專利名稱：利用微生物活菌懸液和/或粗酶液去除燕窩中亞硝酸鹽的方法與應用的制作方法
技術(shù)領域：
本發(fā)明涉及一種去除燕窩中亞硝酸鹽的方法，特別涉及一種利用微生物活菌懸液和/或粗酶液去除燕窩中亞硝酸鹽的方法與應用，屬于生物技術(shù)領域。
背景技術(shù)：
燕窩是雨燕科(Apodidae)金絲燕屬(Collocalia)的多種鳥類分泌出的唾液與絨羽、雜草等粘結(jié)而筑成的巢窩，經(jīng)去除絨羽、雜草等雜質(zhì)即為商品燕窩?，F(xiàn)代研究表明，燕窩不僅可作為補充蛋白質(zhì)、氨基酸的滋補品，而且含有一些活性蛋白，具有抑制血凝、促進細胞分裂、延緩腦組織衰老、提高免疫等功效。因此，燕窩是家喻戶曉的藥食兩用高級滋補品， 常用于補肺養(yǎng)陰、補中益氣、潤燥澤枯、化痰止咳，主治肺癆、咳嗽、咯血、虛損、痰喘等癥。在鳥類筑巢、毛燕窩除雜、商品燕窩貯存等過程中，難免與一些微生物接觸，由于微生物對燕窩中蛋白質(zhì)、氨基酸的分解代謝作用，會產(chǎn)生亞硝酸鹽，以致燕窩含有一定量的亞硝酸鹽。我國《食品安全國家標準食品添加劑使用標準》(GB2760-2011)嚴格規(guī)定，亞硝酸鹽的限量為30mg/kg，但是，在毛燕窩制作為商品燕窩的傳統(tǒng)生產(chǎn)中，燕窩中的亞硝酸鹽往往會超過國家標準。因此，在燕窩生產(chǎn)過程中或在燕窩食用前，需去除亞硝酸鹽。如果采用簡單的浸泡或超聲波清洗技術(shù)進行去除燕窩中亞硝酸鹽，往往去除不徹底，去除率最多不超過50% ；如果采用化學方法進行去除燕窩中亞硝酸鹽，往往會有化學藥品殘留問題。目前，未有生物法去除燕窩中亞硝酸鹽的相關(guān)報道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明首要目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的缺點與不足，提供一種利用微生物活菌懸液和/或粗酶液去除燕窩中亞硝酸鹽的方法，使亞硝酸鹽去除過程具有安全性與高效性。本發(fā)明的另一目的在于提供所述的利用微生物活菌懸液和/或粗酶液去除燕窩中亞硝酸鹽的方法的應用。本發(fā)明的目的通過下述技術(shù)方案實現(xiàn)一種利用微生物活菌懸液和/或粗酶液去除燕窩中亞硝酸鹽的方法，是將具有去除亞硝酸能力、可食用的微生物制備的微生物活菌懸液或是將具有去除亞硝酸能力、可食用的微生物制備的粗酶液中的一種或兩種，與燕窩混合，振蕩處理，洗滌燕窩，得到去除亞硝酸鹽的燕窩；所述的具有去除亞硝酸能力、可食用的微生物優(yōu)選為粘紅酵母或深紅酵母中的一種或兩種；所述的粘紅酵母優(yōu)選為粘紅酵母CICC31229(中國工業(yè)微生物菌種保藏中心)；所述的深紅酵母優(yōu)選為深紅酵母CICC32918(中國工業(yè)微生物菌種保藏中心)；所述的微生物活菌懸液為對微生物直接培養(yǎng)得到的微生物活菌懸液或是將凍干保存的微生物懸浮于培養(yǎng)基中得到的微生物活菌懸液；
所述的粗酶液優(yōu)選通過如下步驟制備得到將具有去除亞硝酸能力、可食用的微生物進行超聲波破碎細胞，低溫離心，去除菌體，得到上清液即為粗酶液；由于具有去除亞硝酸能力、可食用的微生物含有能降解亞硝酸鹽的酶，低溫離心，能有效保存能降解亞硝酸鹽的酶的活性，因此，將此粗酶液與燕窩混合，經(jīng)振蕩處理，可有效去除燕窩中的亞硝酸
