一種rna保存液、包含該保存液的試劑盒及其應用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種RNA保存液、包含該保存液的試劑盒及其應用，屬于分子生物學領(lǐng)域，該保存液是濃度為3.8M-5.2M的甜菜堿水溶液，可以根據(jù)需要將該保存液制成商業(yè)化的試劑盒等；采用本發(fā)明的保存液，RNA樣品以液態(tài)保存于低溫條件下，可在-20℃條件下可完整保存至少一年，或在4℃可完整保存一周，可避免反復冰凍溶解對RNA樣品造成的物理損害。并且在反轉(zhuǎn)錄、PCR等反應體系中不但不影響酶反應效率，還對反應效率和長鏈RNA的處理均有正面影響，還可用于溶解過度真空干燥保存的RNA。本保存液可以有效地解決RNA溶解、保存及使用時遇到的物理損傷、RNase降解、水解、容器吸附損失及細菌污染等影響，特別是對微量RNA的保存、重復使用及運輸具有重大應用價值。
【專利說明】一種RNA保存液、包含該保存液的試劑盒及其應用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及分子生物學領(lǐng)域，特別涉及一種RNA保存液、包含該保存液的試劑盒及其應用。
【背景技術(shù)】
[0002]核糖核酸(RNA，Nuecleic Acid)為細胞的主要成分之一，參與細胞的各種功能活動，是生物學，醫(yī)學，藥學等生命有關(guān)學科研究的重要對象。
[0003]在絕大多數(shù)涉及RNA表達的研究或醫(yī)療應用的診斷預后測定中，均需用高度純化的RNA作反應的底物。但是，純化后的RNA極易被核糖核酸酶(即RNase)降解和受冷凍融化過程的影響而斷裂。在生物樣品中廣泛存在并極度穩(wěn)定的RNase對RNA的水解作用很強，許多RNase對RNA的降解作用不需任何輔助因子，給RNA的純化、儲存和使用帶來極大困難。
[0004]實際應用中，用不含RNase的水或加入了 EDTA、檸檬酸鈉等螯合劑的水溶解的RNA可在-80 0C的超低溫冰箱中保存一年，凍存過程中樣品在水溶劑從液態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)楣虘B(tài)，使用時尚需融化成液態(tài)，部分RNA在此過程中因相變形成的物理張力的剪切作用而斷裂，反復凍融引起不可忽視的損害，如果是微量的RNA樣品這種保存方法幾乎無法勝任。
[0005]為了解決反復凍融對RNA造成損害的問題，現(xiàn)有技術(shù)采用將RNA溶解于甲酰胺的方法。甲酰胺作溶劑可保證純化后的RNA在_20°C條件下保存一年以上并可反復凍融使用而無降解。溶解于甲酰胺的RNA發(fā)生構(gòu)象變化，RNA分子受到壓縮，體積比在水溶劑里小。但是，甲酰胺雖然可以抑制RNase反應，同時也會致使RNA變性，增大溶解難度，直接將甲酰胺溶解的RNA用于酶反應會對反應效率帶來不確定的影響，使用前需重新沉淀以去除甲酰胺，極大的限制了其應用。`
[0006]另外，RNA經(jīng)乙醇沉淀后存放于_20°C可以做到長期保存，但每次使用均需將RNA重新離心洗滌、溶解，給RNA驗證引入額外的誤差，影響測量的重復性，無助于RNA的反復使用。
[0007]當然，許多其他的化學變性劑被報道或者已經(jīng)用于保存含有RNA的生物樣品，如商業(yè)化了的RNAlater、TRIZol等，這些試劑含有酶反應抑制因子和蛋白質(zhì)變性劑以保證RNA在純化之前不被降解。這些抑制因子在隨后的分離純化過程中被除掉，不會存留于純化后的RNA樣本中。有時候這些試劑也籠統(tǒng)地被稱為RNA保存液，其用途是保護生物樣本中的RNA在純化以前不受降解,而非純化后RNA的保存。
[0008]綜上所述，降解或部分降解的RNA會導致基因表達譜的改變，提取并保證高質(zhì)量的RNA對準確測定目標基因有重大意義。一種能夠有效阻止RNase降解、可避免RNA反復凍融造成的物理損傷并且不影響后續(xù)反應效率RNA保存液，對RNA的分子生物學研究和臨床上的應用非常重要，也是目前RNA保存迫切需要解決的重要技術(shù)難題。

【發(fā)明內(nèi)容】
[0009]本發(fā)明的發(fā)明目的之一，在于針對上述存在的問題，提供一種可避免RNA反復凍融造成的物理損傷并且不影響后續(xù)反應效率的RNA保存液。
