專利名稱：一種棉花Gh FPF1蛋白及其編碼基因和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種棉花蛋白及其編碼基因和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
短季棉的推廣是解決我國糧棉爭地、保證糧食安全的重要途徑。早熟型是棉花品種的重要性狀之一，而花期是衡量棉花熟性的重要指標之一?；ㄊ侵参锏拇紊鞴?，高等植物的地上部分來自莖端分生組織(shoot apicalmeristem, SAM),即位于莖頂端的一群未分化的小細胞,莖端分生組織進而發(fā)育成莖、葉、花序分生組織及花分生組織。開花決定過程是植物生殖生長啟動的第一個階段，是花發(fā)端和花器官形成的基礎(chǔ)，所以開花決定過程直接控制作物生育期的早晚。因此克隆棉花開花相關(guān)基因，對其進行表達分析和轉(zhuǎn)基因功能驗證，為短季棉育種提供優(yōu)質(zhì)的基因資源。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個目的是提供一種蛋白，名稱為Gh FPF1,來源于棉花(Gossypiumspp)。本發(fā)明所述蛋白是如下I)或2)的蛋白:I)序列表中的SEQ ID Na.2所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；2)將序列表中的SEQ ID Na.2的氨基酸殘基序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且與植物開花相關(guān)的由I)衍生的蛋白質(zhì)。序列表中SEQ ID N0.`2所示的氨基酸序列由109個氨基酸殘基組成。上述I)和2)中的Gh FPFl蛋白可人工合成，也可先合成其編碼基因，再進行生物表達得到。上述I)和2)中的Gh FPFl蛋白的編碼基因可通過將序列表中SEQ ID Na.1的第8-334位核苷酸所示的DNA序列缺失一個或幾個氨基酸殘基的密碼子，和/或進行一個或幾個堿基對的錯義突變后得到。編碼所述Gh FPFl蛋白的核酸分子也屬于本發(fā)明的保護范圍。所述核酸分子可以是DNAjB cDNA、基因組DNA或重組DNA ;所述核酸分子也可以是 RNA，如 mRNA、hnRNA 或 tRNA 等。本發(fā)明的又一個目的是提供所述蛋白的編碼基因。所述編碼基因具有下述核苷酸序列之一:I)序列表中SEQ ID Ns:1第8_334位的核苷酸序列；2)編碼序列表中SEQ ID No:2蛋白質(zhì)序列的多核苷酸序列；3)在高嚴謹條件下可與序列表中SEQ ID Ns:1限定的DNA序列雜交的核苷酸序列；4)與I)或2)或3)限定的DNA序列具有90%以上同源性，且編碼相同功能蛋白質(zhì)的DNA序列；具體的，所述同源性為95%以上；再具體的為96%以上；再具體的為97%以上；再具體的為98%以上；再具體的為99%以上。
上述高嚴謹條件可為用6X SSC, 0.5% SDS的溶液，在65°C下雜交，然后用2X SSC,
0.1 % SDS 和 I X SSC, 0.1 % SDS 各洗膜一次。其中，序列表中的SEQ ID Ns:1由401個核苷酸組成，其開放閱讀框架(ORF)為自5/末端第8-334位核苷酸，編碼序列表中SEQ ID N2:2所示的蛋白質(zhì)，即本發(fā)明所述的GhFPFl蛋白。含有上述核酸分子的重組載體、表達盒、轉(zhuǎn)基因細胞系或重組菌也屬于本發(fā)明的保護范圍。所述重組載體可為重組表達載體，也可為重組克隆載體。所述重組表達載體可用現(xiàn)有的表達載體構(gòu)建。所述表達載體還可包含外源基因的3’端非翻譯區(qū)域，即包含聚腺苷酸信號和任何其它參與mRNA加工或基因表達的DNA片段。所述聚腺苷酸信號可引導聚腺苷酸加入到mRNA前體的3’端。使用所述基因構(gòu)建重組表達載體時，在其轉(zhuǎn)錄起始核苷酸前可加上任何一種增強型、組成型、組織特異型或誘導型啟動子，它們可單獨使用或與其它的啟動子結(jié)合使用；此外，使用本發(fā)明的基因構(gòu)建重組表達載體時，還可使用增強子，包括翻譯增強子或轉(zhuǎn)錄增強子。