^rt.；所述的超聲波破碎的條件優(yōu)選為功率200 250w、超聲10s、間歇10s、超聲60 120 次；所述的振蕩處理的條件優(yōu)選為28 32°C、150 250r/min振蕩1 9h ；所述的利用微生物活菌懸液和/或粗酶液去除燕窩中亞硝酸鹽的方法，更優(yōu)選包含以下步驟(1)培養(yǎng)基的制備將麥芽汁的pH值調(diào)節(jié)為4. 0 4. 5，滅菌，得到培養(yǎng)基；(2)制備活菌懸液活菌懸液為通過直接培養(yǎng)制備得到活菌懸液或是采用活性干酵母制備得到活菌懸液；直接培養(yǎng)制備得到活菌懸液的步驟如下將具有去除亞硝酸能力的粘紅酵母或深紅酵母接入步驟(1)制備的培養(yǎng)基中，培養(yǎng)至對數(shù)期，得到活菌懸液；采用活性干酵母制備得到活菌懸液的步驟如下將直接培養(yǎng)所得的活菌懸液進行低溫離心分離菌體，收集濕菌體，加入凍干保護劑，真空冷凍干燥，獲得活性干酵母；使用時，將活性干酵母投入步驟(1)所得的培養(yǎng)基中，得到活菌懸液；(3)制備粗酶液粗酶液為破碎菌體制備得到粗酶液或是將粗酶干粉投入緩沖液制備得到粗酶液；破碎菌體制備得到粗酶液的步驟如下將步驟( 制備的活菌懸液進行低溫離心分離菌體，收集濕菌體，加入0. 05 0. lmol/L、pH3. 5 4. 0磷酸鹽緩沖溶液，重新配制成活菌懸液，置于冰水浴中，超聲波破碎細胞，破碎后進行低溫離心分離菌體碎片，收集上清液，得到粗酶液；將粗酶干粉投入緩沖液制備得到粗酶液的步驟如下在破碎菌體制備得到的粗酶液中加入飽和度100%的氯化鈉溶液，得到40% 70%飽和度的氯化鈉溶液，靜置，收集鹽析沉淀物，加入凍干保護劑，真空冷凍干燥，獲得粗酶干粉；使用時，將粗酶干粉投入 0. 05 0. lmol/L的ρΗ3· 5 4. 0磷酸鹽緩沖溶液中，配制粗酶液；(4)燕窩中亞硝酸鹽的去除將燕窩投入步驟( 制備的活菌懸液或步驟(3)制備的粗酶液中，置于洲 32°C、150 250r/min下進行振蕩處理1 恥，然后取出燕窩，用純凈水漂洗，風干，即得亞硝酸鹽不超標的燕窩。步驟(1)中所述的麥芽汁優(yōu)選為10° 12° Brix的麥芽汁；步驟(1)中所述的滅菌的條件優(yōu)選為121 125°C滅菌10 20min ；步驟O)中所述的具有去除亞硝酸能力的粘紅酵母優(yōu)選CICC31229(中國工業(yè)微生物菌種保藏中心)、深紅酵母優(yōu)選CICC32918(中國工業(yè)微生物菌種保藏中心)；步驟( 中所述的活菌懸液優(yōu)選為活酵母數(shù)達1.0X IO7個/mL以上的活菌懸液；步驟O)中所述的直接培養(yǎng)的步驟優(yōu)選如下將具有去除亞硝酸能力的粘紅酵母或深紅酵母接入步驟(1)制備的培養(yǎng)基，采用好氧培養(yǎng)方式于觀 321培養(yǎng)20 Mh，使培養(yǎng)液中活酵母數(shù)達1. OX IO7個/mL以上，得到活菌懸液；
所述的具有去除亞硝酸能力的粘紅酵母或深紅酵母接入步驟(1)制備的培養(yǎng)基的操作優(yōu)選為在搖瓶培養(yǎng)基接入斜面菌種，接種量為1 2環(huán)/IOOmL,培養(yǎng)至對數(shù)期，得到搖瓶種子液；在進行發(fā)酵培養(yǎng)時，在發(fā)酵罐培養(yǎng)基中接入搖瓶種子液，接種量為體積百分比 10% ；所述的好氧培養(yǎng)可以是搖瓶振蕩培養(yǎng)，條件為裝液量為體積百分比20%，轉(zhuǎn)速為 150 250r/min ；也可以是發(fā)酵罐通氣培養(yǎng)，條件為攪拌轉(zhuǎn)速為100 400r/min，通氣比為 1 0. 2 1. 5 ；步驟⑵和(3)中所述的低溫離心分離菌體的條件優(yōu)選為4°C、6000 8000r/min 離心20 30min ；步驟(2)中所述的凍干保護劑優(yōu)選山梨醇單硬脂酸酯、蔗糖硬脂酸二酯等，其用量按質(zhì)量百分比計，為濕菌體的5 20% ；更優(yōu)選為5 15%步驟⑵和步驟(3)中所述的真空冷凍干燥的條件優(yōu)選為預凍溫度為-40 V -30 V，真空條件為1. 