[0010]本發(fā)明采用的技術(shù)方案是這樣的:一種RNA保存液，該保存液是濃度為3.8M-5.2M的甜菜堿水溶液。
[0011]甜菜堿(Betaine,也稱Trimethylglycine 或 Oxyneurine),是一種天然次生代謝產(chǎn)物，參與膽堿的氧化代謝和細胞滲透的平衡等多種生化生理功能活動。關(guān)于甜菜堿，已經(jīng)有很多應用。本申請的發(fā)明人通過大量實驗，得到上述的技術(shù)方案。甜菜堿屬于惰性很高的化學物質(zhì)，溶于高純度的水可形成PH7.8左右的微堿溶液，甜菜堿溶液高度穩(wěn)定，可在室溫或4°C的條件下長期保存而無分解。將3.8M-5.2M的甜菜堿溶液保存于4°C的條件下3年之久后，仍可用于增強PCR擴增，不會引起DNA的降解。含有2.4 M的甜菜堿的PCR濃縮液，在-20°C條件下可穩(wěn)定保存4年仍能用于擴增單位數(shù)的DNA分子。在實際應用中，3.8M-5.2M的甜菜堿溶液可保存在4°C潮濕的環(huán)境中，即使保存環(huán)境已出現(xiàn)細菌生長，也不影響其重復使用。由于甜菜堿的高滲透性，高濃度的甜菜堿溶液具有明顯的抑制細菌生長的作用。而Tris或檸檬酸用作RNA溶解保存液，均 需小心避免細菌污染，否則，細菌可在這些溶液里生長并提供大量的RNase，不利于微量RNA的保存和反復使用。
[0012]在本申請中，我們把濃度大于3.8 M的甜菜堿溶液稱為高濃度甜菜堿溶液。本領(lǐng)域公知的，本發(fā)明中的溶液濃度單位“M”為“mol/L”。
[0013]實驗證明:用3.8M-5.2M的甜菜堿溶液保存的RNA可在_20°C條件下可完整保存至少一年，或在4°C儲存可完整保存一周，因此可用冰袋保存，便于郵寄和運輸。
[0014]SDS等表面活性劑，可助溶RNA和DNA，一般用于過度干燥的RNA或DNA的溶解。RNA溶解后，在用于酶反應以前，需經(jīng)進一步純化以去除SDS等對酶反應的負面影響。甜菜堿可降低GC堿基之間的氫鍵配對形成的結(jié)合力，5M的甜菜堿溶液可完全抵消GC與AT配對的差異，使得核糖核酸之間的聯(lián)系更為松散，有利于加快核糖核酸的溶解速度和溶解度的提升。3.8M-5.2M的甜菜堿溶液是比水更好的DNA溶劑，可溶解DNA形成高達10 mg/ml的均勻溶液。而在水溶劑中，5mg/ml的DNA溶液已趨近溶解極限。高純度甜菜堿對RNA和DNA無明顯的降解作用，溶解于3.8M-5.2M的甜菜堿溶液的RNA，在-18°C至_26°C的低溫保存條件下儲藏至少12個月后，與用甲酰胺保存的相同樣品比較濃度無改變，經(jīng)瓊脂糖電泳比較顯示真核RNA特征性的28s和18s,無降解拖尾。
[0015]Ambion 公司的 The RNA Storage Solution (AM7OOO)含有 ImM 的朽1 樣酸鈉，可用于RNA的溶解和保存，但并不能防止反復冰凍融解對RNA造成的損害，并且很難防止細菌在檸檬酸溶液中的生長繁殖。
[0016]在反轉(zhuǎn)錄、PCR和RNA鏈接等反應體系可直接加入達反應總體積40%的3.8M_5.2M甜菜堿溶液而不影響酶反應效率。并因高濃度甜菜堿溶液具有松弛高GC含量引起的RNA鏈間吸引，減少RNA高級結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性，對反應效率和長鏈RNA的處理均有正面影響。高濃度甜菜堿溶液對紫外光譜范圍的光波的吸收值極小，不影響測量核酸含量時常用的0D260/0D280/0D230讀數(shù)，可用實驗室通用的紫外分光光度計進行RNA濃度定量。也不影響RiboGreen,Qubit RNA分析的熒光染料與RNA的結(jié)合，高濃度甜菜堿溶液中的RNA，其質(zhì)量和濃度可直接利用于Qubit 2.0突光光度計、Agilent BioAnalyzer 2100分析鑒定。
[0017]作為優(yōu)選方案:所述甜菜堿水溶液中還加入RNase抑制因子，所加入的RNase抑制因子與甜菜堿水溶液的比例，按體積比計，為1: (100-10000)。
[0018]加入適量的RNase抑制因子可中和微量RNase，進一步的保護RNA不受RNase的降解。
[0019]作為優(yōu)選方案:所述甜菜堿水溶液中還加入螯合劑。所述螯合劑優(yōu)選為檸檬酸鈉或 EDTA。
