CRISPR-Cas9特異性敲除人CTLA4基因的方法以及用于特異性靶向CTLA4基因的sgRNA的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明屬于基因工程領(lǐng)域，更具體地說，涉及CRISPR-Cas9特異性敲除人CTLA4基因的方法以及用于特異性靶向CTLA4基因的sgRNA。本發(fā)明提供了CRISPR-Cas9特異性敲除人CTLA4基因的方法以及用于特異性靶向CTLA4基因的sgRNA。利用本發(fā)明制備的特異性靶向人CTLA4基因的sgRNA能夠精確靶向人CTLA4基因并且實現(xiàn)基因敲除。該制備方法步驟簡單、sgRNA靶向性好，CRISPR-Cas9系統(tǒng)的敲除效率高。
【專利說明】CRISPR-Cas9特異性敲除人CTLA4基因的方法以及用于特異性靶向CTLA4基因的sgRNA
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于基因工程領(lǐng)域，更具體地說涉及CRISPR_Cas9特異性敲除人CTLA4基因的方法以及用于特異性靶向CTLA4基因的sgRNA。
【背景技術(shù)】
[0002]規(guī)律成族間隔短回文重復(fù)系統(tǒng)(clusteredregularly interspaced shortpalindromic repeat; CRISPR-associated, CRISPR_Cas9)是一種具有核酸內(nèi)切酶活性的復(fù)合體，識別特定的DNA序列，進(jìn)行特定位點切割造成雙鏈DNA斷裂(Double-strandbreaks, DSB),在沒有模板的條件下，發(fā)生非同源重組末端連接(Non_homologous endjoining, NHEJ),造成移碼突變(frameshift mutation),導(dǎo)致基因敲除(圖1)。
[0003]這一技術(shù)由于能快速、簡便、高效地靶向基因組任何基因，從而引起了廣泛的關(guān)注，在2012年開始像爆炸一般流行開來。由于其容易操作、可以同時靶向多個基因，可以高通量制備、造價低等優(yōu)勢，Cas9已經(jīng)成為一種發(fā)展最快的技術(shù)(Pennisi, 2013)。正是由于其優(yōu)越性，這一技術(shù)在Nature推薦的2013十大進(jìn)展中位列第一 (http://www.nature, com/news/365-days-nature-s-10-l.14367),在 Science 推薦的 2013 十大進(jìn)展中位列第二位(http://news.sciencemaR.0rR/breakthrouRh-of-the-year-2013)0
[0004]Cas9靶向切 割DNA是通過兩種小RNA-crRNA (CRISPR RNA)和
tracrRNA (trans-activating crRNA)和祀序列互補(bǔ)識別的原理實現(xiàn)的。現(xiàn)在已經(jīng)把兩種小RNA融合成一條RNA鏈,簡稱sgRNA (single guide RNA)。因此，sgRNA能否做到特異性、精確靶向目標(biāo)基因是CRISPR-Cas9能否特異性敲除目標(biāo)基因的先決條件，無論是脫靶還是錯誤靶向，都會影響CRISPR-Cas9對目標(biāo)基因的特異性敲除。因此，能夠設(shè)計、制備出精確性和特異性靶向目標(biāo)基因的sgRNA成為CRISPR-Cas9基因敲除的關(guān)鍵技術(shù)(圖1)。