3 131 ，干燥過程溫度為_40 V 30°C，干燥時間為24 36h ；步驟C3)中所述的活菌懸液優(yōu)選為活酵母數(shù)達1.0X IO7個/mL以上的活菌懸液；步驟(3)中所述的靜置的條件優(yōu)選為4 6°C靜置2 4h ；步驟(3)中所述的收集鹽析沉淀物的方式優(yōu)選為離心；所述的離心的轉(zhuǎn)速優(yōu)選為8000r/min ；步驟(3)中所述的超聲波破碎細胞的優(yōu)選條件為功率200 250w、超聲10s、間歇 10s、超聲60 120次；步驟(3)中所述的將粗酶干粉投入緩沖液制備得到粗酶液的步驟優(yōu)選如下在破碎菌體制備得到的粗酶液中加入飽和度100%的氯化鈉溶液，得到40% 70%飽和度的氯化鈉溶液，靜置，收集鹽析沉淀物，加入相當于鹽析沉淀物質(zhì)量5% 15%的凍干保護劑， 真空冷凍干燥，獲得粗酶干粉；使用時，將粗酶干粉投入0. 05 0. lmol/L的pH3. 5 4. 0 磷酸鹽緩沖溶液中，配制30 50g/L的粗酶液；所述的凍干保護劑優(yōu)選山梨醇單硬脂酸酯、蔗糖硬脂酸二酯等；步驟(4)中所述的活菌懸液或粗酶液的量優(yōu)選為不超過50g/L(燕窩/活菌懸液或粗酶液)；步驟中所述的純凈水漂洗的用水量為活菌懸液或粗酶液的1 3倍體積；步驟中所述的風干的溫度優(yōu)選為40°C以下的溫度。所述的利用微生物活菌懸液和/或粗酶液去除燕窩中亞硝酸鹽的方法可應用于去除腌制食品中的亞硝酸鹽。從食品安全性考慮，本發(fā)明采用了具有食用安全的微生物及其粗酶液進行去除燕窩中亞硝酸鹽，去除率可達99%以上。由于本發(fā)明所涉及的亞硝酸鹽去除技術(shù)具有安全性、 高效性，不但可應用于燕窩，而且可以推廣應用于其它腌制食品。本發(fā)明相對于現(xiàn)有技術(shù)具有如下的優(yōu)點(1)本發(fā)明采用微生物活菌懸液與粗酶液去除燕窩中的亞硝酸鹽，具有安全性與高效性，取得了非常顯著的效果，可推廣應用于去除其它腌制食品中的亞硝酸鹽。(2)本發(fā)明所制備的活性干酵母與粗酶干粉，方便于貯存和使用，在食品的生產(chǎn)過程中與食用前均可使用。


圖1是為本發(fā)明的亞硝酸鹽去除流程示意圖。
具體實施例方式下面結(jié)合實施例及附圖對本發(fā)明作進一步詳細的描述，但本發(fā)明的實施方式不限于此。實施例1采用微生物活菌懸液去除燕窩中的亞硝酸鹽，其過程如圖1所示(1)培養(yǎng)基的制備將200mL麥芽汁(10° Brix)調(diào)節(jié)pH4. 5，裝入IOOOmL三角瓶，紗布包扎瓶口，經(jīng) 125°C滅菌lOmin，冷卻后備用。(2)直接培養(yǎng)制備活菌懸液將粘紅酵母CICC312^ (購于中國工業(yè)微生物菌種保藏中心)斜面菌種接入培養(yǎng)基，接種量為2環(huán)(接種環(huán)直徑0.6讓)，置于觀1、15017/1^11培養(yǎng)對11，得酵母數(shù)為 2. 57 X IO7個/mL的活菌懸液。(3)燕窩中亞硝酸鹽的去除將2g燕窩(市售，原產(chǎn)馬來西亞，采用酸水解處理樣品、氨基酸自動分析儀測得燕窩的水解氨基酸含量為48. 4% (質(zhì)量百分比)，采用鹽酸N-(1-萘)-乙二胺光度法測得燕窩的亞硝酸鹽含量為72μ g/g)投入步驟(2)制備的活菌懸液200mL，置于^°C、150r/min 振蕩lh，取出燕窩，用200mL純凈水漂洗lOmin，于35°C下風干，測得燕窩的水解氨基酸含量為48. 4% (質(zhì)量百分比)，亞硝酸鹽含量為0. 5 μ g/g,亞硝酸鹽去除率達99. 3%，經(jīng)處理后的燕窩中亞硝酸鹽含量小于國家限量標準。實施例2采用微生物活菌懸液去除燕窩中的亞硝酸鹽，其過程如圖1所示(1)培養(yǎng)基的制備將200mL麥芽汁(12° Brix)調(diào)節(jié)pH4. 