專利名稱：基于雙酶擴(kuò)增的核酸檢測(cè)方法及試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種新的核酸檢測(cè)方法，特別是基于雙酶擴(kuò)增的核酸檢測(cè)方法。
背景技術(shù)：
核酸檢測(cè)與疾病診斷、食品檢驗(yàn)、農(nóng)業(yè)與環(huán)境科學(xué)研究等領(lǐng)域均密切相關(guān)。傳統(tǒng)的核酸檢測(cè)方法主要有Southern blot印跡雜交、瓊脂糖凝膠電泳、表面等離子共振等方法。以上檢測(cè)方法具有費(fèi)時(shí)費(fèi)力，靈敏度低，難以實(shí)現(xiàn)高通量檢測(cè)，甚至還需使用放射性試劑等缺點(diǎn)。核酸擴(kuò)增的方法，例如PCR (聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng))，LCR (連接酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng))，NASBA(核酸序列的擴(kuò)增)等，可大大提高靈敏度，同時(shí)還因操作相對(duì)簡(jiǎn)單使其成為現(xiàn)代分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)常用方法。但是，這些方法需 要精確的溫度控制與熟練的操作人員，這些均限制核酸擴(kuò)增的更廣泛的應(yīng)用。核酸等溫鏈置換聚合酶反應(yīng)(Isothermal strand-displacementpolymerase reaction, ISDPR)因其操作簡(jiǎn)便且靈敏度較高,與突光、電化學(xué)和膠體金等檢測(cè)平臺(tái)聯(lián)合應(yīng)用而備受關(guān)注(參考文獻(xiàn):1.Puchang Lie, Jie Liu, Zhiyuan Fang,, BoyingDun and Lingwen Zeng.flfewatbnai ensor for detection of nucleic acids with highsensitivity and selectivity.Chem.Commun.2012, 48, 236 - 2382.Qiuping Guo, XiaohaiYang, Kemin Wang*, Weihong Tan, Wei Li, Hongxing Tangand Huimin L1.Sensitivefluorescence detection of nucleic acids based on isothermal circular strand—displacementpolymerization reaction.Nucleic Acids Research.2009，37 (3): 2-6)。然而熒光基團(tuán)容易淬滅，不易保存，而膠體金試紙條檢測(cè)只能通過(guò)肉眼進(jìn)行定性檢測(cè)，或者通過(guò)試紙條掃描儀進(jìn)行半定量檢測(cè)，這些方法很難進(jìn)行高通量檢測(cè)。本發(fā)明的目的在于根據(jù)現(xiàn)有的核酸檢測(cè)技術(shù)中存在的不足，提供一種可以快速高通量檢測(cè)核酸的方法。。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種基于雙酶擴(kuò)增的核酸檢測(cè)方法，該方法能簡(jiǎn)便、高通量地定量檢測(cè)核酸。本發(fā)明所述的一種基于雙酶擴(kuò)增的核酸檢測(cè)方法，包括如下步驟:A)在微孔板上包被3% Y-球蛋白溶液50 μ L，4°C過(guò)夜；再用250 μ L、0.0lM的PBS洗漆3次。