[0005]腫瘤免疫治療，尤其是對免疫檢查點的阻斷，是當(dāng)前靶向基因治療最成功的領(lǐng)域。免疫檢查點是指維持免疫自我耐受，以及調(diào)節(jié)生理條件下的免疫反應(yīng)強(qiáng)度和持續(xù)時間的一系列免疫抑制性反應(yīng)。研究表明，腫瘤細(xì)胞和免疫檢查點途徑協(xié)同作用，產(chǎn)生了抑制腫瘤免疫的效果，特別是抑制腫瘤抗原特異的效應(yīng)T細(xì)胞的作用。對免疫檢查點的阻斷，是指利用T細(xì)胞免疫檢查抑制性受體的單克隆抗體，特異性阻斷抑制性受體與其配體的結(jié)合，從而阻斷免疫檢查機(jī)制抑制T細(xì)胞活化的作用，增強(qiáng)效應(yīng)T細(xì)胞的抗腫瘤效果。
[0006]已經(jīng)成功用于臨床的腫瘤免疫治療的免疫檢查靶點之一是免疫抑制性受體，CTLA4基因。CTLA4是首個臨床腫瘤免疫治療的靶基因，只表現(xiàn)在T細(xì)胞上，負(fù)責(zé)調(diào)節(jié)T細(xì)胞激活早期的反應(yīng)強(qiáng)度。CTLA4和共刺激受體，⑶28，共同受同一配體，⑶86。CTLA4主要通過和⑶28競爭配體影響⑶28共激活T細(xì)胞，從而實現(xiàn)其控制T細(xì)胞活性的作用。利用CTLA4 單克隆(lpilimumab、Tremelimumab)和 CTLA4 結(jié)合，促進(jìn) CD86 和 CD28 結(jié)合，顯著增強(qiáng)免疫反應(yīng)，從而達(dá)到減緩腫瘤生長，或清除腫瘤的作用，從而達(dá)到治療腫瘤的效果。
[0007]不過，利用CTLA4抗體的治療現(xiàn)在只在黑色素癌應(yīng)用，對其它腫瘤的療效還在測試中。因為利用抗體進(jìn)行靶基因的治療還受到一些因素的限制:(1)抗體的作用只是暫時阻斷的作用；(2)抑制性受體有多種，如何利用多種抗體同時阻斷多種抑制性受體還沒有對策；(3)不容易研發(fā)出有效的抗體；(4)只針對細(xì)胞外靶點；(5)抗體藥物昂貴，等。
[0008]CRISPR-Cas9快速、簡便、高效、特異性靶向敲除基因，通過靶向敲除CTLA4基因，為實現(xiàn)腫瘤免疫治療提供了一種可行的策略。但是，能否設(shè)計、制備出精確性和特異性靶向CTLA4基因的sgRNA以及通過分子生物學(xué)方法制備出靶向CTLA4基因的CRISPR_Cas9成為CRISPR-Cas9特異性敲除CTLA4基因的關(guān)鍵技術(shù)。本發(fā)明的目的就是要解決這些關(guān)鍵技術(shù)問題，提供相應(yīng)的技術(shù)方案，達(dá)到特異性敲除CTLA4基因的目的。
[0009]參考文獻(xiàn):
[0010]Mali P, Esvelt KM, Church GM.Cas9as a versatile tool for engineeringbiology.Nat.Methods.2013;10(10):957-963.[0011]Pennisi E.The CRISPR craze.Science,2013;341(6148):833-6.do1:10.1126/science.341.6148.833.[0012]Pardoll DM.The blockade of immune checkpoints in cancer immunotherapy.Nature Rev.Cancer, 2012;12:252-264.[0013]Mellman I, Coukos G, Dranoff G.Cancer immunotherapy comes of age.Nature, 2011;480:480-489.
