專利名稱：一種用于分離rna結(jié)合蛋白所結(jié)合rna的試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及分子生物學(xué)領(lǐng)域，尤其涉及一種分離結(jié)合于RNA結(jié)合蛋白上的RNA的試劑盒。
背景技術(shù)：
基因表達(dá)的調(diào)控在生物體內(nèi)細(xì)胞的生長、分化和應(yīng)激反應(yīng)等方面都起著重要的作用。但除通過轉(zhuǎn)錄因子對(duì)轉(zhuǎn)錄過程進(jìn)行調(diào)控之外，細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控也在生理過程中起著重要的作用，其中包括通過RNA結(jié)合蛋白(RNA-binding proteins, RBPs)對(duì)mRNA轉(zhuǎn)錄速度進(jìn)行特異性和快速的調(diào)控。目前，這種通過RBPs和非編碼RNA對(duì)mRNA的調(diào)控機(jī)制的研究才剛剛開始。RNA免疫共沉淀(RNA immunoprecipitating,RIP)是一種基于抗原抗體反應(yīng)，通過免疫共沉淀的方法研究體內(nèi)與RNA結(jié)合蛋白(RNAbindingprotein,RBPs)特異性結(jié)合的RNA轉(zhuǎn)錄本之間關(guān)系的技術(shù)。一方面大多數(shù)的RNA都需要和特定的RNA結(jié)合蛋白結(jié)合才能穩(wěn)定存在于細(xì)胞中，進(jìn)而發(fā)揮翻譯模版的作用；另一方面，也有些RNA結(jié)合蛋白能夠使結(jié)合的RNA降解加 快以降低其對(duì)應(yīng)蛋白質(zhì)的翻譯水平，防止某些蛋白質(zhì)的過度表達(dá)。這種RNA結(jié)合蛋白對(duì)蛋白質(zhì)翻譯的平衡作用在生理過程中至關(guān)重要。除此之外，這種調(diào)節(jié)作用在RNA的轉(zhuǎn)錄、修飾、運(yùn)輸、降解以及翻譯過程中都起到了重要的作用。RIP是利用RNA結(jié)合蛋白的抗體免疫沉淀RNA-蛋白復(fù)合物，再從沉淀的RNA-蛋白復(fù)合物中分離得到能結(jié)合特定RNA結(jié)合蛋白的那些RNA，得到的這些RNA可以通過RNA電泳、RNA測序、定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)、基因芯片分析(RIP芯片)等分子生物學(xué)方法進(jìn)行下一步生物分析。因此，通過RNA結(jié)合蛋白分離鑒定對(duì)應(yīng)的RNA對(duì)RNA結(jié)合蛋白和RNA本身的研究都是不可或缺的研究方法。但是，目前使用的方法不同，影響因素多，極易污染樣品同時(shí)RNA又極易受到廣泛存在的RNA酶的影響而常常導(dǎo)致最終所得收率極低且RNA質(zhì)量不能保證。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種分離提取細(xì)胞中與特定RNA結(jié)合蛋白結(jié)合的mRNA的試劑盒。本發(fā)明提供的用于分離結(jié)合于特定RNA結(jié)合蛋白上RNA的分離提取試劑盒，包括溫和裂解液、緩沖液和磁珠。