B)加入5nm金納米顆粒溶液50 μ L，其中氯金酸濃度為0.01%，4°C反應(yīng)12小時(shí)；再用250 μ L、0.0lM的PBS洗滌3次；C)加入0.5 μ M的發(fā)夾結(jié)構(gòu)核酸探針50 μ L，4°C過(guò)夜；用250 μ L、0.0lM的PBS洗滌3次；加入250 μ L、50mM的巰基乙醇4°C封閉12小時(shí)，250 μ L、0.0lM的PBS洗滌3次；D)加入第一次信號(hào)擴(kuò)增體系緩沖液，37°C反應(yīng)30分鐘，進(jìn)行第一次信號(hào)擴(kuò)增；所述的第一次信號(hào)擴(kuò)增體系緩沖液包含:50yL、50mM Tris-HCL, pH8.0 ;50nM短引物，該短引物與所述探針的3’端互補(bǔ)；3單位聚合酶；50 μ MdNTPs ；6%DMS0 ；0.1%BSA ；5mM MgCl2 ；以及不同濃度的檢測(cè)目標(biāo)序列核酸；反應(yīng)后用250 μ L、0.0lM的PBS洗滌3次；E)加入50 μ L、I μ g/mL的親和素標(biāo)記的辣根過(guò)氧化物酶，20_25°C反應(yīng)5分鐘，進(jìn)行第二次信號(hào)擴(kuò)增；反應(yīng)后用250 μ L、0.0lM的PBS洗滌3次；F)加入50 μ L(TMB)-H2O2溶液20_25°C反應(yīng)5分鐘；酶標(biāo)儀450nm波長(zhǎng)檢測(cè)。根據(jù)本發(fā)明所述的雙酶擴(kuò)增的核酸檢測(cè)方法的進(jìn)一步特征，所述步驟B中，所包被的金納米顆粒為直徑5nm。根據(jù)本發(fā)明所述的雙酶擴(kuò)增的核酸檢測(cè)方法的進(jìn)一步特征，所述步驟C中，所述探針結(jié)構(gòu)為Sy-SH-TCTTGGACAC-檢測(cè)目標(biāo)序列的互補(bǔ)序列-GTGTCCAAGA-生物素_3’，所述探針全長(zhǎng)40個(gè)堿 基，兩端的各10個(gè)堿基組成互補(bǔ)的莖狀結(jié)構(gòu)，中間的互補(bǔ)序列是根據(jù)檢測(cè)目標(biāo)序列而設(shè)計(jì)的20個(gè)堿基。根據(jù)本發(fā)明所述的雙酶擴(kuò)增的核酸檢測(cè)方法的進(jìn)一步特征，所述步驟D中，短引物的序列為TCTTGGAC，與所述探針“ 5 ’ -SH-TCTTGGACAC-檢測(cè)目標(biāo)序列的互補(bǔ)序列-GTGTCCAAGA-生物素-3’ ”的發(fā)夾結(jié)構(gòu)的3’端互補(bǔ)。本發(fā)明所述的基于雙酶擴(kuò)增的核酸檢測(cè)方法的檢測(cè)原理是:該核酸檢測(cè)方法反應(yīng)系統(tǒng)中包含了 DNA發(fā)夾結(jié)構(gòu)的核酸探針，一段短引物，DNA聚合酶和過(guò)氧化合酶。微孔板上先包被3% Y -球蛋白，然后再包被直徑5nm左右的金顆粒。最后加入0.5 μ M的發(fā)夾結(jié)構(gòu)核酸探針(5’端巰基和3’生物素修飾)與微孔板上金顆粒偶聯(lián)。加入目標(biāo)核酸后，該核酸與包被的發(fā)夾結(jié)構(gòu)核酸的環(huán)部分互補(bǔ)，從而打開(kāi)發(fā)夾結(jié)構(gòu)，在引物和聚合酶作用下，把目標(biāo)核酸置換下來(lái)再打開(kāi)其它發(fā)夾結(jié)構(gòu)核酸探針，這樣形成一個(gè)擴(kuò)增的循環(huán)。最終生成大量雙鏈的核酸產(chǎn)物(第一次信號(hào)擴(kuò)增)，該產(chǎn)物帶有生物素標(biāo)記標(biāo)簽?zāi)芘c親和素標(biāo)記的辣根過(guò)氧化物酶反應(yīng)，最后催化TMB顯色(第二次信號(hào)擴(kuò)增)，最后通過(guò)酶標(biāo)儀定量檢測(cè)。本發(fā)明進(jìn)一步提供了一種基于雙酶擴(kuò)增的核酸檢測(cè)方法的試劑盒。