【發(fā)明內(nèi)容】

[0014]針對現(xiàn)有利用CTLA4抗體進(jìn)行免疫檢測阻斷治療腫瘤存在的問題:(1)抗體的作用只是暫時阻斷的作用；(2)抑制性受體有多種，如何利用多種抗體阻斷多種抑制性受體還沒有對策；(3)不容易研發(fā)出有效的抗體；(4)只針對細(xì)胞外靶點；(5)開發(fā)抗體藥物費(fèi)時、費(fèi)力、費(fèi)錢，使得抗體藥物昂貴等。本發(fā)明設(shè)計、合成了一組在CRISPR-Cas9特異性敲除人CTLA4基因中特異 性靶向CTLA4基因的sgRNA，并分別將該sgRNA與線性的pGL3-U6-sgRNA質(zhì)粒連接成載體，將一對正向和方向sgRNA寡核苷酸載體與pST1374-NLS-flag-Cas9-ZF質(zhì)粒一起成功轉(zhuǎn)染細(xì)胞即可實現(xiàn)CTLA4基因的敲除。本申請?zhí)峁┝艘环N利用Cas9/sgRNA快速、簡便、高效、特異性敲除CTLA4的策略。有效地解決了利用抗體治療存在的問題:(I)直接敲除CTLA4基因，可以實現(xiàn)永久的效果；(2)既可以針對CTLA4的多個編碼序列進(jìn)行同時敲除，也可以針對多個靶基因進(jìn)行同時敲除；(3)提供了高效的sgRNA ;(4)既可以針對胞外，也能針對胞內(nèi)靶點；(5) sgRNA只需要小量合成多核苷酸片斷，就能大批量生產(chǎn)。
[0015]為了解決上述技術(shù)問題，本申請的技術(shù)方案如下:
[0016]—、sgRNA寡核苷酸的設(shè)計和選擇
[0017]因為沒有使用體外轉(zhuǎn)錄，只是構(gòu)建普通載體的方式制作。所以如無特殊說明，文中的sgRNA序列指的是sgRNA對應(yīng)DNA序列。
[0018]1.靶向CTLA4基因的sgRNA的設(shè)計:
[0019](I)在CTLA4基因上選擇5’_GGN(19)GG的序列，如果沒有5’_GGN(19)GG的序列，5’ -GN(20)GG 或者 5’ -N(21)GG 也可以。
[0020](2) sgRNA在CTLA4基因上的靶向位點位于基因的外顯子。[0021](3)sgRNA在CTLA4基因上的靶向位點位于不同的各種剪切形式的共有外顯子上。
[0022](4)在UCSC數(shù)據(jù)庫中用BLAT或NCBI數(shù)據(jù)庫中用BLAST，確定sgRNA的靶序列是
否唯一。
[0023]2.靶向CTLA4基因的sgRNA的選擇:
[0024](I)不能離ATG起始子太近，防止轉(zhuǎn)錄會后下游另一個ATG開始而出現(xiàn)一個被截短的基因形式，不能保證基因完全失活；
[0025](2)sgRNA在CTLA4基因上的靶向位點位于整個基因的前半段，尤其宜在基因的功能結(jié)構(gòu)域中；
[0026](3)選擇相隔一定距離(10~30bp)成對的位點。這樣有利于形成特異性的片段缺失，也有利于降低脫靶效應(yīng)。
[0027]二、構(gòu)建sgRNA的寡聚核苷酸
[0028]根據(jù)選擇的sgRNA,在其5’加上CCGG得到正向寡核苷酸(Forward oligo)(如果序列本身在5’端已經(jīng)有I或者2個G，那么就對應(yīng)的省略I或者2個G);根據(jù)選擇的sgRNA，獲得其對應(yīng)DNA的互補(bǔ)鏈，并且在其5’加上AAAC得到反向寡核苷酸(Reverse oligo)。分別合成上述正向寡核苷酸和反向寡核苷酸，將合成的sgRNA寡聚核苷酸的forward oligo和reverse oligo成對變性、退火,退火之后形成可以連入U6真核表達(dá)載體的雙鏈,如下:
【權(quán)利要求】
1.在CRISPR-Cas9特異性敲除人CTLA4基因中用于特異性靶向CTLA4基因的sgRNA，其特征為: (1)所述sgRNA在CTLA4基因上的靶序列符合5’_GGN(19)GG、5，_GN(20)GG或者5’ _N(21)GG的序列排列規(guī)則； (2)所述sgRNA在CTLA4基因上的靶序列位于基因的外顯子； (3)所述sgRNA在CTLA4基因上的靶序列位于不同的各種剪切形式的共有外顯子上； (4)所述sgRNA在CTLA4基因上的靶序列是唯一的。