試劑盒中的溫和裂解液包括:濃度為IOOmM的KC1，濃度為5mM的MgC12，濃度為IOmM的4-羥乙基哌嗪乙磺酸，濃度為0.5%的表面活性劑，濃度為IOOmM的二硫蘇糖醇，濃度為100單位/mL的RNA酶抑制劑,濃度為0.05mg/mL的苯甲基磺酰氟，I μ g/mL的抑肽酶，I μ g/mL的亮肽素，I μ g/mL的胃蛋白酶抑制劑。焦碳酸二乙酯處理后的超純水。試劑盒中的緩沖液包括，pH7.4，濃度為50mM的Tris、濃度為150mM的NaCl、濃度為ImM的MgCl2和濃度為0.05%的表面活性劑Nonidet P-40。使用本發(fā)明的試劑盒進(jìn)行RNA結(jié)合蛋白上RNA分離的步驟如下:
1.細(xì)胞樣品的mRNP裂解液的準(zhǔn)備:細(xì)胞樣品，每組準(zhǔn)備3 X IO7個(gè)細(xì)胞(約IOOmm培養(yǎng)皿3-4個(gè))，用含胎牛血清的完全培養(yǎng)基輕柔洗一次，再用預(yù)冷IOmL磷酸鹽緩沖液洗一次，加適量3mL磷酸鹽緩沖液后用細(xì)胞刮刀收集后離心，用4倍于細(xì)胞離心團(tuán)塊體積的預(yù)冷裂解液重懸，輕柔重懸后與冰上放置10分鐘充分裂解，收集細(xì)胞樣品于_80°C儲(chǔ)存過夜，利于細(xì)胞的破碎。2.第二天，將細(xì)胞裂解液于冰上解凍，裂解液于4°C離心30分鐘，14000Xg，上清液轉(zhuǎn)移至無酶EP管中，置于冰上備用。3.用Bradford或考馬斯亮藍(lán)法測定蛋白濃度，蛋白濃度為15 μ g/μ L左右，每個(gè)樣品最少需要3mg的裂解物。4.磁珠的洗滌準(zhǔn)備，提前一天開始:用緩沖液重懸磁珠A和磁珠G得到均勻重懸溶液，將ImL磁珠轉(zhuǎn)移到EP管中，將EP管置于磁力架上，I分鐘后，輕輕吸去上清，將EP管從磁力架上取下，加入2mL緩沖液溫和重懸，重復(fù)以上操作2次后，將EP管置于磁力架上，I分鐘，輕輕吸去上清，將EP管從磁力架上取下，加入400 μ L溶液溫和重懸，分裝到2個(gè)EP管，立刻進(jìn)行下一步。5.抗體的包被:抗體200 μ g加入100 μ L磁珠A，IgG抗體90 μ g加入100 μ L磁珠G,各自通過溶液補(bǔ)足體積1200 μ L,置于旋轉(zhuǎn)儀上溫和混懸,4°C包被過夜,包被后的磁珠A和磁珠G分別用1.6mL緩沖液洗滌4遍，步驟同4，洗滌后立刻使用。6.加樣如下:包被后磁珠 100 μ L, DTT20 μ L, RNase OUT 12 μ L，0.5Μ EDTA66 μ L,細(xì)胞裂解物6mg,最后補(bǔ)足體積1.2mL。7.mRNP免疫沉淀步驟:快速混勻后，室溫溫和混懸4小時(shí)，置于磁力架上收集沉淀，以1.6mL預(yù)冷緩沖液洗滌5次，最后去除緩沖液立刻進(jìn)行下一步。8.mRNA的提取:每個(gè)樣品加入ImL Trizol，室溫放置8分鐘，顛倒幾次，將EP管置于磁力架上I分鐘，棄去上清，每管加入0.2mL氯仿，渦旋，室溫放置2-3分鐘，4°C離心5分鐘12000 Xg,收集上清(約0.5-0.6mL),加入同樣體積的異丙醇,5 μ L glycogen,顛倒?jié)櫺?20°C孵育5-10分鐘，4°C，12000 Xg離心10分鐘，棄上清，用75%乙醇渦旋洗滌，4°C，12000 X g離心10分鐘，揮干后以30 μ L無核酸酶水重溶，得到RNA。需要另外準(zhǔn)備的普通試劑包括:Trizol，氯仿，乙醇，異丙醇，磷酸鹽緩沖液。本發(fā)明通過以上步驟得到的即為特定RBPs特異結(jié)合的mRNA，可進(jìn)行進(jìn)一步純化鑒定、定量分析或者用于微陣列芯片等研究。該試劑盒中各試劑均比例經(jīng)過改進(jìn)優(yōu)化，能夠簡便、穩(wěn)定、以較高收率得到細(xì)胞中與特定RNA結(jié)合蛋白結(jié)合的mRNA，用于進(jìn)一步cDNA的實(shí)時(shí)定量及微陣列芯片檢測等后續(xù)研究。


