漢賽巴爾通體， BH13010的核苷酸序列如SEQ ID No. 1所示。結果也表明，本發(fā)明根據(jù)漢賽巴爾通體的 BH13010基因的序列高變區(qū)涉及的引物，能夠從漢賽巴爾通體和五日熱巴爾通體準確地鑒定出漢賽巴爾通體。為了保證特異性，篩選A(SEQ ID No. 2)、C^PF(SEQ ID No. 3)三個基因片段用于鑒定漢賽巴爾通體。設計并篩選出引物BhAF-BhAR (簡稱A)、Cpf-Cpr (簡稱C)、6fl_6f2(簡稱F) 3對引物組合，特異性擴增漢賽巴爾通體。結果表明，與漢賽巴爾通體最為近緣的五日熱巴爾通體擴增結果為陰性，漢賽巴爾通體則能擴增出三個特異性條帶。
表1擴增5個片段的引物序列
目的片段引物名稱引物序列(5’ —3’)擴增帶大小bpABhAF BhARCACGCGC ATCAAGATAACGAC TTCAATCCAATCGCCGACA1171BBhBF BhBRTGGATTAAGAGGATGCCGTTT CCCCACTCCATCACGGT442CCpf CprGTGACAGCTTATGGCGGTTT CGTCCATTGATCCAATTTCC293DBhDF BhDRCACAGCAGTAAGAGCACGAA GGCAAACCCTTTAGCGATATT381EBhEF BhERGCGGCGTGTTTAATTGG ATGACAATAATACGCGACGAA261F6fl 6￡2ACAGCAGTAGATGCAAtAA ACGTCCACACCACAGCG215實施例2PCR反應條件優(yōu)化1、引物濃度模板市售的核酸提取試劑盒提取漢賽巴爾通體菌株基因組DNA。反應體系擴增體系為50yL，寶生物公司IOXEx Taq buffer IOyL, TaKaRa Ex Taq 5U,5mM dNTP mixture，引物 BhAF-BhAR、Cpf-Cpr 和 6f l_6f2 各 IOpmol 或者引物 BhAF-BhAR 和 Cpf-Cpr 各 IOpmol，引物 6fl_6f2 15pmol, 1 μ L DNA 模板，和去離子水補足到 50 μ L0PCR擴增參數(shù)94°C變性30sJ4°C退火30s，72°C延伸lmin，共25個循環(huán)。凝膠電泳和結果觀察取5 μ L PCR產(chǎn)物和1 μ L 6 X上樣緩沖液充分混勻，置1 % 瓊脂糖凝膠電泳。電壓5v/cm，電泳緩沖液為0. 5XTBE，凝膠成像儀觀察結果并拍照。結果表明，在引物BhAF-BhAR、Cpf-Cpr和6f l_6f2各IOpmol的條件下，引物 6fl-6f2擴增出的片段亮度較暗，而在引物BhAF-BhAR和Cpf-Cpr各lOpmol，引物6fl_6f2 15pmol的條件下，引物6fl-6f2擴增出的片段亮度合適，其他條帶不受影響，效果較好。2、退火溫度用上述建立的體系進行擴增，退火溫度分別為M 54. 7 55. 4 °C、56. 4 V、 57. 2°C、58°C。結果表明，不同的退火溫度對擴增結果沒有影響，效果均較好。3、TaqDNA 酶用上述建議的體系進行擴增，所用的TaqDNA酶分別為寶生物的TaKaRa Ex !"aq、QIAGEN 的 Fast Cycling PCR Master Mix、賽百盛的 Taq DNA 聚合酶和 U-Taq DNA Polymerase、天根的 Taq DNA Polymerase 禾口 Taq Plus DNA Polymerase。結果表明，寶生物的 TaKaRa Ex Taq、QIAGEN 的 Fast Cycling PCR Master Mix 和天根的 iTaq Plus DNA Polymerase擴增效果優(yōu)于其它的。 實施例3特異性檢測實驗
