一種降解鄰苯二甲酸二(2-乙基己基)酯的菌株及其在煙草種植中的應用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種降解鄰苯二甲酸二（2-乙基己基）酯的菌株及其在煙草種植中的應用，屬于農業(yè)生物技術應用領域。本發(fā)明的微生物菌株為嗜溫鞘氨醇桿菌（ Sphingobacteriumthalpophilum ）zh-x-08菌株，于2013年08月27日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏號：CGMCC No.8075。本發(fā)明的菌株經發(fā)酵后得到發(fā)酵液，發(fā)酵液以適宜的比例添加煙草根際中可明顯降低煙草根系自毒物質鄰苯二甲酸二（2-乙基己基）酯的含量，促進煙株生長。CGMCC No.80752013.08.27
【專利說明】-種降解鄰苯二甲酸二（2-乙基己基）醒的菌株及其在煙 草種植中的應用
[0001]

【技術領域】： 本發(fā)明涉及一種降解鄰苯二甲酸二（2-己基己基)醋的菌株及其在煙草種植中的應用， 屬于農業(yè)生物技術應用領域。
[000引【背景技術】： 鄰苯二甲酸二（2-己基己基)醋[di-(2-eth}dhe;syl)地thalate，DEHP]是駄酸醋類化 合物（phthalic acid esters, PAEs)中最為常用的一種，作為增塑劑應用于生產聚氯己帰 樹脂（PVC)D PAEs全球年產量約為600萬T，DEHP產量約占PAEs總量的（80-85) %，在終端 產品中含量可達到75%左右。塑料制品的廣泛應用，使PAEs成為全球最普遍的環(huán)境有機污 染物。
[0003] 環(huán)境介質中存在的DEHP極少部分源于自然，絕大多數(shù)源自人類活動的釋放。塑料 制品在使用和處理過程中釋放出DEHP能污染大氣、水體、±壤^及食物等，DEHP已成為水 體和±壤中最常被檢出的內分泌干擾素類優(yōu)控有機污染物，多年前就有在包括人體在內的 很多生物體中均有被檢出的報道。
[0004] DEHP在環(huán)境中化學性質穩(wěn)定，難被降解，具有生物積累效應(憂湘平，李桂英， 吳志輝，等.4種駄酸醋在龍須菜-籃子魚食物鏈中的積累放大研究[J].海洋科學， 2008，32 (1) : 19-23. )?！廊乐械腄EHP不僅影響植物的生理代謝，降低產質量，而且還抑 制植物種子萌發(fā)和幼苗生長，是一種較為典型的化感物質，并可被吸收積累于植物體內，通 過食物鏈傳遞?！廊乐械腄EHP能夠降低祀蝴的體重，且下降程度與±壤中DEHP濃度呈現(xiàn) 線性相關(陳強，孫紅文，王兵，等.鄰苯二甲酸二異辛醋值EH巧對±壤中微生物和動 物的影響[J].農業(yè)環(huán)境科學學報，2004，23化）：1156-1159.)。動物實驗表明，DEHP能 降低雌性動物的雌激素水平和受孕率，損傷雄性動物的睪丸，具有較強的生殖毒性，還具有 致崎性和胚胎毒性，也是導致男性不育的可疑誘因之一。
[0005] 微生物的降解作用被認為是DEHP從自然環(huán)境中消除的主要途徑。DEHP在好 氧條件下的生物降解比較快，半衰期2-3周，在厭氧條件下的半衰期約300天(Arias E. Effects of the peroxisome proliferator di(2-ethylhexyl)phthalate on cell turnover and peroxisome proliferation in primary chick embryo hepatocytes[J]. !Environmental Toxicology and Qiemistry, 2012, 31 (12): 2856-2860. )〇