0，裝入IOOOmL三角瓶，紗布包扎瓶口，經(jīng) 125°C滅菌20min，冷卻后備用。(2)直接培養(yǎng)制備活菌懸液將深紅酵母CICC3^18 (購于中國工業(yè)微生物菌種保藏中心)斜面菌種接入培養(yǎng)基，接種量為4環(huán)(接種環(huán)直徑0.6讓)，置于觀1、15017/1^11培養(yǎng)對11，得酵母數(shù)為 1.97X 107 f/mL的活菌懸液。(3)燕窩中亞硝酸鹽的去除將IOg燕窩(市售，原產(chǎn)馬來西亞，采用酸水解處理樣品、氨基酸自動分析儀測得燕窩的水解氨基酸含量為48 % (質(zhì)量百分比)，采用鹽酸N- (1-萘)-乙二胺光度法測得燕窩的亞硝酸鹽含量為124 μ g/g)投入200mL活菌懸液，置于32°C、250r/min振蕩池，取出燕窩，用200mL純凈水漂洗lOmin，于38°C下風干，測得燕窩的水解氨基酸含量為47. 6% (質(zhì)量百分比)，亞硝酸鹽含量為0. 6 μ g/g，亞硝酸鹽去除率達99. 5 %，經(jīng)處理后的燕窩中亞硝
7酸鹽含量小于國家限量標準。實施例3采用微生物活菌懸液去除燕窩中的亞硝酸鹽，其過程如圖1所示(1)培養(yǎng)基的制備將^70mL麥芽汁(12° Brix)調(diào)節(jié)pH4. 0，裝入5L發(fā)酵罐，經(jīng)121°C滅菌15min， 冷卻后備用。(2)活性干酵母制備活菌懸液搖瓶種子培養(yǎng)將IOOmL麥芽汁(12° Brix)調(diào)節(jié)pH4. 0，裝入500mL三角瓶，紗布包扎，125°C滅菌lOmin，冷卻后，接入1環(huán)(接種環(huán)直徑0. 6mm)粘紅酵母CICC31229 (購于中國工業(yè)微生物菌種保藏中心)斜面菌種，置于30°C、200r/min培養(yǎng)20h，即得粘紅酵母搖瓶種子液。發(fā)酵罐培養(yǎng)將30mL粘紅酵母種子液接入發(fā)酵罐培養(yǎng)基中，培養(yǎng)溫度控制30°C， 攪拌轉(zhuǎn)速控制100 400r/min，通氣比控制1 0. 2 1. 5，發(fā)酵20h，得到酵母數(shù)為 7. 5 X IO7個/mL的活菌懸液?；钚愿山湍傅闹苽鋵⑸鲜龌罹鷳乙河?°C、6000r/min離心分離菌體，得到濕菌體60g，加入山梨醇單硬脂酸酯12g，拌勻，置于-30°C預凍2h，于1. 3 13Pa,-30°C~ 30°C 干燥Mh，得到活性干酵母67. 2g，備用?；罹鷳乙旱闹苽浞Q取粘紅酵母的活性干酵母50g，投入到200mL麥芽汁 (12° Brix，pH4. 0，經(jīng)121°C滅菌15min)中，配制成酵母數(shù)為8. ；35 X IO8個/mL的活菌懸液。(3)燕窩中亞硝酸鹽的去除將8g燕窩(市售，原產(chǎn)馬來西亞，水解氨基酸含量為47. 6% (質(zhì)量百分比)，亞硝酸鹽含量為1253 μ g/g)投入200mL活菌懸液，置于30°C、250r/min振蕩9h，取出燕窩，用 600mL純凈水漂洗lOmin，于30°C下風干，測得燕窩的水解氨基酸含量為46. 4% (質(zhì)量百分比)，亞硝酸鹽含量為7. 2 μ g/g，亞硝酸鹽去除率達99. 4%，經(jīng)處理后的燕窩中亞硝酸鹽含量小于國家限量標準。實施例4采用粗酶液去除燕窩中的亞硝酸鹽，其過程如圖1所示(1)培養(yǎng)基的制備將2000mL麥芽汁(11° Brix)調(diào)節(jié)pH4. 0，分裝入10個IOOOmL三角瓶中，每瓶裝液量200mL，紗布包扎瓶口，經(jīng)121°C滅菌20min，冷卻后備用。(2)直接制備粗酶液搖瓶培養(yǎng)將深紅酵母CICC32918(購于中國工業(yè)微生物菌種保藏中心)斜面菌種接入培養(yǎng)基，每瓶接2環(huán)(接種環(huán)直徑0. 