本發(fā)明所述的基于雙酶擴(kuò)增的核酸檢測(cè)方法的試劑盒包括以下成分:3% Y-球蛋白溶液；金納米顆粒溶液，其中氯金酸濃度為0.01%;發(fā)夾結(jié)構(gòu)核酸探針；短引物，該短引物與所述探針的 3’端互補(bǔ)；50mM Tris-HCL,pH8.0 ;聚合酶；dNTPs ；6%DMS0 ；0.1%BSA ;18(:12溶液；親和素標(biāo)記的辣根過(guò)氧化物酶JMB-H2O2，作為辣根過(guò)氧化物酶的底物反應(yīng)液；陽(yáng)性對(duì)照核酸；0.0lM PSB，作為洗滌液以及陰性對(duì)照；以及2mol/L H2SO4，作為反應(yīng)終止液。根據(jù)本發(fā)明所述的試劑盒的進(jìn)一步特征，所述的金納米顆粒為直徑5nm。根據(jù)本發(fā)明所述的試劑盒的進(jìn)一步特征，所述探針的結(jié)構(gòu)為5’ -SH-TCTTGGACAC-檢測(cè)目標(biāo)序列的互補(bǔ)序列-GTGTCCAAGA-生物素-3’，即所述探針全長(zhǎng)40個(gè)堿基，兩端的各10個(gè)堿基組成互補(bǔ)的莖狀結(jié)構(gòu)，中間的互補(bǔ)序列是根據(jù)檢測(cè)目標(biāo)序列而設(shè)計(jì)的20個(gè)堿基。根據(jù)本發(fā)明所述的試劑盒的進(jìn)一步特征，所述的短引物的序列為TCTTGGAC，與所述探針的發(fā)夾結(jié)構(gòu)的3’端互補(bǔ)。本發(fā)明所述的基于雙酶擴(kuò)增的核酸檢測(cè)方法以及試劑盒具有以下優(yōu)點(diǎn):(I)本核酸檢測(cè)方法以及試劑盒操作簡(jiǎn)便，樣本檢測(cè)時(shí)間不超過(guò)一小時(shí)，且反應(yīng)溫度只需要常溫即20-25°C以及37°C。(2)本核酸檢測(cè)方法以及試劑盒可靈敏快速地采集實(shí)驗(yàn)結(jié)果數(shù)據(jù)，結(jié)合酶標(biāo)儀可在極短時(shí)間檢測(cè)數(shù)以千萬(wàn)的樣品，實(shí)現(xiàn)高通量檢測(cè)。
( 3 )本核酸檢測(cè)方法以及試劑盒可實(shí)現(xiàn)定量檢測(cè)。目前實(shí)驗(yàn)室內(nèi)，膠體金試紙條檢測(cè)只能通過(guò)肉眼進(jìn)行定性檢測(cè)，或者通過(guò)試紙條掃描儀進(jìn)行半定量檢測(cè)。而本發(fā)明所述的基于雙酶擴(kuò)增的核酸檢測(cè)方法可實(shí)現(xiàn)定量檢測(cè)。(4)本核酸檢測(cè)方法以及試劑盒的特異性好，不易受其它核酸影響，能區(qū)分一個(gè)堿
基突變。(5)本核酸檢測(cè)方法以及試劑盒的檢測(cè)靈敏度高，檢測(cè)限達(dá)8aM，在0.1fM-1OnM間線性良好，具有微量、快速、靈敏和準(zhǔn)確等特點(diǎn)。


圖1是本發(fā)明所述的基于雙酶擴(kuò)增的核酸檢測(cè)方法的原理圖。圖2是不同濃度的目標(biāo)DNA檢測(cè)的波長(zhǎng)從350nM到550nM的吸收光譜圖，反映本發(fā)明所述的基于雙酶擴(kuò)增的核酸檢測(cè)方法的靈敏度，其中，a-h的目標(biāo)DNA濃度分別為:0，O OlfM, 0.1fM, IOfM, IpM, IOOpM, IOnM 和 I μ M。圖3是采用本發(fā)明所述的基于雙酶擴(kuò)增的核酸檢測(cè)方法同時(shí)檢測(cè)不同濃度目標(biāo)DNA的校正曲線，反映本發(fā)明所述的基于雙酶擴(kuò)增的核酸檢測(cè)方法的檢測(cè)線性范圍。圖4顯示本發(fā)明所述的基于雙酶擴(kuò)增的核酸檢測(cè)方法的特異性，圖中，PM:完全配對(duì)的目標(biāo)DNA ；T1:含 有一個(gè)非配對(duì)的突變型核酸；T2:含有兩個(gè)非配對(duì)的突變型核酸；Τ3:含有三個(gè)非配對(duì)的突變型核酸；NC:陰性對(duì)照。