復(fù)方杏香兔耳風(fēng)提取物在制備預(yù)防、治療肝損傷保健品或藥物上的應(yīng)用的制作方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明屬于中藥提取物【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及復(fù)方杏香兔耳風(fēng)提取物在制備預(yù)防、治療肝損傷保健品或藥物上的應(yīng)用。本發(fā)明考察并證實(shí)了復(fù)方杏香兔耳風(fēng)的乙醇提取物和水提醇沉提取物有保肝作用，能用于預(yù)防、治療肝損傷。
【專(zhuān)利說(shuō)明】復(fù)方杏香兔耳風(fēng)提取物在制備預(yù)防、治療肝損傷保健品或藥物上的應(yīng)用
[0001]【技術(shù)領(lǐng)域】
本發(fā)明屬于中藥提取物【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及復(fù)方杏香兔耳風(fēng)提取物在制備預(yù)防、治療肝損傷保健品或藥物上的應(yīng)用。
[0002]【背景技術(shù)】
肝臟是體內(nèi)新陳代謝的中心站，是人體最大、最重要的解毒器官，可保護(hù)機(jī)體免受損害，具有十分重要的生理功能，而肝損傷常常會(huì)導(dǎo)致各種嚴(yán)重的肝臟疾病。
[0003]肝損傷是由于肝臟受到多種因素(如病毒、藥物、試劑、缺氧和免疫因素等)的入侵，從而引起的肝臟受損，導(dǎo)致炎癥、肝纖維化、肝硬化、肝衰竭等多種疾病的發(fā)生，且發(fā)病率和死亡率高，是一種常見(jiàn)的威脅人類(lèi)健康的疾病。肝損傷的臨床表現(xiàn)主要是:腹腔內(nèi)出血和血液、膽汁引起 的腹膜刺激征，按損傷類(lèi)型和嚴(yán)重程度而有所差異。另外，肝損傷還伴有常見(jiàn)并發(fā)癥為:感染、膽瘺、繼發(fā)性出血和急性肝腎功能衰竭。因此，預(yù)防和治療肝損傷是我們面臨的重大問(wèn)題。
[0004]目前，治療肝損傷的方法和藥物有很多，且均有一定療效，但也存在著一些明顯的不足。一方面，西藥的毒副作用大，另一方面，隨著中醫(yī)藥事業(yè)和中西醫(yī)結(jié)合研究的不斷發(fā)展，實(shí)驗(yàn)和臨床研究證明，中藥在抗菌抗病毒、抗氧化、抗肝纖維化、改善肝功能、改善微循環(huán)以及調(diào)節(jié)免疫功能等方面有較好的療效，且安全、可靠，預(yù)示著中藥在治療肝損傷方面的良好如景。
[0005]目前，在研究各種肝臟疾病的發(fā)病機(jī)制和篩選治療藥物時(shí)，常采用與人類(lèi)肝臟疾病病理機(jī)制相似的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型。其中，腹腔注射CCl4誘導(dǎo)體內(nèi)肝損傷是研究急性肝損傷最常用的典型模型。當(dāng)體內(nèi)受到有毒物質(zhì)CCl4侵入時(shí)，正常情況下，肝臟通過(guò)細(xì)胞色素P45tl酶系的氧化作用代謝CCl4，從而達(dá)到解毒的目的，但當(dāng)有毒物質(zhì)攝入過(guò)量時(shí)，則產(chǎn)生大量的自由基CCI3?及Cl.，這些自由基可與肝細(xì)胞內(nèi)大分子發(fā)生共價(jià)結(jié)合，攻擊膜下飽和脂質(zhì)，弓丨起脂質(zhì)過(guò)氧化，使肝細(xì)胞損傷，細(xì)胞內(nèi)GOT和GPT滲入血液，表現(xiàn)為血清中的GOT和GPT活性升高，且只要有1%的肝細(xì)胞壞死，足以使血清中的GPT的活性升高I倍。因此，在急性或者活動(dòng)性肝病中，血清GOT和GPT是最敏感的檢測(cè)指標(biāo)，血清中GOT和GPT含量可以用于肝病的篩查，也可用于判斷、評(píng)價(jià)肝病的臨床治療。