6mm)，置于30°C、200r/min培養(yǎng)Mh，然后將10瓶培養(yǎng)液混合，得到酵母數(shù)為5. 28 X IO7個/mL的活菌懸液。粗酶液的制備將上述活菌懸液于4°C、8000r/min離心分離菌體，得到26. 5g濕菌體，加入0. 05mol/L的ρΗ4· O磷酸鹽緩沖溶液200mL,重新配制成5. 11 X IO8個/mL的活菌懸液，置于冰水浴中，采用超聲波進行細胞破碎，超聲波頻率為20KHz，超聲波功率為200w， 超聲10s、間歇10s、超聲60次，然后置于4°C ,6000r/min離心分離菌體碎片，收集上清液，得到粗酶液180mL。(3)燕窩中亞硝酸鹽的去除將9g燕窩(市售，原產(chǎn)馬來西亞，采用酸水解處理樣品、氨基酸自動分析儀測得燕窩的水解氨基酸含量為48. 2 % (質(zhì)量百分比)，采用鹽酸N- (1-萘)-乙二胺光度法測得燕窩的亞硝酸鹽含量為94 μ g/g)投入ISOmL粗酶液中，置于30°C、200r/min培養(yǎng)池，取出燕窩，用360mL純凈水漂洗lOmin，于25°C下風干，測得燕窩的水解氨基酸含量為48. (質(zhì)量百分比)，亞硝酸鹽含量為0. 5 μ g/g，亞硝酸鹽去除率達99. 5%，經(jīng)處理后的燕窩中亞硝酸鹽含量小于國家限量標準。實施例5采用粗酶液去除燕窩中的亞硝酸鹽，其過程如圖1所示(1)培養(yǎng)基的制備將MOOmL麥芽汁(12° Brix)調(diào)節(jié)pH4. 0，裝入IOL發(fā)酵罐，經(jīng)125°C滅菌15min， 冷卻后備用。(2)粗酶干粉制備粗酶液搖瓶種子培養(yǎng)將600mL麥芽汁(12° Brix)調(diào)節(jié)pH4. 0，分裝入三個IOOOmL三角瓶，紗布包扎，121°C滅菌20min，冷卻后，每瓶接入1環(huán)(接種環(huán)直徑0. 6mm)粘紅酵母 CICC31229 (購于中國工業(yè)微生物菌種保藏中心)斜面菌種，置于30°C、200r/min培養(yǎng)Mh， 即得粘紅酵母搖瓶種子液。發(fā)酵罐培養(yǎng)將600mL粘紅酵母種子液接入發(fā)酵罐培養(yǎng)基中，培養(yǎng)溫度控制30°C， 攪拌轉(zhuǎn)速控制100 400r/min，通氣比控制1 0. 2 1. 5，發(fā)酵Mh，得到酵母數(shù)為 7. 21 X IO7個/mL的活菌懸液。粗酶干粉的制備將上述活菌懸液于4°C、8000r/min離心分離菌體，得到濕菌體 112g，加入0. lmol/L的ρΗ3· 5的磷酸鹽緩沖溶液400mL,重新配制成7. 02 X IO9個/mL的活菌懸液；將活菌懸液置于冰水浴中，采用超聲波進行細胞破碎，超聲波頻率為20KHz，超聲波功率為250w，超聲10s、間歇10s、超聲120次，然后置于4°C、6000r/min離心分離菌體碎片，收集上清液，得到粗酶液300mL ；將700mL飽和度100 %的氯化鈉溶液加入300mL粗酶液中，混合均勻，在4°C下靜置2h，然后置于8000r/min下離心分離，得到鹽析沉淀物60g ；將 60g鹽析沉淀物與9g蔗糖硬脂酸二酯混合均勻，置于-40°C預凍2h，于1. 3 13 、-40°C 30°C干燥36h，得到粗酶干粉^g，備用。粗酶液的制備稱取IOg粗酶干粉，投入到200mL的0. 05mol/L的pH3. 5磷酸鹽緩沖溶液中，配制成濃度為50g/L的粗酶液，備用。(3)燕窩中亞硝酸鹽的去除將IOg燕窩(市售，原產(chǎn)馬來西亞，采用酸水解處理樣品、氨基酸自動分析儀測得燕窩的水解氨基酸含量為46. 5% (質(zhì)量百分比)，采用鹽酸N-(l-萘)-乙二胺光度法測得燕窩的亞硝酸鹽含量為420 μ g/g)投入200mL粗酶液中，置于30°C、200r/min振蕩6h，取出燕窩，用600mL純凈水漂洗lOmin，于30°C下風干，測得燕窩的水解氨基酸含量為46. 4% (質(zhì)量百分比)，亞硝酸鹽含量為0. 3 μ g/g,亞硝酸鹽去除率達99. 9%，經(jīng)處理后的燕窩中亞硝酸鹽含量小于國家限量標準。實施例6