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1:本發(fā)明所述的基于雙酶擴(kuò)增的核酸檢測(cè)方法的靈敏度實(shí)驗(yàn)材料:微孔板(購(gòu)自康寧公司、規(guī)格:96孔微孔板)、Y -球蛋白(購(gòu)自西格瑪奧德里奇公司、超純水溶解配制)、金納米顆粒(氯金酸購(gòu)自西格瑪奧德里奇公司、檸檬酸三納還原法制備成氯金酸終濃度為0.01%的金納米顆粒)、核酸探針(由大連寶生物公司合成)、擴(kuò)增體系(DNA聚合酶、dNTPs均購(gòu)自大連寶生物公司)、檢測(cè)目標(biāo)序列核酸(大連寶生物公司合成)以下舉例說(shuō)明本發(fā)明所述的基于雙酶擴(kuò)增的核酸檢測(cè)方法，步驟如下:I)微孔板包被3%Y-球蛋白溶液50yL，4°C過(guò)夜。250yL的0.01M PBS洗滌3次。2)加入直徑5nm的金納米顆粒，4°C反應(yīng)12小時(shí)。250yL的0.0lM PBS洗滌3次。3 )加入 0.5 μ M 的發(fā)夾結(jié)構(gòu)核酸探針(5 ’ -SH-TCTTGGACACGCCTCCAAGTGAACCTCCCCGTGTCCAAGA-牛物素-3’ )50 u L, 4°Ci寸密。250μΙ^9(λ01Μ PBS 洗滌 3 次。加入 250 μ L 的50mM的巰基乙醇4°C封閉12小時(shí)，250 μ L的0.0lM PBS洗滌3次。注:本實(shí)施例中“GCCTCCAAGTGAACCTCCCC”這20個(gè)中間的堿基序列是是根據(jù)目標(biāo)核酸序列“GGGGAGGTTCACTTGGAGGC”來(lái)設(shè)計(jì)的。4)加入目標(biāo)序列核酸(GGGGAGGTTCACTTGGAGGC)。37 °C 反應(yīng) 30 分鐘，250 μ L(0.01M)PBS洗滌3次(見(jiàn)圖1步驟I)。目標(biāo)核酸與微孔板包被并固定的發(fā)夾結(jié)構(gòu)核酸探針的環(huán)狀部分完全配對(duì)并使發(fā)夾結(jié)構(gòu)核酸打開(kāi)，形成中間部分互補(bǔ)的雙鏈DNA，加入擴(kuò)增體系緩沖液包含 50μ L、50mM Tris-HCL (pH8.0)、50nM 短引物(TCTTGGAC)、3 單位聚合酶，50 μ MdNTPs, 6%DMS0, 0.1%BSA, 5mM MgCl2后。引物與已經(jīng)打開(kāi)的發(fā)夾核酸形成的部分互補(bǔ)的雙鏈核酸的3'端結(jié)合(見(jiàn)圖1步驟2)。在DNA聚合酶和dNTPs作用下，已結(jié)合引物的部分互補(bǔ)的雙鏈核酸在引物的3'端開(kāi)始合成DNA，從而形成完全互補(bǔ)的雙鏈DNA產(chǎn)物，并把已經(jīng)結(jié)合的目標(biāo)核酸置換下來(lái)(見(jiàn)圖1步驟3)。置換下來(lái)的目標(biāo)核酸可以從新開(kāi)始上述的循環(huán)，從而達(dá)到信號(hào)放大的目的(見(jiàn)圖1步驟4)。最后產(chǎn)生大量的3'端生物素修飾的雙鏈產(chǎn)物(見(jiàn)圖1步驟5)。5)加入50 μ L、1 μ g/mL的親和素標(biāo)記的辣根過(guò)氧化物酶溶液20-25°C反應(yīng)5分鐘。250 μ L (0.01Μ) PBS洗滌3次。加入50 μ L (TMB)-H2O2溶液反應(yīng)5分鐘。酶標(biāo)儀450nm檢測(cè)(見(jiàn)圖1步驟6)。圖2顯示本發(fā)明所述的基于雙酶擴(kuò)增的核酸檢測(cè)方法的靈敏度，不同濃度的目標(biāo)DNA檢測(cè)的從波長(zhǎng)350nM到550nM的吸收光譜，a-h的目標(biāo)DNA濃度分別為:0，0.0lfM, 0.1fM, IOfM, IpM, IOOpM, IOnM andI μ Μ。