為了便于對轉(zhuǎn)基因植物細胞或植物進行鑒定及篩選，可對所用植物表達 載體進行加工，如加入在植物中表達可產(chǎn)生顏色變化的酶或發(fā)光化合物的基因(GUS基因、GFP基因、螢光素酶基因等)、具有抗性的抗生素標記物(慶大霉素標記物、卡那霉素標記物等)或是抗化學試劑標記基因(如抗除莠劑基因)等。從轉(zhuǎn)基因植物的安全性考慮，可不加任何選擇性標記基因，直接以逆境篩選轉(zhuǎn)化植株。擴增本發(fā)明所述編碼基因全長或其任意片段的引物對也屬于本發(fā)明保護的范圍。本發(fā)明的另一個目的是提供本發(fā)明所述蛋白、編碼基因和含有所述編碼基因的重組載體、表達盒、轉(zhuǎn)基因細胞系或重組菌在如下1)-3)至少一種中的應(yīng)用:I)調(diào)節(jié)植物生育期；2)調(diào)節(jié)植物開花時間；3)調(diào)節(jié)植物蓮座葉數(shù)量；4)調(diào)節(jié)植物莖生葉數(shù)量。所述調(diào)節(jié)植物生育期為使植物的生育期提前；所述調(diào)節(jié)植物開花為促進植物開花；所述調(diào)節(jié)植物蓮座葉數(shù)量為減少植物蓮座葉數(shù)量；所述調(diào)節(jié)植物莖生葉數(shù)量為減少植物莖生葉數(shù)量；所述植物為雙子葉植物或單子葉植物；所述雙子葉植物具體為擬南芥或棉花。本發(fā)明的還一個目的是提供本發(fā)明所述的蛋白、編碼基因和含有所述編碼基因的重組載體、表達盒、轉(zhuǎn)基因細胞系或宿主菌在培育在培育轉(zhuǎn)基因植物中的應(yīng)用。具體的，所述轉(zhuǎn)基因植物具有如下至少一種性狀:1)生育期提前；2)開花時間提前；3)蓮座葉數(shù)量減少；4)莖生葉數(shù)量減少。具體的所述植物為雙子葉植物或單子葉植物；所述雙子葉植物具體為擬南芥或棉花。本發(fā)明再一個目的是提供一種培育轉(zhuǎn)基因植物的方法，是將本發(fā)明所述的編碼基因?qū)肽康闹参?，得到轉(zhuǎn)基因植物。所述轉(zhuǎn)基因植物與所述目的植物相比，具有如下至少一種性狀:1)生育期提前；2)開花時間提前；3)蓮座葉數(shù)量減少；4)莖生葉數(shù)量減少。具體的，所述植物為雙子葉植物或單子葉植物；所述雙子葉植物具體為擬南芥或棉花。本研究從陸地棉中克隆出棉花Gh FPFl基因，成功構(gòu)建植物過表達載體，采用農(nóng)桿菌介導的花序浸染法轉(zhuǎn)化模式植物擬南芥，與對照相比，轉(zhuǎn)基因擬南芥比非轉(zhuǎn)基因擬南芥提前開花5.1天，同時蓮座葉與莖生葉的總數(shù)比野生型擬南芥少2.7片，因此利用該基因可用來培育生育期短的棉花，為轉(zhuǎn)基因植物的培育奠定了基礎(chǔ)。


圖1為轉(zhuǎn)Gh FPFl基因擬南芥在DNA分子水平上的鑒定圖，其中編號I為空白對照、2為野生型擬南芥、3為陽性對照(重組質(zhì)粒)、4-10分別為轉(zhuǎn)基因擬南芥各個株系。圖2為T3代轉(zhuǎn)Gh FPFl基因擬南芥在RNA分子水平上的鑒定圖，WT為野生型擬南芥對照，C0L3、C0L7、C0L4分別為轉(zhuǎn)基因擬南芥各個株系。圖3為野生型和轉(zhuǎn)Gh FPFl基因T3代擬南芥生長3周時的表型對比圖，其中A代表野生型擬南芥，B代表轉(zhuǎn)基因擬南芥。圖4為野生型和轉(zhuǎn)Gh FPFl基因T3代擬南芥生長4周時的表型對比圖，其中A代表野生型擬南芥，B代表轉(zhuǎn)基因擬南芥。