采用粗酶液去除燕窩中的亞硝酸鹽，其過程如圖1所示(1)培養(yǎng)基的制備將^50mL麥芽汁(12° Brix)調(diào)節(jié)pH4. 5，裝入5L發(fā)酵罐，經(jīng)121°C滅菌15min， 冷卻后備用。(2)粗酶干粉制備粗酶液搖瓶種子培養(yǎng)將150mL麥芽汁(12° Brix)調(diào)節(jié)pH4. 5，裝入IOOOmL三角瓶，紗布包扎，121°C滅菌20min，冷卻后，每瓶接入1環(huán)(接種環(huán)直徑0. 6mm)深紅酵母CICC32918 (購于中國工業(yè)微生物菌種保藏中心)斜面菌種，置于30°C、200r/min培養(yǎng)Mh，即得深紅酵母搖瓶種子液。發(fā)酵罐培養(yǎng)將150mL深紅酵母種子液接入發(fā)酵罐培養(yǎng)基中，培養(yǎng)溫度控制30°C， 攪拌轉(zhuǎn)速控制100 400r/min，通氣比控制1 0. 2 1. 5，發(fā)酵20h，得到酵母數(shù)為 7. 08 X 107 f/mL的活菌懸液。粗酶干粉的制備將上述活菌懸液于4°C、6000r/min離心分離菌體，得到濕菌體 56g，加入0. 05mol/L的pH4. 0磷酸鹽緩沖溶液300mL，重新配制成7. 05 X IO8個/mL的活菌懸液；將活菌懸液置于冰水浴中，采用超聲波進行細胞破碎，超聲波頻率為20KHz，超聲波功率為200w，超聲10s、間歇10s、超聲90次，然后置于4°C、4000r/min離心分離菌體碎片， 收集上清液，得到粗酶液MOmL ；將160mL飽和度100 %的氯化鈉溶液加入MOmL粗酶液中， 混合均勻，在6°C下靜置4h，然后置于8000r/min下離心分離，得到鹽析沉淀物^g ；將26g 鹽析沉淀物與3g蔗糖硬脂酸二酯混合均勻，置于_40°C預凍2h，于1. 3 13Pa、-40°C 30°C干燥36h，得到粗酶干粉11. 2g，備用。粗酶液的制備稱取6g粗酶干粉，投入到200mL的0. lmol/L的pH4. 0磷酸鹽緩沖溶液中，配制成濃度為30g/L的粗酶液，備用。(3)燕窩中亞硝酸鹽的去除將5g燕窩(市售，原產(chǎn)馬來西亞，采用酸水解處理樣品、氨基酸自動分析儀測得燕窩的水解氨基酸含量為47. 4% (質(zhì)量百分比)，采用鹽酸N-(1-萘)-乙二胺光度法測得燕窩的亞硝酸鹽含量為64μ g/g)投入200mL粗酶液中，置于30°C、200r/min振蕩池，取出燕窩，用400mL純凈水漂洗lOmin，于35°C下風干，測得燕窩的水解氨基酸含量為47. 3% (質(zhì)量百分比)，亞硝酸鹽含量為0. 6 μ g/g,亞硝酸鹽去除率達99. 1 %，經(jīng)處理后的燕窩中亞硝酸鹽含量小于國家限量標準。上述實施例為本發(fā)明較佳的實施方式，但本發(fā)明的實施方式并不受上述實施例的限制，其他的任何未背離本發(fā)明的精神實質(zhì)與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡化， 均應為等效的置換方式，都包含在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。
權(quán)利要求