從圖2可看出，通過(guò)線性范圍公式:y=0.02653+0.12647x,以最低檢測(cè)限的0D450為陰性對(duì)照，把陰性對(duì)照0D450吸光度值的3倍作為J值，代入上述公式可以算出最低檢測(cè)限。最低可檢測(cè)限為8aM。注:3倍陰性對(duì)照0D450吸光度值視作為檢測(cè)陽(yáng)性圖3是采用本發(fā)明所述的基于雙酶擴(kuò)增的核酸檢測(cè)方法同時(shí)檢測(cè)不同濃度目標(biāo)DNA的校正曲線，其中上部分曲線部分為通過(guò)把核酸濃度的作X軸，吸光度0D450為y軸，通過(guò)B-Spline擬合的曲線，下部分為通過(guò)把濃度的對(duì)數(shù)作X軸，吸光度0D450為y軸作的線性圖，先從上部分的擬合曲線圖看出不同濃度的線性然后選擇這幾個(gè)濃度再作線性圖。如圖3所示，共檢測(cè)了七個(gè)梯度O, 0.0lfM, 0.1fM, IOfM, IpM, IOOpM, IOnM and I μ M的目標(biāo)核酸的最高吸光度0D450，在檢測(cè)的七個(gè)濃度中，低濃度的線性關(guān)系良好，因相關(guān)系數(shù)大于0.99，表明本發(fā)明所述的基于雙酶擴(kuò)增的核酸檢測(cè)方法在0.1fM-1OnM范圍內(nèi)的線性良好。
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實(shí)施例2:本發(fā)明所述的基于雙酶擴(kuò)增的核酸檢測(cè)方法的特異性實(shí)驗(yàn)為考察基于雙酶擴(kuò)增的核酸檢測(cè)方法用于實(shí)驗(yàn)樣本檢測(cè)的特異性，按如下步驟進(jìn)行了選擇性實(shí)驗(yàn)。在其它反應(yīng)條件不變的情況下，分別加入以下目標(biāo)核酸:(I)與莖環(huán)結(jié)構(gòu)中莖狀部分完全配對(duì)的目標(biāo)核酸PM:SEQ ID N0.1:GGGGAGGTTCACTTGGAGGC ；(2 )目標(biāo)核酸PM的一個(gè)堿基突變的序列:SEQ ID N0.2:GGGGAGGTTTACTTGGAGGC ；(3)目標(biāo)核酸PM的兩個(gè)堿基突變的序列:SEQ ID N0.3:GGGAAGGTGCACTTGGAGGC ；(3 )目標(biāo)核酸PM的三個(gè)堿基突變的序列:SEQ ID N0.4:GGGAAGGTGCACTAGGAGGC 如圖4所示，通過(guò)把做特異性檢測(cè)I μ M的核酸作X軸，吸光度0D450為y軸，其中一個(gè)錯(cuò)配的核酸的吸光度0D450僅為完全配對(duì)(即目標(biāo)核酸)的30%，這樣暗示本發(fā)明所述的基于雙酶擴(kuò)增的核酸檢測(cè)方法可以區(qū)分最低僅一個(gè)錯(cuò)配的突變型核酸，證實(shí)該方法對(duì)核酸檢測(cè)有良好的特異性。本發(fā)明的檢測(cè)方法能夠很好地區(qū)分完全配對(duì)的目標(biāo)核酸與一個(gè)錯(cuò)配的突變型核酸。實(shí)施例3:本發(fā)明所述的基于雙酶擴(kuò)增的核酸檢測(cè)盒的制備配制以下成分:3% Y -球蛋白溶液；金納米顆粒溶液，其中氯金酸濃度為0.0I % ;發(fā)夾結(jié)構(gòu)核酸探針；短引物，該短引物與所述探針的3，端互補(bǔ)；50mM Tris-HCL, ρΗ8.0 ;聚合酶；dNTPs ；6%DMS0 ；0.1%BSA ；MgCl2溶液；親和素標(biāo)記的辣根過(guò)氧化物酶JMB-H2O2，作為辣根過(guò)氧化物酶的底物反應(yīng)液；陽(yáng)性對(duì)照核酸；0.01MPSB，作為洗滌液以及陰性對(duì)照；以及2mol/L H2SO4,作為反應(yīng)終止液。根據(jù)上述實(shí)施例1和2的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，可以將序列為“GGGGAGGTTCACTTGGAGGC”的核酸作為陽(yáng)性對(duì)照核酸。