2.如權(quán)利要求1所述的在CRISPR-Cas9特異性敲除人CTLA4基因中用于特異性靶向CTLA4基因的sgRNA，其特征為:其對應(yīng)的DNA序列如序列表SEQ ID N0.24-90任意一條序列所示。
3.如權(quán)利要求1所述的在CRISPR-Cas9特異性敲除人CTLA4基因中用于特異性靶向CTLA4基因的sgRNA，其特征為:其對應(yīng)的DNA序列如序列表SEQ ID N0.36、42、55、56、57、58、67、69、84或者85任意一條序列所示。
4.如權(quán)利要求1所述的在CRISPR-Cas9特異性敲除人CTLA4基因中用于特異性靶向CTLA4基因的sgRNA，其特征為:其對應(yīng)的DNA序列如序列表SEQ ID N0.36、84、56或者69任意一條序列所示。
5.CRISPR-Cas9特異性敲除人CTLA4基因的方法，其特征為包括如下步驟: Cl)權(quán)利要求1-4任意一項所述的sgRNA，在其對應(yīng)的DNA序列5’加上CCGG，如果序列本身在5’端已經(jīng)有I或者2個G，那么就對應(yīng)的省略I或者2個G，合成得到正向寡核苷酸即Forward oligo ;權(quán)利要求1_4任意一項所述的sgRNA,獲得其對應(yīng)DNA的互補(bǔ)鏈,并且在互補(bǔ)鏈的5’加上AAAC合成得到反向寡核苷酸即Reverse oligo ;將合成的I對互補(bǔ)的sgRNA寡聚核苷酸的forward oligo和reverse oligo成對變性、退火,退火之后形成可以連入U6真核表達(dá)載體的雙鏈sgRNA寡聚核苷酸； (2)線性化序列如序列表SEQID N0.10所示的pGL3_U6_sgRNA質(zhì)粒；將退火的雙鏈sgRNA寡聚核苷酸與線性化pGL3-U6-sgRNA質(zhì)粒連接獲得pGL3-U6-hCTLA4sg質(zhì)粒；pGL3-U6-hCTLA4sg質(zhì)粒轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)菌并涂Amp+平板，挑選陽性克隆并用序列如序列表SEQ ID N0.9所示的通用引物U6測序的方法鑒定出陽性克??；37° C搖床搖陽性克隆菌過夜并用 AxyPrep Plasmid Miniprep Kit (AP-MN-P-250)抽提 pGL3_U6_hCTLA4sg 質(zhì)粒； (3)用脂質(zhì)體裝載pGL3-U6-hCTLA4sg質(zhì)粒和序列為SEQID N0.11的pST1374-NLS-flag-Cas9-ZF 質(zhì)粒，共轉(zhuǎn)染細(xì)胞； (4)用T7EN1酶切檢測和TA克隆測序確認(rèn)CTLA4基因已經(jīng)被敲除并獲得基因敲除的細(xì)胞。
6.如權(quán)利要求5所述的CRISPR-Cas9特異性敲除人CTLA4基因的方法，其特征為:步驟(3)所述的脂質(zhì)體為 Lipofectamine ? 2000 Transfection Reagent。
7.如權(quán)利要求6所述的CRISPR-Cas9特異性敲除人CTLA4基因的方法，其特征為:步驟(1)所述的sgRNA其對應(yīng)的DNA序列為序列表SEQ ID N0.36、84、56或者69任意一條序列所示，分別對應(yīng)的步驟(2 )和(3 )所述的pGL3-U6-hCTLA4sg質(zhì)粒的序列為序列表SEQ ID N0.14、15、16或者17任意一條序列所示，即sgRNA序列為SEQ ID N0.36 對應(yīng)的 pGL3-U6-hCTLA4sg 質(zhì)粒為 SEQ ID N0.14，sgRNA 序列為 SEQ ID N0.84 對應(yīng)的 pGL3-U6-hCTLA4sg 質(zhì)粒為 SEQ ID N0.15，sgRNA 序列為 SEQ ID N0.56 對應(yīng)的 pGL3-U6-hCTLA4sg 質(zhì)粒為 SEQ ID N0.16，sgRNA 序列為 SEQ ID N0.69 對應(yīng)的pGL3-U6-hCTLA4sg 質(zhì)粒為 SEQ ID N0.17。