圖1表示熒光定量PCR技術(shù)檢測HuR蛋白結(jié)合的C0X-2在正常組和模型組中的表達(dá)水平。
具體實(shí)施例方式以下結(jié) 合附圖和具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步說明，但本發(fā)明遠(yuǎn)不僅限于一下實(shí)施例。
實(shí)施例1對(duì)LPS刺激后Raw264.7細(xì)胞中RNA結(jié)合蛋白HuR所結(jié)合mRNA的分離1、試劑來源:(I)磁珠 A 為 Invitrogen 公司 Dynabeads ；(2)磁珠 G 為 Invitrogen 公司 Dynabeads ；(3)本發(fā)明所述小鼠IgG為Sigma公司生產(chǎn)；(4) RNA 酶抑制劑為為 Invitrogen 公司生產(chǎn) Rnase OUT ；(5)蛋白酶混合抑制劑Roche公司生產(chǎn)；(6) KCl，MgCl2, H印es，表面活性劑Nonidet P-40，二硫蘇糖醇，4_羥乙基哌嗪乙磺酸均為Sigma公司生產(chǎn)。2、儀器來源:(I)冷凍離心機(jī)，Sigma ；(2)酶標(biāo)儀，iQ5Multi color Red-time PCR Deteetion System,均為 Bio-Rad ;(3)四維旋轉(zhuǎn)儀，其林貝爾；(4)磁力架，Invitrogen ；(5) Gene Quent 核酸定量儀，GE 公司；1.細(xì)胞樣品的mRNP裂解液的準(zhǔn)備:Raw264.7細(xì)胞，加入LPS (50ng/mL)，刺激12小時(shí)，設(shè)空白對(duì)照和LPS模型對(duì)照，每組樣品準(zhǔn)備3 X IO7個(gè)細(xì)胞(約IOOmm培養(yǎng)皿3_4個(gè))，用含F(xiàn)BS的完全培養(yǎng)基輕柔洗一次，再用預(yù)冷IOmL PBS緩沖液洗一次，加適量3mL PBS后用細(xì)胞刮刀收集后離心，用4倍于細(xì)胞離心團(tuán)塊體積的預(yù)冷裂解液重懸,輕柔重懸后與冰上放置10分鐘充分裂解，收集細(xì)胞樣品于_80°C儲(chǔ)存過夜，利于細(xì)胞的破碎。2.第二天，將細(xì)胞裂解液于冰上解凍，裂解液于4°C離心30分鐘，14000 X g，上清液轉(zhuǎn)移至無酶EP管中，置于冰上備用。3.用Bradford或考馬斯亮藍(lán)法測定蛋白濃度，蛋白濃度為15 μ g/μ L左右，每個(gè)樣品最少需要3mg的裂解物。4.磁珠的洗滌準(zhǔn)備，提前一天開始:用緩沖液重懸磁珠A和磁珠G得到均勻重懸溶液，將ImL磁珠轉(zhuǎn)移到EP管中，將EP管置于磁力架上，I分鐘后，輕輕吸去上清，將EP管從磁力架上取下，加入2mL緩沖液溫和重懸，重復(fù)以上操作2次后，將EP管置于磁力架上，I分鐘，輕輕吸去上清，將EP管從磁力架上取下，加入400 μ L溶液溫和重懸，分裝到2個(gè)EP管，立刻進(jìn)行下一步。5.