[0006] 國內外就DEHP的微生物降解做了大量的工作，目前已篩選到的能降解DEHP的微 生物菌株主要屬于假單胞菌屬(Ae化/offlimas巧7.)(柴素芬，曾鋒，傅家漠.DEHP的微 生物降解性研究[J].中山大學學報（自然科學版），2000，39(4): 57-60.)、微球菌屬 (iZ/crococc化巧7.)、棒狀桿菌屬沁ritt?巧7)、銷胺醇單胞菌屬（成如? W.)等，另外銅綠微囊藻對水體中DEHP亦具有明顯的降解作用（遲杰，董林林，李金 娟.銅綠微囊藻對DBP和DEHP的富集和降解特性[J].天津大學學報，2006，39 (12): 1395-1398.)。銷氨醇單胞菌屬（成Ain妍遍mas)是由Y油uuchi在1990年首先提出劃 分的一個新屬，是一類豐富的新型微生物資源，能夠降解高分子有機污染物(胡杰，何曉 紅，李大平，等.銷氨醇單胞菌研究進展[J].應用與環(huán)境生物學報，2007，13(3): 431-437.)，已成為微生物研究的熱點之一（2冊口 Lisha, LI Hui, ZHANG Ying, ef a7. Development of genus-speci円c primers for better understanding the diversity and population structure of Sphingomonas in soils[J]. J Basic Microbiol, 2014, 54巧）：880-888. ;YANG Suijuan, ZHang Xin曲ai, CAO 化aoyun, ef a7. Growth-promoting Sphingomonas paucimobilis ZJSHl associated with Dendrobium officinale through phytohormone production and nitrogen fixation[J]. Microb Biotechnol, 2014.)〇
[0007] 但尚未見嗜溫銷氨醇桿菌（成Ai略C!知C沁化3如(9/7如可降解DEHP的研 究報道。
[000引
【發(fā)明內容】
： 本發(fā)明的目的在于針對現(xiàn)有技術的不足提供一種降解鄰苯二甲酸二（2-己基己基）醋 的菌株及其在煙草種植中的應用，該菌株是發(fā)明人從鄭州郊區(qū)塑料廢棄物中分離并篩選出 來，是具有降解鄰苯二甲酸二（2-己基己基)醋能力的菌株，經發(fā)酵后應用于煙草種植中，可 明顯促進煙株生長。
[0009] 本發(fā)明的目的是通過W下技術方案來實現(xiàn)的：一種降解鄰苯二甲酸二（2-己基己 基）醋的菌株，為嗜溫銷氨醇桿菌(成如'略沁化3如(9/7如ai-X-〇8菌株，該菌 株于2013年08月27日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中也，保藏單位 地址為北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號，中國科學院微生物研究所，郵編為100101，保 藏號；CGMCC No. 8075。
[0010] 所述化-X-08菌株在LB平板上圓形，直徑1. 5?2. 5 mm,淡黃，表面光滑，濕潤，低 凸起，邊緣裂葉狀。菌體桿狀，無鞭毛，不運動，大小為（0. 5(T〇. 60)ymX (0. 9(T2. 0)ym; 結合生理生化特性(革蘭氏染色、巧樣酸鹽利用、硝酸鹽還原W及碳源與利用等指標）及 ieSrDNA序列，可鑒定為嗜溫銷氨醇桿菌。
[0011] 將成Ain妍Aac沁ritt?化3如(9/7如ZH-X-08菌株接種于無機鹽培養(yǎng)基中，28 °C 培養(yǎng)3 d，加入5血無菌水，振蕩得到菌息液；將菌息液W 5-7 %的比例接種至裝有30-50 HiL發(fā)酵培養(yǎng)基的250 mL H角瓶中進行發(fā)酵培養(yǎng)；培養(yǎng)溫度28-30 C，搖床轉速200巧m， 培養(yǎng)時間72 h，即制得菌株ZH-X-08發(fā)酵液。