1.一種利用微生物活菌懸液和/或粗酶液去除燕窩中亞硝酸鹽的方法，其特征在于 是將具有去除亞硝酸能力、可食用的微生物制備的微生物活菌懸液或是將具有去除亞硝酸能力、可食用的微生物制備的粗酶液中的一種或兩種，與燕窩混合，振蕩處理，洗滌燕窩，得到去除亞硝酸鹽的燕窩。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述利用微生物活菌懸液和/或粗酶液去除燕窩中亞硝酸鹽的方法，其特征在于所述的具有去除亞硝酸能力、可食用的微生物為粘紅酵母或深紅酵母中的一種或兩種。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述利用微生物活菌懸液和/或粗酶液去除燕窩中亞硝酸鹽的方法，其特征在于所述的粘紅酵母為粘紅酵母CICC31229 ；所述的深紅酵母為深紅酵母CICC32918。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述利用微生物活菌懸液和/或粗酶液去除燕窩中亞硝酸鹽的方法，其特征在于所述的粗酶液通過如下步驟制備得到將具有去除亞硝酸能力、可食用的微生物進行超聲波破碎細胞，低溫離心，去除菌體，得到上清液即為粗酶液。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述利用微生物活菌懸液和/或粗酶液去除燕窩中亞硝酸鹽的方法，其特征在于所述的超聲波破碎的條件為功率200 250w、超聲10s、間歇10s、超聲60 120次；所述的振蕩處理的條件為28 32°C、150 250r/min振蕩1 9h。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述利用微生物活菌懸液和/或粗酶液去除燕窩中亞硝酸鹽的方法，其特征在于所述的利用微生物活菌懸液和/或粗酶液去除燕窩中亞硝酸鹽的方法，包含以下步驟(1)培養(yǎng)基的制備將麥芽汁的PH值調(diào)節(jié)為4.0 4. 5，滅菌，得到培養(yǎng)基；(2)制備活菌懸液活菌懸液為通過直接培養(yǎng)制備得到活菌懸液或是采用活性干酵母制備得到活菌懸液；直接培養(yǎng)制備得到活菌懸液的步驟如下將具有去除亞硝酸能力的粘紅酵母或深紅酵母接入步驟(1)制備的培養(yǎng)基中，培養(yǎng)至對數(shù)期，得到活菌懸液；采用活性干酵母制備得到活菌懸液的步驟如下將直接培養(yǎng)所得的活菌懸液進行低溫離心分離菌體，收集濕菌體，加入凍干保護劑，真空冷凍干燥，獲得活性干酵母；使用時，將活性干酵母投入步驟(1)所得的培養(yǎng)基中，得到活菌懸液；(3)制備粗酶液粗酶液為破碎菌體制備得到粗酶液或是將粗酶干粉投入緩沖液制備得到粗酶液；破碎菌體制備得到粗酶液的步驟如下將步驟( 制備的活菌懸液進行低溫離心分離菌體，收集濕菌體，加入0. 05 0. lmol/L、pH3. 5 4. 0磷酸鹽緩沖溶液，重新配制成活菌懸液，置于冰水浴中，超聲波破碎細胞，破碎后進行低溫離心分離菌體碎片，收集上清液，得到粗酶液；將粗酶干粉投入緩沖液制備得到粗酶液的步驟如下在破碎菌體制備得到的粗酶液中加入飽和度100%的氯化鈉溶液，得到40% 70%飽和度的氯化鈉溶液，靜置，收集鹽析沉淀物，加入凍干保護劑，真空冷凍干燥，獲得粗酶干粉；使用時，將粗酶干粉投入0. 05 0. lmol/L的pH3. 5 4. 0磷酸鹽緩沖溶液中，得到粗酶液；(4)燕窩中亞硝酸鹽的去除將燕窩投入步驟( 制備的活菌懸液或步驟C3)制備的粗酶液中，置于28 32°C、150 250r/min下進行振蕩處理1 恥，然后取出燕窩，用純凈水漂洗，風干，即得亞硝酸鹽不超標的燕窩。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述利用微生物活菌懸液和/或粗酶液去除燕窩中亞硝酸鹽的方法，其特征在于步驟(3)中所述的將粗酶干粉投入緩沖液制備得到粗酶液的步驟如下在破碎菌體制備得到的粗酶液中加入飽和度100%的氯化鈉溶液，得到40% 70%飽和度的氯化鈉溶液，靜置，收集鹽析沉淀物，加入相當于鹽析沉淀物質(zhì)量5% 15%的凍干保護劑，真空冷凍干燥，獲得粗酶干粉；使用時，將粗酶干粉投入0. 05 0. lmol/L的pH3. 5 4. 0磷酸鹽緩沖溶液中，配制30 50g/L的粗酶液。