8.在如權(quán)利要求7所述的CRISPR-Cas9特異性敲除人CTLA4基因的方法中用到的pGL3-U6-hCTLA4sg質(zhì)粒，其特征為序列如序列表SEQ ID N0.14、15、16或者17任意一條所述。
9.CRISPR-Cas9特異性敲除人CTLA4基因的方法，其特征為包括如下步驟: Cl)權(quán)利要求1-4任意一項所述的sgRNA，在其對應(yīng)的DNA序列5’加上CCGG，如果序列本身在5’端已經(jīng)有I或者2個G，那么就對應(yīng)的省略I或者2個G，合成得到正向寡核苷酸即Forward oligo ;權(quán)利要求1_4任意一項所述的sgRNA,獲得其對應(yīng)DNA的互補(bǔ)鏈,并且在互補(bǔ)鏈的5’加上AAAC合成得到反向寡核苷酸即Reverse oligo ;將合成的I對互補(bǔ)的sgRNA寡聚核苷酸的forward oligo和reverse oligo成對變性、退火,退火之后形成可以連入U6真核表達(dá)載體的雙鏈sgRNA寡聚核苷酸； (2)線性化序列如序列表SEQID N0.10所示的pGL3_U6_sgRNA質(zhì)粒；將退火的雙鏈sgRNA寡聚核苷酸與線性化pGL3-U6-sgRNA質(zhì)粒連接獲得pGL3-U6-hCTLA4sg質(zhì)粒；pGL3-U6-hCTLA4sg質(zhì)粒轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)菌并涂Amp+平板，挑選陽性克隆并用序列如序列表SEQ ID N0.9所示的通用引物U6測序的方法鑒定出陽性克??；37° C搖床搖陽性克隆菌過夜并用 AxyPrep Plasmid Miniprep Kit (AP-MN-P-250)抽提 pGL3_U6_hCTLA4sg 質(zhì)粒； (3)用Lipofectamine? 2000 Transfection Reagent裝載兩種或者兩種以上不同的pGL3-U6-hCTLA4sg質(zhì)粒和序列為 SEQ ID N0.11 的 pST1374-NLS-flag-Cas9_ZF質(zhì)粒，共轉(zhuǎn)染細(xì)胞； (4)用T7EN1酶切檢測和TA克隆測序確認(rèn)CTLA4基因已經(jīng)被敲除并獲得基因敲除的細(xì)胞。
10.如權(quán)利要求9所述的CRISPR-Cas9特異性敲除人CTLA4基因的方法，其特征為:步驟(3 )所述的不同的pGL3-U6-hCTLA4sg質(zhì)粒為兩種，且這兩種不同的pGL3-U6_hCTLA4sg質(zhì)粒對應(yīng)所含的兩個sgRNA片段在CTLA4基因上的靶向起始位點相距8_24 bp。
11.如權(quán)利要求9所述的CRISPR-Cas9特異性敲除人CTLA4基因的方法，其特征為:步驟(3)所述的兩種不同的pGL3-U6-hCTLA4sg質(zhì)粒的序列為SEQ ID N0.14和15，這兩個pGL3-U6-hCTLA4sg質(zhì)粒對應(yīng)所含的兩個sgRNA片段在CTLA4基因上的靶向起始位點相距.24 bp ;或者步驟(3)所述的兩種不同的pGL3-U6-hCTLA4sg質(zhì)粒的序列為SEQ ID N0.16和17，這兩個pGL3-U6-hCTLA4sg質(zhì)粒對應(yīng)所含的兩個sgRNA片段在CTLA4基因上的靶向起始位點相距8 bp ο
【文檔編號】C12N15/11GK103820441SQ201410077815
【公開日】2014年5月28日 申請日期:2014年3月4日 優(yōu)先權(quán)日:2014年3月4日
【發(fā)明者】胡邊, 黃行許 申請人:黃行許