[0012] 將由化-X-08菌株制備的ZH-X-08菌株發(fā)酵液稀釋4-8倍后，在煙草移栽時，每株 煙草德灌稀釋液100 ml至根系周圍，可明顯降低±壤中鄰苯二甲酸二（2-己基己基）醋的 含量，促進煙株生長。
[0013] 所述無機鹽培養(yǎng)基成分及配制方法如下；化2冊〇4 ? 12&0 1. 5-2. 5 g, KH2PO4 0. 3-0. 6g，M拆O4 . 7&0 0. 15- 0. 25 g，（畑4)25〇4 0. 8-1. 2 g，酵母粉 0. 025-0. 06 g，蒸 觸水比，用4 mol/L化OH調節(jié)抑至7. 5 ;鄰苯二甲酸二（2-己基己基)醋(作為底物，能夠 保持并提升菌株降解活性)，溶于丙麗后抽濾滅菌，加到預先滅菌的無機鹽培養(yǎng)基中，使鄰 苯二甲酸二（2-己基己基）醋的濃度為20-30 mg/l，待丙麗揮發(fā)后使用。
[0014] 所述發(fā)酵培養(yǎng)基組成為；葡萄糖0. 05 g/l，酵母粉0. 05 g/l，KH2PO4 0. 6 g/l， (NH4)2S04 I. 5 g/L，MgS〇4 ? 7&0 0. 3 g/L，pH7. 5。
[0015] 本發(fā)明的最大特點是；利用化-X-08菌株經搖瓶發(fā)酵所得菌息液，在煙草種植中 能夠降低煙草自毒物質鄰苯二甲酸二（2-己基己基）醋含量、促進煙株生長。
[0016]

【具體實施方式】： W下的實施例便于更好地理解本發(fā)明，但并不限定本發(fā)明。下述實施例中實驗方法，女口 無特殊說明，均為常規(guī)方法。W下實施例中的試驗，均設置H次重復，結果取平均值。
[0017] 實施例1 、傷如iingobacterium thalpo地ilum 難獻按照5%接種量餐兩予無敢鹽鎮(zhèn)泰 基（化2冊〇4 ? 12&0 2. 0 g，KH2PO4 0. Sg, M拆〇4 ? 7&0 0. 2 g，（畑4)25〇4 1. 0 g，酵母粉 0. 05 g，鄰苯二甲酸二（2-己基己基）醋30 mg/L)中，28 C培養(yǎng)3山加入5血無菌水，振蕩得 到菌息液。將菌息液W 5 %的比例接種至裝有30 mL發(fā)酵培養(yǎng)基的250 mL H角瓶中進行 發(fā)酵培養(yǎng)。培養(yǎng)溫度28 °C，搖床轉速200 rpm，培養(yǎng)時間72 h。即制得菌株ZH-X-08發(fā)酵 液。
[0018] 發(fā)酵培養(yǎng)基組成；葡萄糖 0. 05 g/l，酵母粉 0. 05 g/l，KH2PO4 0. 6 g/l，（NH4)2S04 I. 5 g/L，M拆O4 ? 7&0 0. 3 g/L，pH 7. 5。
[0019] 壤盆栽方式進行驗證試驗，試驗在鄭州煙草研究院溫室內進行。盆栽±壤采 自鄭州市郊，±壤有機質含量為20. 33 g ? kg-i，總氮2. 63 g ? kg-i，pH值6. 89讓水比為 1:2. 5)，有效磯 26. 31 mg .kg-i，速效鐘 96. 72 mg ^kg-IiDEHP 含量方 4. 23 mg .kg-i?！廊里L 干后過20目篩，在盆栽前一周采用慘±法拌入nh4N〇3、kh2P〇4、kn〇3和K2SO4等化學純試劑， 使±壤含N量達1. 0徑/1^干±，曲伸)邊。2〇日)邊化2〇)=1:1:3,同時采用慘±法設置5. 0 mg/kg 和10 mg/kg兩個DEHP添加水平，每盆裝入±壤2. 0 kg。將發(fā)酵稀釋4倍和8倍后作稀釋 液備用。施用方式1 :在裝盆時采用慘±法將稀釋液100 ml均勻拌入盆栽±壤中(慘±法)； 施用方式2;將100 ml稀釋液在移栽時W灌根方式德灌在煙草根部±壤周圍(灌根法)。同 時設置空白對照，重復3次，試驗共計30盆。盆栽每3天德200 ml去離子水1次，移栽后 30 d采用破壞性取樣，分別采集±壤和煙株樣品，測定±壤中DEHP含量和煙草生物量(地 上部和根系)。試驗結果詳見表1。該菌株發(fā)酵液能夠降低±壤中鄰苯二甲酸二（2-己基己 基）醋含量15 % W上，較對照提高煙草生物量10 % W上。