8.根據(jù)權(quán)利要求6所述利用微生物活菌懸液和/或粗酶液去除燕窩中亞硝酸鹽的方法，其特征在于步驟(1)中所述的麥芽汁為10° 12° Brix的麥芽汁；步驟(1)中所述的滅菌的條件為121 125°C滅菌10 20min ； 步驟O)中所述的粘紅酵母為粘紅酵母CICC31229;所述的深紅酵母為深紅酵母 CICC32918 ；步驟O)中所述的活菌懸液為活酵母數(shù)達1. OX IO7個/mL以上的活菌懸液； 步驟O)中所述的直接培養(yǎng)的步驟如下將具有去除亞硝酸能力的粘紅酵母或深紅酵母接入步驟(1)制備的培養(yǎng)基，采用好氧培養(yǎng)方式于觀 321培養(yǎng)20 Mh，使培養(yǎng)液中活酵母數(shù)達1. OX IO7個/mL以上，得到活菌懸液；步驟(2)和(3)中所述的低溫離心分離菌體的條件為4°C、6000 8000r/min離心 20 30min ；步驟(2)和(3)中所述的凍干保護劑為山梨醇單硬脂酸酯或蔗糖硬脂酸二酯； 步驟(2)和步驟(3)中所述的真空冷凍干燥的條件為預凍溫度為-40°C -30°C，真空條件為1. 3 13Pa，干燥過程溫度為-40°C 30°C，干燥時間為M 36h ； 步驟(3)中所述的活菌懸液為活酵母數(shù)達1. OX IO7個/mL以上的活菌懸液； 步驟⑶中所述的靜置的條件為4 6°C靜置2 4h ； 步驟(3)中所述的收集鹽析沉淀物的方式為離心；步驟(3)中所述的超聲波破碎細胞的條件為功率200 250w、超聲10s、間歇10s、超聲 60 120次；步驟中所述的風干的溫度為40°C以下的溫度。
9.根據(jù)權(quán)利要求7所述利用微生物活菌懸液和/或粗酶液去除燕窩中亞硝酸鹽的方法，其特征在于步驟O)中所述的好氧培養(yǎng)為搖瓶振蕩培養(yǎng)或是發(fā)酵罐通氣培養(yǎng)；搖瓶振蕩培養(yǎng)的條件為裝液量為體積百分比20%，轉(zhuǎn)速為150 250r/min ；發(fā)酵罐通氣培養(yǎng)的條件為攪拌轉(zhuǎn)速為100 400r/min，通氣比為1 0. 2 1. 5。
10.權(quán)利要求1 9任一項所述利用微生物活菌懸液和/或粗酶液去除燕窩中亞硝酸鹽的方法的應用，其特征在于將所述利用微生物活菌懸液和/或粗酶液去除燕窩中亞硝酸鹽的方法用于去除腌制食品中亞硝酸鹽。
全文摘要
本發(fā)明公開一種利用微生物活菌懸液和/或粗酶液去除燕窩中亞硝酸鹽的方法與應用。該方法是將具有去除亞硝酸能力、可食用的微生物制備的微生物活菌懸液或是將具有去除亞硝酸能力、可食用的微生物制備的粗酶液中的一種或兩種，與燕窩混合，振蕩，洗滌燕窩，得到去除亞硝酸鹽的燕窩。微生物活菌懸液為直接發(fā)酵得到或是使用活性干酵母懸浮于培養(yǎng)基得到；粗酶液為通過菌體破碎分離得到或是將粗酶干粉溶解于緩沖液得到?；钚愿山湍负痛置父煞鄯奖阌谫A存和使用，在食品的生產(chǎn)過程中與食用前均可使用。本發(fā)明采用具有食用安全的微生物及其粗酶液進行去除燕窩中亞硝酸鹽，去除率可達99％以上。本發(fā)明安全、高效，可應用于去除其它腌制食中的亞硝酸鹽。
文檔編號A23L1/015GK102362637SQ201110300839
公開日2012年2月29日 申請日期2011年9月30日 優(yōu)先權(quán)日2011年9月30日
發(fā)明者余運紅, 廖帆, 徐偉強, 朱曉立, 李靜, 楊旭霞, 王瑤, 蔡曉妮, 鄧毛程, 顧宗珠, 黃崇俊 申請人:廣東輕工職業(yè)技術(shù)學院, 李靜, 王瑤, 鄧毛程, 顧宗珠