專利名稱：乙肝病毒體外感染的血清模型和細胞模型及其建立方法
技術領域：
本發(fā)明屬于動物細胞系領域，具體地指一種乙肝病毒體外感染的血清模型和細胞模型及其建立方法。
背景技術：
全球各地都有乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)感染者，在亞洲、非洲、太平洋等地區(qū)乙型肝炎病毒HBV是危害人類健康，引起人類肝臟疾病的主要病原體之一。中國是乙型肝炎的高發(fā)區(qū)，乙型肝炎病毒對肝細胞的持續(xù)感染又導致部分人肝功能異常并最終發(fā)展成為比較嚴重的肝臟疾病，其中包括肝硬化和肝細胞癌。目前的抗乙型肝炎病毒的藥物如干擾素和核苷類似物又因嚴重的副作用限制了其在臨床上的廣泛應用。研究清楚乙型肝炎病毒的生活史和其致病機制尤其是宿主與乙型肝炎病毒之間的相互作用，可以給抗病毒藥物的研發(fā)提供新的思路。目前對于乙型肝炎病毒的結構，復制過程以及生物學特性有了一定的了解，但是由于乙型肝炎病毒有嚴格的宿主特異性，只能感染人類和少數靈長類動物的肝臟組織，不感染低級靈長類和其他哺乳動物，在一定程度上限制了其生活史和發(fā)病機制的研究。乙型肝炎病毒具有較嚴格的種屬特異性，雖然有類人猿和黑猩猩作為乙型肝炎病毒體內感染模型得到公認，但是價格昂貴，難以推廣。鑒于嗜肝病毒屬具有相似的病毒結構和復制特點，利用其它動物嗜肝DNA病毒建立的細胞感染模型和動物模型用于乙肝肝炎病毒的研究。樹駒可以感染乙型肝炎病毒，但是樹駒感染乙型肝炎病毒是一過性的，乙型肝炎病毒復制和表達水平都不高。土撥鼠肝炎病毒(woodchuck hepatitis B virus, WHBV)感染的土撥鼠，以及鴨乙肝病毒(duck hetpatitis B virus, DHBV)可以感染鴨肝細胞,但是土撥鼠肝炎病毒和鴨乙 肝病毒和人乙型肝炎病毒有一定差異，使得乙型肝炎的發(fā)病機制和機體的應答研究受到限制。目前尚無用于乙型肝炎病毒體外感染的細胞模型，對乙型肝炎病毒感染早期階段的分子機制缺乏深入了解，特別是血清中哪些物質參與乙型肝炎病毒入胞，病毒感染過程中相關的細胞上的大分子(受體)等。體外培養(yǎng)的人原代肝細胞可以支持乙型肝炎病毒的復制，但由于原代肝細胞感染乙型肝炎病毒有時間限制不能進行傳代培養(yǎng)，隨著時間的延長一些肝細胞的功能下降，失去了典型的多角形態(tài)。王安輝等在2004年以及2003年發(fā)表論文《乙型肝炎病毒感染體外培養(yǎng)細胞的實驗研究》，直接用病人的高拷貝血清感染細胞，從而在細胞內觀察到乙肝病毒特異性蛋白。但是沒有辦法證明是血清因素還是乙肝病毒本身的因素在乙肝病毒入胞時候發(fā)揮作用。HepG2細胞是目前研究乙型肝炎病毒最常用的肝癌細胞系之一，支持乙型肝炎病毒的復制但不能被乙型肝炎病毒自然感染。經過DMSO (二甲基亞砜)處理的IfepG2細胞可以被乙型肝炎病毒感染。DMSO作用是促進乙型肝炎病毒進入細胞機制尚不明確，是促進細胞內的一些未知蛋白的表達使細胞維持在一定的細胞周期，或者是提高了病毒結合細胞的能力，或者在某一環(huán)節(jié)誘導某一基因表達的提聞等有待于進一步的探索。但是DMSO可以促進胞內未知蛋白的表達，使細胞維持在一定的細胞周期內。Gripon等從慢性丙型肝炎導致的肝癌患者體內分離出細胞，并且加入DMSO和地塞米松培養(yǎng)，建立了 IfepaRG細胞株。該細胞株具有肝細胞相似的形態(tài)和生理學功能，對乙型肝炎病毒易感。但是由于該細胞株的建立在DMSO和地塞米松的輔助下完成，故不能很好的詮釋HBV感染的機制。盡管乙型肝炎病毒在體內具有很高的感染性，但是在體外的細胞培養(yǎng)中卻很難建立有效的感染。乙型肝炎病毒早期階段如HBV的識別與吸附肝細胞的分子等的研究仍不是十分清楚，現(xiàn)有的關于乙肝病毒早期感染的資料多來自于對DHBV的研究。

發(fā)明內容
本發(fā)明所要解決的技術問題就是提供一種乙肝病毒體外感染的血清模型和細胞模型及其建立方法，該血清模型可以與細胞共培養(yǎng)，在體外進行感染，得到HBV-DNA和Dane顆粒。細胞模型可以用于研究乙肝病毒入胞過程中的受體。使用該細胞模型時，感染過程中不添加任何輔助分子，如DMSO和PEG等，而且實驗重復多次，具有很好的重復性。為解決上述技術問題，本發(fā)明提供一種乙肝病毒體外感染的血清模型，該血清模型由去除病毒的乙肝大三陽血清和H印G2.2.15病毒顆?；旌隙桑渲?，所述去除病毒的大三陽血清的拷貝數為HBV-DNA〉IO8Copies/mL。進一步地，所述細胞模型的拷貝數為f 9.9*104~5COpieS/mL。