[0020]螯合劑可螯合部分RNase作用所需要的高價陽離子，均可不同程度的增進前述的甜菜堿溶液對RNA的保護作用。
[0021]作為優(yōu)選方案:所述甜菜堿水溶液中還加入緩沖劑。所述緩沖劑優(yōu)選為三羥甲基氨基甲烷，即Tris。
[0022]本發(fā)明的目的之二在于提供一種包含上述RNA保存液的試劑盒。更易于商業(yè)化應用。
[0023]本發(fā)明的目的之三在于，提供一種上述保存液在用于保存含有RNA的樣品中的應用。
[0024]作為上述應用的技術(shù)方案之一:將純化后的RNA樣品溶解于所述保存液,然后在4°C保存，可保存至少一周。
[0025]作為上述應用的另一個技術(shù)方案:將純化后的RNA樣品溶解于所述保存液，然后在-10°c至-28°C環(huán)境下以液態(tài)形式保存，可保存至少12個月。
[0026]作為優(yōu)選的技術(shù)方案:在_20°C環(huán)境下保存。
[0027]作為上述保存液的另一方面的應用:將所述保存液作為RNA溶劑或稀釋液。
[0028]發(fā)明人通過大量實驗發(fā)現(xiàn)，相比水溶劑，RNA更易溶解于高濃度甜菜堿溶液，可以更方便快捷地得到均勻溶液，用其作為RNA稀釋液可降低因稀釋操作帶來的誤差。本發(fā)明的保存液也可溶解冰凍干燥的RNA樣品，可在20分鐘內(nèi)溶解過度干燥的RNA樣品，形成濃度至少高達9.6 mg/ml的均勻透明液體。
[0029]綜上所述，由于采用了上述技術(shù)方案，本發(fā)明的有益效果是:采用本發(fā)明的保存液，RNA樣品以液態(tài)保存于低溫條件下，可在_20°C條件下可完整保存至少一年，或在4°C可完整保存一周。這樣，無須解凍RNA樣本即可反復使用，避免反復冰凍溶解對RNA樣品造成的物理損害。并且在反轉(zhuǎn)錄、PCR等反應體系中高達反應總體積40%的甜菜堿溶液不但不影響酶反應效率，而且因高濃度甜菜堿溶液具有松弛高GC含量引起的RNA鏈間吸引，減少RNA高級結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性，從而對反應效率和長鏈RNA的處理均有正面影響。高濃度甜菜堿溶液在紫外光譜范圍的光吸收值甚微，不影響核酸含量用常規(guī)的0D260/0D280/0D230讀數(shù)，可用實驗室通用的紫外分光光度計進行RNA濃度定量。也不影響RiboGreeruQubit RNA分析的熒光染料與RNA的結(jié)合，因此高濃度甜菜堿溶液中的RNA可直接用Qubit 2.0熒光光度計、Agilent 2100 BioAnalyzer 分析。
[0030]另外，相比水溶劑，RNA在本發(fā)明的甜菜堿溶液中具有很高的溶解度，即RNA更易溶解于甜菜堿溶液。溶解于本發(fā)明的保存液可形成高達9.6 mg/ml的均勻溶液，可以更方便快捷地得到均勻溶液。本發(fā)明的保存液還可以作為RNA稀釋液，以降低因稀釋操作帶來的誤差，這個特性使其可用于溶解過度真空干燥保存的RNA，從而避免使用SDS等表面活性劑溶液助溶。置于該溶液中核酸可在不用液氮或超低溫冰箱的條件保存較長時間而不影響RNA的完整性，從而有效地解決RNA溶解、保存及使用時遇到的物理損傷、RNase降解、水解、容器吸附損失及細菌污染等影響，特別是對微量RNA的保存、重復使用及運輸具有重大應用價值。
[0031]【專利附圖】

【附圖說明】
圖1為純化后的RNA在不同保存液中、在-20°c保存12個月后的結(jié)果圖；
圖2為純化后的RNA在_20°C低溫保存360天后，再用不同的保存液在4°C保存，24及48小時后的RNA狀態(tài)圖；
圖3為重復凍融過程造成不同溶劑中RNA物理損傷的比較圖；
圖4為RNase抑制因子增強甜菜堿溶液對抗RNase A降解能力圖；
圖5為高濃度的甜菜堿幫助DNA溶解圖；
圖6為過度干燥的RNA在高濃度甜菜堿溶液中的溶解情況圖；
圖7為高濃度甜菜堿溶液作為稀釋液的效果圖；
圖8為不同濃度的甜菜堿溶液保存RNA的效果圖；
圖9為甲酰胺和高濃度甜菜堿溶液對Qubit RNA熒光定量的影響圖；
圖10為不同體積的5 M甜菜堿溶液和甲酰胺對反轉(zhuǎn)錄反應效率的影響圖；
圖11為5 M甜菜堿溶液中加入不同濃度的Tris對反轉(zhuǎn)錄反應效率的影響圖；
圖12為5 M甜菜堿溶液中加入不同濃度的EDTA對反轉(zhuǎn)錄反應效率的影響圖；` 圖13為不同保存時間對高濃度甜菜堿溶液中溶解的RNA總量的影響圖；