MDA是脂質(zhì)過(guò)氧化的最終產(chǎn)物，可嚴(yán)重破壞細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致細(xì)胞腫脹、壞死、凋亡，其含量高低可反應(yīng)氧化的損傷程度。SOD是細(xì)胞內(nèi)清除自由基的主要抗氧化酶，被視為生命科技中最具有神奇魔力的酶，是人體內(nèi)的垃圾清道夫，可抑制自由基啟動(dòng)的脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)，從而起到保護(hù)細(xì)胞膜的作用。因此，MDA的含量和SOD的活性可作為衡量脂質(zhì)過(guò)氧化程度的指標(biāo)，間接反映機(jī)體組織、細(xì)胞損傷的程度。通過(guò)檢測(cè)小鼠肝勻漿中的SOD活性及MDA含量可反映出藥物對(duì)肝細(xì)胞的保護(hù)作用。因此，以血清GPT、GOT、肝組織SOD活性及MDA含量作為指標(biāo)來(lái)探討藥物對(duì)肝臟的保護(hù)作用是非常有意義的。
[0006]復(fù)方杏香兔耳風(fēng)主要由杏香兔耳風(fēng)和白術(shù)加工而成，具有清熱解毒、祛瘀生新之功，常用于濕熱下注所致慢性宮頸炎、子宮內(nèi)膜炎、陰道炎、白帶等癥。隨著現(xiàn)代藥理學(xué)研究及臨床實(shí)踐的深入，多種復(fù)方杏香兔耳風(fēng)制劑已廣泛應(yīng)用于臨床治療婦科疾病。目前國(guó)內(nèi)外對(duì)復(fù)方杏香兔耳風(fēng)單味藥杏香兔耳風(fēng)和白術(shù)報(bào)道較多，然而有關(guān)復(fù)方杏香兔耳風(fēng)報(bào)道較少，主要集中在藥理作用、臨床應(yīng)用、質(zhì)量控制方面，但未見(jiàn)其對(duì)體外抗氧化和保肝作用的相關(guān)報(bào)道。
[0007]
【發(fā)明內(nèi)容】

本發(fā)明的目的在于提供一種復(fù)方杏香兔耳風(fēng)提取物的新應(yīng)用。
[0008]本發(fā)明的技術(shù)方案為:
復(fù)方杏香兔耳風(fēng)提取物在制備預(yù)防、治療肝損傷保健品或藥物上的新應(yīng)用。
[0009]復(fù)方杏香兔耳風(fēng)提取物采用以下方法制得:取杏香兔耳風(fēng)和白術(shù)(漂)，二者質(zhì)量比為2-4:1，加60-80% (V/V)乙醇，加熱回流提取2-3次，每次1-2 h，并過(guò)濾，合并濾液，用旋蒸儀濃縮干燥得乙醇提取物。
[0010]復(fù)方杏香兔耳風(fēng)提取物采用以下方法制得:取杏香兔耳風(fēng)和白術(shù)(漂)，二者質(zhì)量比為2-4:1，加水煎煮2-3次，每次1-2 h，合并煎液，濾過(guò)，濾液濃縮至相對(duì)密度為1.08(600C )的浸膏，放冷，加乙醇使含醇量為65-70% (V/V)，靜置24 h，取上清液，沉淀用65-80% (V/V)乙醇洗滌，洗液與上清液合并，回收乙醇，濃縮干燥得水提醇沉提取物。
[0011]為證實(shí)上述復(fù)方杏香兔耳風(fēng)的抗氧化作用，本發(fā)明采用微量抗氧化方法，分析復(fù)方杏香兔耳風(fēng)乙醇提取物和水提醇沉提取物清除DPPH、ABTS自由基和還原Fe3+的能力。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，復(fù)方杏香兔耳風(fēng)乙醇提取物和水提醇沉提取物均有一定清除清除DPPH和ABTS自由及還原Fe3+的能力。
[0012]為證實(shí)上述復(fù)方杏香兔耳風(fēng)的保肝作用，采用了四氯化碳誘導(dǎo)的急性肝損傷小鼠模型，考察其保肝活性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，復(fù)方杏香兔耳風(fēng)乙醇提取物和水提醇沉提取物能顯著降低急性肝損傷小鼠血清中GPT、GOT水平和肝臟勻漿液中MDA含量，同時(shí)能顯著升高肝臟勻漿液中SOD活力，且復(fù)方杏香兔耳風(fēng)乙醇提取物和水提醇沉提取物體內(nèi)和體外均有一定的抗氧化活性。