具體實施例方式下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實施例 中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。實施例1、棉花基因Gh FPFl的制備1、RNA 的提取取中棉所36種子(購自中國農(nóng)業(yè)科學院棉花研究所)浸泡一天后種于小花盆中，置于光照培養(yǎng)室中生長一周后，取整個幼苗置于液氮中速凍后存放于-70°冰箱中。提取上述材料的RNA。2、cDNA 的制備 將步驟I制備得到的RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。3、基因的擴增引物序列為:上游引物PI 5 ’ -AGAGAAAATGAGCGGTCCTTG-3 ’下游引物P2 5’ -GCCCGAACATGGTGATTAAG-3’以上述設(shè)計的引物和步驟2所制備得到的中棉所36cDNA為模板，進行PCR擴增。將PCR擴增產(chǎn)物進行測序。測序結(jié)果表明，上述PCR擴增得到具有序列表中SEQIDNa:1的核苷酸序列，共401bp，其中編碼區(qū)長327bp，該編碼區(qū)序列如序列表中SEQIDNa:1中第8-334位核苷酸所示，編碼序列表中SEQ ID Na:2所示的氨基酸序列，共109個氨基酸殘基。將該具有序列表中SEQ ID No:1中第8-334位的核苷酸序列的片段命名為GhFPFl。實施例2、棉花基因Gh FPFl的功能驗證
(一)、表達載體的構(gòu)建(I)帶有特定酶切位點的目的基因片段的獲得上游引物:5’-CTAGTCTAGAATGAGCGGTCCTTGGTGITT-3’ 含酶切位點 XbaI (T/CTAGA)下游引物:5’ -TCCCCCGGGCATCATTTATCCATAACCATGAAC-3，含酶切位點 SmaI (CCC/GGG)以上述設(shè)計的含有酶切位點的引物，以中棉所36的幼苗的cDNA為模板，進行PCR擴增。將擴增獲得的帶有酶切位點的目的片段連接至PGEM-T Easy克隆載體，轉(zhuǎn)化DH5 a感受態(tài)細胞，通過PCR及酶切驗證和序列測定篩選出序列正確的重組載體。(2)pBI121-Gh FPFl植物表達載體的構(gòu)建將步驟(I)制備的重組載體和PBI121質(zhì)粒分別用SmaI和XbaI雙酶切，電泳回收目的基因片段和PBI121載體的大片段產(chǎn)物；將目的基因片段和pBI121的酶切大片段產(chǎn)物用T4連接酶連接過夜；連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 a，37°C培養(yǎng)過夜；挑取單克隆搖菌，測序驗證序列的正確性。所得質(zhì)粒中插入的外源基因的序列為SEQ ID Ns:1第8-337位核苷酸，將該質(zhì)粒命名為pBI121-Gh FPF1。(二)、轉(zhuǎn)Gh FPFl基因擬南芥的獲得1、重組農(nóng)桿菌的獲得將質(zhì)粒pBI121_Gh FPFl轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌LBA4404感受態(tài)細胞中，得到重組菌。提取重組菌的質(zhì)粒送去測序，將測序正確的含有質(zhì)粒pBI121-Gh FPFl的重組菌命名為LBA4404/pBI121-Gh FPFl。2、采用花序浸染法轉(zhuǎn)`化擬南芥(I)將_20°C保存的重組農(nóng)桿菌菌液20iU接種到Iml LB液體培養(yǎng)基中，28°C、180rpm振蕩培養(yǎng)過夜活化，取活化菌液200 U I加入到20ml LB液體培養(yǎng)基28°C、180rpm振蕩培養(yǎng)(2)待菌液OD值約為1.2時，3000轉(zhuǎn)/每分離心菌液收集菌體(3)轉(zhuǎn)化介質(zhì)配方為:1/2MS(大量元素減半，其他不變)、5%蔗糖，0.0lyg/ml芐氨基嘌呤(BAP) ,0.03% silwetL-77, 20mg/L 乙酸丁香酮,KOH 調(diào) pH 值至 5.7 (Steven etal.1998)。(4)用上述轉(zhuǎn)化介質(zhì)懸浮菌體，調(diào)OD至0.8開始浸染(5)將擬南芥花序置于轉(zhuǎn)化介質(zhì)中30-50S，浸染后用保鮮膜將擬南芥包起來，暗培養(yǎng)一天后置于正常條件下培養(yǎng)。