本領(lǐng)域技術(shù)人員也可根據(jù)本發(fā)明的技術(shù)原理選擇其他序列的核酸作為陽(yáng)性對(duì)照核酸。然后，將配制的成分分裝，組成本發(fā)明所述的基于雙酶擴(kuò)增的核酸檢測(cè)方法的試劑盒。優(yōu)選地，在本發(fā)明所述的試劑盒中，所述的金納米顆粒為直徑5nm。優(yōu)選地，在本發(fā)明所述的試劑盒中，所述探針的結(jié)構(gòu)為5’ -SH-TCTTGGACAC-檢測(cè)目標(biāo)序列的互補(bǔ)序列-GTGTCCAAGA-生物素-3’，即所述探針全長(zhǎng)40個(gè)堿基，兩端的各10個(gè)堿基組成互補(bǔ)的莖狀結(jié)構(gòu)，中間的互補(bǔ)序列是根據(jù)檢測(cè)目標(biāo)序列而設(shè)計(jì)的20個(gè)堿基。

優(yōu)選地，在本發(fā)明所述的試劑盒中，所述的短引物的序列為TCTTGGAC，與“5’ -SH-TCTTGGACAC-檢測(cè)目標(biāo)序列的互補(bǔ)序列-GTGTCCAAGA-生物素-3’ ”探針的發(fā)夾結(jié)構(gòu)的3’端互補(bǔ)。
權(quán)利要求
1.一種基于雙酶擴(kuò)增的核酸檢測(cè)方法，其特征在于，包括如下步驟 A)在微孔板上包被3%Y -球蛋白溶液50 μ L，4°C過(guò)夜；再用250 μ L、0. OlM的PBS洗滌3次。
B)加入5nm金納米顆粒溶液50μ L，其中氯金酸濃度為O. 01%，4°C反應(yīng)12小時(shí)；再用250 μ L、0. OlM 的 PBS 洗滌 3 次； C)加入O.5 μ M的發(fā)夾結(jié)構(gòu)核酸探針50 μ L，4°C過(guò)夜；用250 μ L、0. OlM的PBS洗滌3次；加入250 μ L、50mM的巰基乙醇4°C封閉12小時(shí)，250 μ L、0. OlM的PBS洗滌3次； D)加入第一次信號(hào)擴(kuò)增體系緩沖液，37°C反應(yīng)30分鐘，進(jìn)行第一次信號(hào)擴(kuò)增；所述的第一次信號(hào)擴(kuò)增體系緩沖液包含50yL、50mM Tris-HCL, pH8. O ;50nM短引物，該短引物與所述探針的3，端互補(bǔ)；3單位聚合酶；50 μ M dNTPs ；6%DMSO ；0. 1%BSA ；5mM MgCl2 ；以及不同濃度的檢測(cè)目標(biāo)序列核酸；反應(yīng)后用250 μ L、0. OlM的PBS洗滌3次； E)加入50μ L、I μ g/mL的親和素標(biāo)記的辣根過(guò)氧化物酶，20_25°C反應(yīng)5分鐘，進(jìn)行第二次信號(hào)擴(kuò)增；反應(yīng)后用250 μ L、0. OlM的PBS洗滌3次； F)加入50μ L(TMB)-H2O2溶液20_25°C反應(yīng)5分鐘；酶標(biāo)儀450nm波長(zhǎng)檢測(cè)。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的雙酶擴(kuò)增的核酸檢測(cè)方法，其特征在于所述步驟B中，所包被的金納米顆粒為直徑5nm。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的雙酶擴(kuò)增的核酸檢測(cè)方法，其特征在于所述步驟C中，所述探針結(jié)構(gòu)為Sy-SH-TCTTGGACAC-檢測(cè)目標(biāo)序列的互補(bǔ)序列-GTGTCCAAGA-生物素-3’，即所述探針全長(zhǎng)40個(gè)堿基，兩端的各10個(gè)堿基組成互補(bǔ)的莖狀結(jié)構(gòu)，中間的互補(bǔ)序列是根據(jù)檢測(cè)目標(biāo)序列而設(shè)計(jì)的20個(gè)堿基。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的雙酶擴(kuò)增的核酸檢測(cè)方法，其特征在于所述步驟D中，短引物的序列為TCTTGGAC，與所述探針的發(fā)夾結(jié)構(gòu)的3’端互補(bǔ)。