[0020]

【權利要求】
1. 一種降解鄰苯二甲酸二（2-乙基己基)酯的菌株，其特征在于：所述降解鄰苯二甲酸 二（2-乙基己基）酯的菌株為嗜溫鞘氨醇桿菌成37/7〇/7力以?) Zh-X-08 菌株，該菌株于2013年08月27日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中 心，保藏號：CGMCCNo.8075。
2. 根據(jù)權利要求1所述的降解鄰苯二甲酸二（2-乙基己基）酯的菌株，其特征在于：該菌株在LB平板上圓形，直徑1. 5~2. 5 mm，淡黃，表面光滑，濕潤，低凸起，邊緣裂葉狀；菌 體桿狀，無鞭毛，不運動，大小為（〇. 5(T〇. 60) iimX (0. 9(T2. 0) iim;結合生理生化特性及 16SrDNA序列，可鑒定為嗜溫鞘氨醇桿菌。
3. -種利用權利要求1所述的菌株制備Zh-X-08菌株發(fā)酵液的方法，其特征在于：將 Zh_X-〇8菌株接種于無機鹽培養(yǎng)基中，28 °C培養(yǎng)3 d，加 入5 mL無菌水，振蕩得到菌懸液；將菌懸液以5 %的比例接種至裝有30 mL發(fā)酵培養(yǎng)基的 250 mL三角瓶中進行發(fā)酵培養(yǎng)；培養(yǎng)溫度28 °C，搖床轉速200 rpm，培養(yǎng)時間72 h，即制得 菌株Zh-X-08發(fā)酵液。
4. 根據(jù)權利要求3所述的制備Zh-X-08菌株發(fā)酵液的方法，其特征在于：所述無機鹽 培養(yǎng)基成分及配制方法如下：Na2HP04 ? 12H20 1. 5-2. 5 g，KH2P04 0? 3-0. 6g，MgS04 ? 7H20 0.15- 0.25 g，（NH4)2S04 0 . 8-1.2 g，酵母粉 0.025-0. 06 g，蒸餾水 1L，用 4 mol/L NaOH 調節(jié)pH至7.5 ;鄰苯二甲酸二（2-乙基己基)酯溶于丙酮后抽濾滅菌，加到預先滅菌的無機 鹽培養(yǎng)基中，使鄰苯二甲酸二（2-乙基己基）酯的濃度為20-30 mg/L，待丙酮揮發(fā)后使用。
5. 根據(jù)權利要求3所述的制備Zh-X-08菌株發(fā)酵液的方法，其特征在于：所述發(fā)酵 培養(yǎng)基組成為：葡萄糖 0.05 g/L，酵母粉 0.05 g/L，KH2P04 0 . 6 g/L，（NH4)2S04 1.5 g/L， MgS04 ? 7H20 0? 3 g/L，pH7. 5。
6. -種權利要求1所述的降解鄰苯二甲酸二（2-乙基己基）酯的菌株在煙草種植中的 應用，其特征在于：將由Zh-X-08菌株制備的ZH-X-08菌株發(fā)酵液添加煙草根際中可明顯降 低土壤鄰苯二甲酸二（2-乙基己基）酯的含量，促進煙株生長。
7. 根據(jù)權利要求6所述的降解鄰苯二甲酸二（2-乙基己基）酯的菌株在煙草種植中的 應用，其特征在于：將發(fā)酵液稀釋4-8倍后，在煙草移栽時，每株煙草澆灌100ml稀釋液。
【文檔編號】C12R1/01GK104357367SQ201410677772
【公開日】2015年2月18日 申請日期:2014年11月24日 優(yōu)先權日:2014年11月24日
【發(fā)明者】張仕祥, 奚家勤, 過偉民, 王建偉, 郭建華, 周漢平, 薛超群, 王愛國, 尹啟生, 張艷玲, 梁太波 申請人:中國煙草總公司鄭州煙草研究院