圖14為不同保存時間對水中溶解的RNA總量的影響圖；
圖15為RNA降解實驗第8天時，miR-92a和miR_92b分子拷貝數(shù)變化的比較圖；
圖16為冰袋保存的RNA經(jīng)4天時間的轉(zhuǎn)運后RNA樣本的電泳圖；
圖17和圖18為圖16中樣品的RIN值分析圖。
[0032]
【具體實施方式】
[0033]下面對本發(fā)明作詳細的說明。
[0034]為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案及優(yōu)點更加清楚明白，以下結(jié)合實施例，對本發(fā)明進行進一步詳細說明。應當理解，此處所描述的具體實施例僅僅用以解釋本發(fā)明，并不用于限定本發(fā)明。
[0035]實施例1:溫度和濃度對甜菜堿溶液物理狀態(tài)的影響
甜菜堿易溶于水，溶解飽和度可達5.5M以上。我們對濃度為2.4M - 5.2M的甜菜堿溶液在分子生物學實驗室常用的_20°C冰箱中保存條件下的物理狀態(tài)進行了連續(xù)4天的觀測。在整個實驗的實施過程中，每天對冰箱實際溫度進行兩次測定(相隔至少8小時)，實際測得的溫度在_18°C至_26°C之間。冰箱的頻繁使用是解釋較大溫度差異的一個主要原因。結(jié)果顯示:3.SM以上濃度的甜菜堿溶液可以液態(tài)保持在-20°C的低溫條件下，而濃度低于
3.6M的溶液在相同條件下成固態(tài)。加入IM的KCl可降低3.6M甜菜堿溶液的凝固點，使其在_20°C冰箱的保存條件下轉(zhuǎn)為液態(tài)。不同濃度的甜菜堿溶液在4°C的保存條件下均呈液態(tài)。在長達數(shù)年的實際使用中，-20C冰箱中保存的3.8M以上濃度的甜菜堿溶液均以液態(tài)形式成在，無一例固化。4°C和_20°C低溫保存條件是現(xiàn)代生物醫(yī)學實驗室的對生物樣品最基本的保存手段之一，與RNA保存有密切關(guān)系。我們的測試結(jié)果證明高濃度甜菜堿溶液尤其是3.8M-5.2M的甜菜堿溶液具有成為核糖核酸保護劑的潛在能力。具體結(jié)果見表1。
[0036]表1:不同甜菜堿溶液濃度在_20°C冰箱中保存120天后的溶液物理狀態(tài)
【權(quán)利要求】
1.一種RNA保存液，其特征在于:所述保存液是濃度為3.8M-5.2M的甜菜堿水溶液。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的RNA保存液，其特征在于:所述甜菜堿水溶液中還加入RNase抑制因子，所加入的RNase抑制因子與甜菜堿水溶液的比例，按體積比計，為1:(100-10000)。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的RNA保存液，其特征在于:所述甜菜堿水溶液中還加入螯合劑。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的RNA保存液，其特征在于:所述甜菜堿水溶液中還加入緩沖劑。
5.包含權(quán)利要求1至4任意一項所述的RNA保存液的試劑盒。
6.權(quán)利要求1至4任意一項所述的RNA保存液在用于保存含有RNA的樣品中的應用。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的應用，其特征在于:將純化后的RNA樣品溶解于所述保存液，然后在4 C保存。
8.根據(jù)權(quán)利要求6所述的應用，其特征在于:將純化后的RNA樣品溶解于所述保存液，然后在-10°C至_28°C環(huán)境下以液態(tài)形式保存。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的應用，其特征在于:在_20°C環(huán)境下保存。
10.權(quán)利要求1 至4任意一項所述的RNA保存液的應用，其特征在于:將所述保存液作為RNA溶劑或稀釋液。
【文檔編號】C12N5/10GK103881978SQ201410077772
【公開日】2014年6月25日 申請日期:2014年3月5日 優(yōu)先權(quán)日:2014年3月5日
【發(fā)明者】徐凱, 唐放, 李四軍, 張耀藝 申請人:成都諾恩生物科技有限公司