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本發(fā)明還提供一種利用乙肝病毒體外感染的血清模型得到的細胞模型，該細胞模型由正常肝細胞/肝癌細胞與血清模型共培養(yǎng)而成。進一步地，所述肝癌細胞為H印G2，所述正常肝細胞為changlive細胞。本發(fā)明還一種乙肝病毒體外感染的血清模型建立方法，其特征在于:I)收集乙肝大三陽血清，然后初步除去血清中沉淀物及其細胞碎片雜物，再沉淀病毒，得到去除病毒的乙肝大三陽血清，其中，所述去除病毒的乙肝大三陽血清的拷貝數為HBV-DNA>108copies/mL ；2)收集H印G2.2.15細胞，然后初步除去H印G2.2.15細胞中沉淀物及其細胞碎片雜物，再沉淀病毒，去除上清得到H印G2.2.15病毒顆粒；3)將去除病毒的乙肝大三陽血清與H印G2.2.15病毒顆粒混合均勻，得到細胞模型。本發(fā)明還提供了一種根據乙肝病毒體外感染的血清模型和細胞模型在乙肝病毒體體外感染的應用。本發(fā)明的有益效果在于:1、本發(fā)明提供的細胞廣泛來源易得，保持了肝癌細胞的一般特性可以無限制傳代培養(yǎng)。2、本發(fā)明提供的方法簡便，并且較好的模擬乙肝病毒進入細胞的自然過程。3、根據本發(fā)明提供的模型不破壞細胞結構，可以更好的研究乙肝病毒入胞過程中的受體，為乙肝病毒的預防和治療提供新的思路。


圖1為血清模型驗證分組示意圖2為去感染后不同時間點各組細胞上清中的乙肝病毒表面抗原的測定；圖3為各組細胞上清中不同時間點HBV-DNA的拷貝數；圖4為電鏡下觀察高拷貝血清混合組去感染后繼續(xù)孵育24h時的細胞上清中的乙肝病毒;圖5為激光共聚焦觀察各組細胞內表面抗原和核心抗原的表達，Bar，50um ；圖6為去感染24h后各組細胞中的核心抗原的表達；圖7為應用Western Blot方法檢測各組不同時間段細胞內HBcAg的表達。
具體實施例方式為了更好地解釋本發(fā)明，以下結合具體實施例進一步闡明本發(fā)明的主要內容，但本發(fā)明的內容不僅僅局限于以下實施例。英文縮略詞表
權利要求
1.一種乙肝病毒體外感染的血清模型，其特征在于:該血清模型由去除病毒的乙肝大三陽血清和H印G2.2.15病毒顆?；旌隙?，其中，所述去除病毒的乙肝大三陽血清的拷貝數為 HBV-DNA>108copies/mL。
2.根據權利要求1所述乙肝病毒體外感染的血清模型，其特征在于:所述血清模型的拷貝數為 I 9.9*104 5copies/mL。
3.一種利用權利要求1乙肝病毒體外感染的血清模型得到的細胞模型，其特征在于:該細胞模型由正常肝細胞/肝癌細胞與血清模型共培養(yǎng)而成。
4.根據權利要求3所述細胞模型，其特征在于:所述肝癌細胞為IfepG2，所述正常肝細胞為changlive細胞。
5.—種如權利要求1所述乙肝病毒體外感染的血清模型建立方法，其特征在于: 1)收集乙肝大三陽血清，然后初步除去血清中沉淀物及其細胞碎片雜物，再沉淀病毒，得到去除病毒的乙肝大三陽血清，其中，所述去除病毒的乙肝大三陽血清的拷貝數為HBV-DNA>108copies/mL ； 2)收集H印G2.2.15細胞，然后初步除去H印G2.2.15細胞中沉淀物及其細胞碎片雜物，再沉淀病毒，去除上清得到H印G2.2.15病毒顆粒； 3)將去除病毒的乙肝大三陽血清與H印G2.2.15病毒顆?；旌暇鶆颍玫窖迥Ｐ?。
6.一種根據權利要求1所述乙肝病毒體外感染的血清模型和細胞模型在乙肝病毒體外感染的應用?！?br> 全文摘要
本發(fā)明公開一種乙肝病毒體外感染的血清模型和細胞模型及其建立方法，該血清模型由去除病毒的乙肝大三陽血清和HepG2.2.15病毒顆?；旌隙?，其中，所述去除病毒的乙肝大三陽血清的拷貝數為HBV-DNA>108copies/mL。該細胞模型由正常肝細胞/肝癌細胞與血清模型共培養(yǎng)而成。本發(fā)明提供的細胞廣泛來源易得，保持了肝癌細胞的一般特性可以無限制傳代培養(yǎng)。本發(fā)明提供的方法簡便，并且較好的模擬乙肝病毒進入細胞的自然過程。
文檔編號C12N7/00GK103243067SQ20131013693
公開日2013年8月14日 申請日期2013年4月19日 優(yōu)先權日2013年4月19日
發(fā)明者廖家智, 孫淑珍, 林菊生, 何星星, 黎培員 申請人:華中科技大學同濟醫(yī)學院附屬同濟醫(yī)院