3、轉(zhuǎn)Gh FPFl基因擬南芥植株的鑒定(I)轉(zhuǎn)Gh FPFl基因擬南芥植株中Gh FPFl基因的檢測將收獲的種子消毒后種植在含卡那霉素的1/2MS上(瓊脂濃度0.6% )，后進行4°C春化3天，轉(zhuǎn)移到培養(yǎng)室中培養(yǎng)10天左右，二陰性植株葉片變黃，不再生長，將生長正常的植株移栽至小花盆中種植，待生長一個月后，檢測植株中是否轉(zhuǎn)入棉花基因GhFPFl。待測植株中Gh FPFl基因的制備方法與實施例1相同，以ddH20為空白對照，非轉(zhuǎn)基因擬南芥DNA為陰性對照，重組子質(zhì)粒為陽性對照，PCR擴增時所用引物序列為:上游引物:5’ -GATGTGATATCTCCACTGACGT-3 ’下游引物:5，-TCCCCCGGGCATCATTTATCCATAACCATGAAC-3，
其中，上游引物與表達載體相匹配，下游引物與基因相匹配。將擴增產(chǎn)物在1.5%瓊脂糖凝膠上進行電泳檢測，檢測結(jié)果見圖1，上述選取的生長正常的植株和陽性對照組中均可以檢測到約450bp的條帶(基因序列加上表達載體上的一小段序列共約450bp)，而空白對照和野生型擬南芥陰性對照組中均未檢測到相應(yīng)的DNA分子片段，說明Gh FPFl基因已整合到上述擬南芥基因組中。(2) qRT-PCR 檢測收獲步驟(I)篩選出的7株陽性株的Ttl代種子，將種子繁殖至T3代，將T3代種子和野生型擬南芥種子同等條件下種植，兩周分別整株取樣至-70°C保存。隨機選取三個轉(zhuǎn)基因株系C0L3、C0L4、C0L7進行qRT-PCR檢測。按照實施例1的方法分別提取轉(zhuǎn)基因和野生型擬南芥RNA，并反轉(zhuǎn)錄為cDNA，以該cDNA為模板、以擬南芥基因UBQ5為內(nèi)參，，進行qRT-PCR檢測，擴增Gh FPFl基因和UBQ5內(nèi)參基因使用的引物序列為:Gh FPFl 上游引物:5’ -AAACTCAGGITCGGACCAAAGG-3’下游引物:5’ -CCGTCGTATCTTTCCCAACCAA-3 ’UBQ5 上游引物:5 ’ -TAACCCTTGAGGTTGAATCATC-3 ’下游引物:5’ -GTCGATTCCTTCTGGATGTTGT-3 ’qRT-PCR檢測結(jié)果見圖2，結(jié)果表明，Gh FPFl基因在不同的轉(zhuǎn)基因T3R植株中均有不同(高)水平的轉(zhuǎn)錄，但在野生型擬南芥中沒有檢測到Gh FPFl基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物。qRT-PCR檢測結(jié)果進一步證明了 Gh FPFl基因已整合到轉(zhuǎn)基因T3代擬南芥的基因組中并且成功轉(zhuǎn)錄為mRNA。(三)、轉(zhuǎn)GhFPFl基因 擬南芥植株的表型1、將轉(zhuǎn)基因T3代擬南芥與野生型擬南芥同等條件下種植栽培，分別觀察生長3周和4周時的表型，結(jié)果見圖3、4。從圖3可以看出，轉(zhuǎn)基因擬南芥抽薹早于野生型擬南芥；從圖4可以看出，轉(zhuǎn)基因擬南芥的開花時間早于野生型擬南芥。該實驗結(jié)果表明，轉(zhuǎn)基因擬南芥的生育期比非轉(zhuǎn)基因擬南芥明顯提前。2、選取7個轉(zhuǎn)基因T3代株系與野生型和轉(zhuǎn)空載體擬南芥同等條件下種植栽培，每個株系30棵，統(tǒng)計開花時間，并將蓮座葉與莖生葉一并進行計數(shù)，結(jié)果見表I。表I中，WT為野生型擬南芥，C0L1-C0L7為選取的7個T3代轉(zhuǎn)基因擬南芥株系。表I
權(quán)利要求
1.一種蛋白，是如下I)或2)的蛋白: 1)序列表中的SEQID Na.2所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)； 2)將序列表中的SEQID N0.2的氨基酸殘基序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且與植物開花相關(guān)的由I)衍生的蛋白質(zhì)。