[0013]【專(zhuān)利附圖】

【附圖說(shuō)明】
圖1為乙醇提取物和水提醇沉提取物質(zhì)量濃度對(duì)ABTS自由基的影響。
【具體實(shí)施方式】
[0014]實(shí)施例1:
復(fù)方杏香兔耳風(fēng)乙醇提取物由以下方法提取獲得:取200 g干燥杏香兔耳風(fēng)和100 g白術(shù)(漂)，加1200 mL60%乙醇，加熱回流提取2次，并過(guò)濾，第一次2 h，第二次I h，合并濾液，用旋蒸儀濃縮干燥得39.43 g乙醇提取物。
[0015]實(shí)施例2:
復(fù)方杏香兔耳風(fēng)乙醇提取物由以下方法提取獲得:取300 g干燥杏香兔耳風(fēng)和100 g白術(shù)(漂)，加2400 mL70%乙醇，加熱回流提取3次，并過(guò)濾，每次I h，合并濾液，用旋蒸儀濃縮干燥得49.12 g乙醇提取物。
[0016]實(shí)施例3:
復(fù)方杏香兔耳風(fēng)水提醇沉提取物由以下方法提取獲得:取250 g干燥杏香兔耳風(fēng)和100 g白術(shù)(漂)，加水煎煮二次，每次2 h，合并煎液，濾過(guò)，濾液濃縮至相對(duì)密度為1.08(60°C )的浸膏，放冷，加乙醇使含醇量為70%，靜置24 h，取上清液，沉淀用70%乙醇洗滌二次，洗液與上清液合并，回收乙醇，濃縮干燥得56.98 g水提醇沉提取物。
[0017]實(shí)施例4:
復(fù)方杏香兔耳風(fēng)水提醇沉提取物由以下方法提取獲得:取400 g干燥杏香兔耳風(fēng)和100 g白術(shù)(漂)，加水煎煮三次，每次I h，合并煎液，濾過(guò)，濾液濃縮至相對(duì)密度為1.08(600C )的浸膏，放冷，加乙醇使含醇量為65%，靜置24 h，取上清液，沉淀用80%乙醇洗滌二次，洗液與上清液合并，回收乙醇，濃縮干燥得82.94 g水提醇沉提取物。
[0018]效果實(shí)驗(yàn)一:
復(fù)方杏香兔耳風(fēng)的體外抗氧化活性篩選試驗(yàn)。
[0019]試驗(yàn)方法
樣品:復(fù)方杏香兔耳風(fēng)乙醇提取物(實(shí)施例一)、復(fù)方杏香兔耳風(fēng)水提醇沉提取物(實(shí)施例三)分別溶于甲醇中，配成初始濃度均為2 mg/mL的甲醇溶液。
[0020]陽(yáng)性對(duì)照:BHT、BHA, PG分別溶于甲醇中，陽(yáng)性對(duì)照初始濃度為I mg/mL的BHT甲醇溶液、初始濃度為0.6 mg/mL的BHA甲醇溶液、初始濃度為0.4 mg/mL的PG甲醇溶液。
[0021]對(duì)于DPPH和ABTS方法，若自由基清除率大于50%，則需要進(jìn)一步稀釋樣品，使自由基清除率在50%以下，根據(jù)濃度-抑制率作圖，求出IC5tl值，對(duì)于FRAP方法，若測(cè)定的吸光度A不在標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍內(nèi)， 則需要進(jìn)一步稀釋樣品，再測(cè)定。每個(gè)方法平行操作三次，陽(yáng)性對(duì)照為 BHT、BHA、PG。
[0022](I) DPPH 法
設(shè)樣品組為10 μ L樣品+175 μ L DPPH (200 MmoI/L)的甲醇溶液，樣品作3個(gè)平行，求平均值；另設(shè)空白對(duì)照組(10 PL甲醇+175 PLDPPH甲醇溶液(200 MmoI/L));以10μ LBHT 甲醇溶液 +175 μ L DPPH 甲醇溶液(200 Mmol/L)、10 μ L BHA 甲醇溶液 +175 μ LDPPH 甲醇溶液(200 Mmol/L)、10 μ L PG 甲醇溶液+175 μ L DPPH 甲醇溶液(200 Mmol/L)為陽(yáng)性對(duì)照；均避光反應(yīng)20 min后，用酶標(biāo)儀在515 nm處測(cè)定吸光度值。按公式(1_1)計(jì)算清除率:
7同 1? 庫(kù)^ [ (Acontrol ^sample
)/A_trol] XlOO(公式 1-1)
式中A_trol為DPPH本身在測(cè)定波長(zhǎng)的吸光度值，Asample為樣品對(duì)DPPH作用后的吸光度值(除去樣品自身吸收)。
[0023](2) ABTS 法
ABTS工作液的配制:將7 mmol/LTBTS水溶液與2.45 mmol/LK2S208水溶液混合后，常溫下放置12 h以上使用，使用時(shí)用甲醇溶液稀釋?zhuān)⑹刮舛仍?34 nm處為0.80±0.02。設(shè)樣品組為10 PL樣品+200 μL ABTS工作液，樣品作三個(gè)平行，求平均值；另設(shè)空白對(duì)照組(10 PL樣品+200 μL甲醇)；以10 μ LBHT甲醇溶液+200 μL ABTS工作液、10 μ L BHA甲醇溶液+200 μL ABTS工作液、10 μ L PG甲醇溶液+200 μL ABTS工作液為陽(yáng)性對(duì)照；避光反應(yīng)20 min后，用酶標(biāo)儀在405 nm處測(cè)定吸光度值。按公式(1_2)計(jì)算自由基清除率。
[0024]清除率=[(Acontrol-Asample)/Acontrol] X 100(公式 1-2)
式中A_trol為ABTS自由基本身在測(cè)定波長(zhǎng)的吸光度值，Asample為樣品對(duì)ABTS自由基作用后的吸光度值(除去樣品自身吸收)。
[0025](3) FRAP 方法依照文獻(xiàn)(FRAP法微量模型的建立)的方法配制TPTZ工作液，將0.3 mo I/L醋酸鈉緩沖液(PH 3.6) UO mmol/L TPTZ 溶液、20 mmol/L FeCl3.6H20 溶液按體積比為 10:1:1 混合即得。樣品測(cè)定組為10 PL樣品+200 μL TPTZ工作液，每份樣品平行操作3次，取平均值?？瞻讓?duì)照組為10 PL樣品加200 PL甲醇，以10 μ LBHT甲醇溶液+200 μL TPTZ工作液、10 μ L BHA甲醇溶液+200 μL TPTZ工作液、10 μ L PG甲醇溶液+200 μL TPTZ工作液為陽(yáng)性對(duì)照，將各組溶液混勻，37°C反應(yīng)40 min后用酶標(biāo)儀測(cè)定595 nm處吸光度，根據(jù)Trolox標(biāo)準(zhǔn)曲線y=0.0008χ_0.0050 Cr=0.9975),計(jì)算樣品的Trolox當(dāng)量(即每克樣品還原Fe3+能力相當(dāng)于Tio1x還原Fe3+能力的微摩爾數(shù))表示。若所測(cè)定樣品吸光度值超過(guò)線性范圍，則需要進(jìn)一步稀釋樣品。
[0026]實(shí)驗(yàn)結(jié)果
【權(quán)利要求】
1.復(fù)方杏香兔耳風(fēng)提取物在制備預(yù)防、治療肝損傷保健品或藥物上的應(yīng)用。
2.如權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于，復(fù)方杏香兔耳風(fēng)提取物采用以下方法制得:取杏香兔耳風(fēng)和白術(shù)，加乙醇，加熱回流提取，并過(guò)濾，濾液濃縮干燥得乙醇提取物。
3.如權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于，復(fù)方杏香兔耳風(fēng)提取物采用以下方法制得:取杏香兔耳風(fēng)和白術(shù)，加水煎煮，濾過(guò)，濾液濃縮至浸膏，放冷，加乙醇，靜置，取上清液，沉淀用乙醇洗滌，洗液與上清液合并，回收乙醇，濃縮干燥得水提醇沉提取物。
【文檔編號(hào)】A23L1/30GK103933099SQ201410077994
【公開(kāi)日】2014年7月23日 申請(qǐng)日期:2014年3月5日 優(yōu)先權(quán)日:2014年3月5日
【發(fā)明者】康文藝, 崔雪靖, 連朋麗, 朱曉娣 申請(qǐng)人:河南大學(xué)