抗體的包被:HuR抗體400 μ g加入200 μ L磁珠A，IgG抗體180 μ g加入200 μ L磁珠G,各自通過溶液補(bǔ)足體積1200 μ I,置于旋轉(zhuǎn)儀上溫和混懸,4°C包被過夜,包被后的磁珠A和磁珠G分別用1.6mL緩沖液洗滌4遍，步驟同4，洗滌后立刻使用。6.加樣如下 :包被后磁珠 100μ L，DTT20y L，RNase 0UT12 μ L，0.5MEDTA66 μ L，細(xì)胞裂解物6mg,最后補(bǔ)足體積1.2mL。7.mRNP免疫沉淀步驟:快速混勻后，室溫溫和混懸4小時(shí)，置于磁力架上收集沉淀，以1.6mL預(yù)冷緩沖液洗滌5次，最后去除緩沖液立刻進(jìn)行下一步。8.mRNA的提取:每個(gè)樣品加入ImL Trizol，室溫放置8分鐘，顛倒幾次，將EP管置于磁力架上I分鐘，棄去上清，每管加入0.2mL氯仿，渦旋，室溫放置2-3分鐘，4°C離心5分鐘12000 Xg,收集上清(約0.5-0.6mL),加入同樣體積的異丙醇,5 μ L glycogen,顛倒?jié)櫺?20°C孵育5-10分鐘，4°C，12000 Xg離心10分鐘，棄上清，用75%乙醇渦旋洗滌，4°C，12000 X g離心10分鐘，揮干后以30 μ L無核酸酶水重溶，通過核酸定量儀檢測，得到定量結(jié)果如下:表IRNA結(jié)合蛋白免疫共沉淀所得RNA濃度
權(quán)利要求
1.一種用于分離結(jié)合于特定RNA結(jié)合蛋白上RNA的分離提取試劑盒，其特征在于，包括裂解液、緩沖液和磁珠。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的分離提取試劑盒，其特征在于，所述裂解液包括:濃度為IOOmM的KCl，濃度為5mM的MgCl2,濃度為IOmM的4-羥乙基哌嗪乙磺酸，濃度為0.5%的表面活性劑，濃度為IOOmM的二硫蘇糖醇，濃度為100單位/mL的RNA酶抑制劑，濃度為0.05mg/mL的苯甲基磺酰氟，I μ g/mL的抑肽酶,I μ g/mL的亮肽素，I μ g/mL的胃蛋白酶抑制劑。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的分離提取試劑盒，其特征在于，所述裂解液配方液體介質(zhì)為焦碳酸二乙酯處理后的超純水。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的分離提取試劑盒，其特征在于，所述緩沖液包括，PH7.4，濃度為50mM的Tris、濃度為150mM的N`aCl、濃度為ImM的MgCl2和濃度為0.05%的表面活性劑。
全文摘要
本發(fā)明涉及分子生物學(xué)領(lǐng)域，尤其涉及一種分離結(jié)合于RNA結(jié)合蛋白上的RNA的試劑盒。本發(fā)明的試劑盒用于分離提取純化結(jié)合于特定RNA結(jié)合蛋白上RNA，試劑盒包括裂解液、緩沖液和磁珠。該試劑盒中各試劑均比例經(jīng)過改進(jìn)優(yōu)化，能夠簡便、穩(wěn)定、以通過抗體抗原反應(yīng)和磁場原理較高收率得到細(xì)胞中與特定RNA結(jié)合蛋白結(jié)合的mRNA，用于進(jìn)一步cDNA的實(shí)時(shí)定量及微陣列芯片檢測等后續(xù)研究。
文檔編號(hào)C12N15/10GK103232998SQ20131013812
公開日2013年8月7日 申請(qǐng)日期2013年4月22日 優(yōu)先權(quán)日2013年4月22日
發(fā)明者張陸勇, 張爽, 孫麗新 申請(qǐng)人:中國藥科大學(xué)