2.權(quán)利要求1所述蛋白的編碼基因。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的編碼基因，其特征在于:所述編碼基因具有下述核苷酸序列之一: 1)序列表中SEQID Ns:1第8-334位的核苷酸序列； 2)編碼序列表中SEQID No:2蛋白質(zhì)序列的多核苷酸序列； 3)在高嚴謹條件下可與序列表中SEQID No:1限定的DNA序列雜交的核苷酸序列； 4)與I)或2)或3)限定的DNA序列具有90%以上同源性，且編碼相同功能蛋白質(zhì)的DNA序列；具體的，所述同源性為95%以上；再具體的為96%以上；再具體的為97%以上；再具體的為98%以上；再具體的為99%以上。
4.含有權(quán)利要求2或3所述的編碼基因的重組載體、表達盒、轉(zhuǎn)基因細胞系或宿主菌；所述重組載體具體為重組表達載體或重組克隆載體。
5.擴增權(quán)利要求2或3所述編碼基因全長或其任意片段的引物對。
6.權(quán)利要求1所述的蛋白和權(quán)利要求2-3任一所述的編碼基因和權(quán)利要求4所述的重組載體、表達盒、轉(zhuǎn)基因細胞系或宿主菌在如下1)-4)至少一種中的應(yīng)用: 1)調(diào)節(jié)植物生育期； 2)調(diào)節(jié)植物開花時間； 3)調(diào)節(jié)植物蓮座葉數(shù)量； 4)調(diào)節(jié)植物莖生葉數(shù)量。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的應(yīng)用，其特征在于: 所述調(diào)節(jié)植物生育期為使植物的生育期提前； 所述調(diào)節(jié)植物開花為促進植物開花； 所述調(diào)節(jié)植物蓮座葉數(shù)量為減少植物蓮座葉數(shù)量； 所述調(diào)節(jié)植物莖生葉數(shù)量為減少植物莖生葉數(shù)量； 所述植物為雙子葉植物或單子葉植物；所述雙子葉植物具體為擬南芥或棉花。
8.權(quán)利要求1所述的蛋白和權(quán)利要求2-3任一所述的編碼基因和權(quán)利要求4所述的重組載體、表達盒、轉(zhuǎn)基因細胞系或宿主菌在培育轉(zhuǎn)基因植物中的應(yīng)用；具體的，所述轉(zhuǎn)基因植物具有如下至少一種性狀:1)生育期提前；2)開花時間提前；3)蓮座葉數(shù)量減少；4)莖生葉數(shù)量減少；具體的所述植物為雙子葉植物或單子葉植物；所述雙子葉植物具體為擬南芥或棉花。
9.一種培育轉(zhuǎn)基因植物的方法，是將權(quán)利要求2-3任一所述的編碼基因?qū)肽康闹参铮玫睫D(zhuǎn)基因植物；所述轉(zhuǎn)基因植物與所述目的植物相比，具有如下至少一種性狀:1)生育期提前；2)開花時間提前；3)蓮座葉數(shù)量減少；4)莖生葉數(shù)量減少。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的方法，其特征在于:所述目的植物為雙子葉植物或單子葉植物；所述雙子葉植物具體為擬南芥或棉花。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種棉花Gh FPF1蛋白及其編碼基因與應(yīng)用。該蛋白Gh FPF1，是具有下述氨基酸殘基序列之一的蛋白質(zhì)1)序列表中的SEQ ID №.2的氨基酸殘基序列；2)將序列表中的SEQ ID №.2的氨基酸殘基序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且與植物光合效率相關(guān)的由1)衍生的蛋白質(zhì)。本發(fā)明的蛋白和其編碼基因可用來培育生育期短的棉花，為轉(zhuǎn)基因植物的培育奠定了基礎(chǔ)。
文檔編號C12N15/29GK103183732SQ20131013612
公開日2013年7月3日 申請日期2013年4月18日 優(yōu)先權(quán)日2013年4月18日
發(fā)明者喻樹迅, 王小艷, 范術(shù)麗, 宋美珍, 龐朝友, 魏恒玲 申請人:中國農(nóng)業(yè)科學院棉花研究所