5.根據(jù)權(quán)利要求I所述的基于雙酶擴(kuò)增的核酸檢測(cè)方法的試劑盒，其特征在于，包括以下成分 3% Y-球蛋白溶液； 金納米顆粒溶液，其中氯金酸濃度為O. 01% ； 發(fā)夾結(jié)構(gòu)核酸探針； 短引物，該短引物與所述探針的3’端互補(bǔ)；50mM Tris-HCL, pH8. O ； 聚合酶； dNTPs ；6%DMS0 ；O.1%BSA ； MgCl2溶液； 親和素標(biāo)記的辣根過(guò)氧化物酶； TMB-H2O2,作為辣根過(guò)氧化物酶的底物反應(yīng)液； 陽(yáng)性對(duì)照核酸； O.OlM PBS，作為洗滌液以及陰性對(duì)照； 以及2mol/L H2SO4，作為反應(yīng)終止液。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的試劑盒，其特征在于所述的金納米顆粒為直徑5nm。
7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的試劑盒，其特征在于所述探針的結(jié)構(gòu)為5’ -SH-TCTTGGACAC-檢測(cè)目標(biāo)序列的互補(bǔ)序列-GTGTCCAAGA-生物素-3’，即所述探針全長(zhǎng)40個(gè)堿基，兩端的各10個(gè)堿基組成互補(bǔ)的莖狀結(jié)構(gòu)，中間的互補(bǔ)序列是根據(jù)檢測(cè)目標(biāo)序列而設(shè)計(jì)的20個(gè)堿基。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的試劑盒，其特征在于所述的短引物的序列為TCTTGGAC，與所述探針的發(fā)夾結(jié)構(gòu)的3’端互補(bǔ)。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種基于雙酶擴(kuò)增系統(tǒng)的核酸檢測(cè)方法。該核酸檢測(cè)方法反應(yīng)系統(tǒng)中包含了DNA發(fā)夾結(jié)構(gòu)的核酸探針，一段短引物，DNA聚合酶和過(guò)氧化合酶。發(fā)夾結(jié)構(gòu)的核酸探針首先固定在96孔板。加入目標(biāo)核酸后，該核酸與包被的發(fā)夾結(jié)構(gòu)核酸的環(huán)部分完全互補(bǔ)配對(duì)，從而打開(kāi)發(fā)夾結(jié)構(gòu)，在引物和聚合酶作用下，通過(guò)引物合成新鏈能把目標(biāo)核酸置換下來(lái)，最終生成大量帶有生物素標(biāo)記雙鏈核酸產(chǎn)物，與親和素標(biāo)記的辣根過(guò)氧化物酶結(jié)合。最后催化底物四甲基聯(lián)苯氨顯色，通過(guò)酶標(biāo)儀定量檢測(cè)，該方法最低能檢測(cè)到8aM的核酸。本發(fā)明所述的基于雙酶擴(kuò)增的核酸檢測(cè)方法通過(guò)兩次信號(hào)擴(kuò)增，從而達(dá)到高靈敏度檢測(cè)的目的。本發(fā)明為核酸檢測(cè)提供高通量和高靈敏度的檢測(cè)手段。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK103255215SQ201310136528
公開(kāi)日2013年8月21日 申請(qǐng)日期2013年4月18日 優(yōu)先權(quán)日2013年4月18日
發(fā)明者曾令文, 余路新, 陳凌波 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院廣州生物醫(yī)藥與健康研究院