用實施例2優(yōu)化后的體系擴增五日熱巴爾通體、克氏巴爾通體 (B. clarridgeiae)、克勒巴爾通體(B. koehlerae)、文森巴爾通體博格霍夫亞種 (B. vinsonii subsp. berkhoffii)、文森巴爾通體阿魯潘亞種(B. vinsonii subsp. arupensis)、伊麗莎白巴爾通體(B. elizabethae)、格拉漢姆巴爾通體(B. grahamii)、 特利波契巴爾通體(B. tribocorum)、道志巴爾通體(B. doshiae)和桿菌樣巴爾通體 (B. bacilliformis)均無三條擴增帶A、C、F同時出現(xiàn)的情況，僅有五日熱巴爾通體、克勒巴爾通體擴增出A和F帶，但C帶沒有出現(xiàn)(圖幻。結果表明，單獨擴增C帶也一樣可以特異性地鑒定出漢賽巴爾通體。擴增根癌土壤桿菌、布魯菌、立克次體、大腸桿菌、志賀氏菌、霍亂弧菌、金黃色葡萄球菌、無形體、空腸彎曲菌、軍團菌、鮑氏不動桿菌、鉤端螺旋體、伯氏疏螺旋體、肺炎鏈球菌、幽門螺桿菌、肺炎克雷伯桿菌、霍亂弧菌、傷寒桿菌、鼠傷寒沙門菌腦膜炎奈瑟菌等27種細菌及人、貓、犬和鼠類基因組DNA均無陽性擴增帶(圖4)，表明本發(fā)明能特異性地鑒定出漢賽巴爾通體。以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實施方式，應當指出，對于本技術領域的普通技術人員來說，在不脫離本發(fā)明技術原理的前提下，還可以做出若干改進和潤飾，這些改進和潤飾也應視為本發(fā)明的保護范圍。
權利要求
1.一種漢賽巴爾通體的PCR鑒定方法，其特征在于，根據(jù)漢賽巴爾通體外膜蛋白基因 BH13010的序列高變區(qū)設計特異性引物，以待測樣品DNA或細菌培養(yǎng)物為模板進行特異性擴增，若能擴增到特異性條帶，即鑒定為漢賽巴爾通體。
2.根據(jù)權利要求1所述的鑒定方法，其特征在于，其中PCR引物序列為 Cpf GTGACAGCTTATGGCGGTTT,Cpr :CGTCCATTGACCAATTTCC。
3.一種漢賽巴爾通體的多重PCR鑒定方法，其特征在于，以待測樣品DNA或細菌培養(yǎng)物為模板，特異性地擴增漢賽巴爾通體的dnaG基因、膜整合蛋白基因BH11550、外膜蛋白基因 BH13010和IxpD基因，擴增到目的條帶即為漢賽巴爾通體，其中，外膜蛋白基因BH13010的引物是根據(jù)漢賽巴爾通體外膜蛋白基因BH13010的序列高變區(qū)設計的。
4.如權利要求3所述的鑒定方法，其特征在于，其中，PCR引物分別為 BhAF CACGCGCATCAAGATAACGAC,BhAR TTCAATCCAATCGCCGACA ； Cpf :GTGACAGCTTATGGCGGTTT, Cpr CGTCCATTGACCAATTTCC ；禾口 6fl ACAGCAGTAGTATGCAAtAA， 6f2 :ACGTCCACACCACAGCGo
5.如權利要求4所述的鑒定方法，其特征在于，其中PCR反應液中，引物BhAF、BhAR, Cpf和Cpr的濃度分別為0. 2 μ M，引物6fl和6f2的濃度為0. 3 μ M。
6.如權利要求4所述的鑒定方法，其特征在于，其中多重PCR反應條件為94°C變性 30s，54 58°C退火30s，72°C延伸lmin，擴增25個循環(huán)。
7.漢賽巴爾通體PCR鑒定用引物，其為 Cpf GTGACAGCTTATGGCGGTTT,Cpr CGTCCATTGACCAATTTCC。
8.漢賽巴爾通體多重PCR鑒定用引物，其為 BhAF CACGCGCATCAAGATAACGAC,BhAR TTCAATCCAATCGCCGACA ； Cpf :GTGACAGCTTATGGCGGTTT, Cpr CGTCCATTGACCAATTTCC ；禾口 6fl ACAGCAGTAGTATGCAAtAA， 6f2 :ACGTCCACACCACAGCGo
9.含有權利要求7或8所述引物的漢賽巴爾通體多重PCR鑒定試劑盒。
10.權利要求7或8所述的引物在制備用于鑒定漢賽巴爾通體的試劑中的應用。
全文摘要
本發(fā)明提供一種漢賽巴爾通體的PCR鑒定方法，其根據(jù)漢賽巴爾通體外膜蛋白基因BH13010的序列高變區(qū)設計特異性引物，以待測樣品DNA或細菌培養(yǎng)物為模板進行特異性擴增，若能擴增到特異性條帶，即鑒定為漢賽巴爾通體。其中，所述的引物序列如SEQ IDNo.6和7所示。本發(fā)明引物特異性好，鑒定方法準確度高，操作簡單，對儀器設備要求低，成本低。
文檔編號C12Q1/68GK102312006SQ20111030104
公開日2012年1月11日 申請日期2011年9月28日 優(yōu)先權日2011年9月28日
發(fā)明者劉起勇, 張建中, 栗冬梅 申請人:中國疾病預防控制中心傳染病預防控制所