專利名稱：：杏香兔耳風(fēng)提取物及其活性成分以及它們的質(zhì)量控制方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明屬中藥領(lǐng)域，具體涉及一種杏香兔耳風(fēng)提取物及其質(zhì)量控制方法。
背景技術(shù)：
：杏香兔耳風(fēng)(A附toea/ragra朋Champ)為一民間常用草藥，為菊科植物杏香兔耳風(fēng)的干燥全草，具有清熱利濕，涼血解毒等功效，用于治療虛勞咳血、濕熱黃疽、水腫、癰疽腫毒等病癥?？捎糜谥委煗駸嵯伦⒅畮虏。憩F(xiàn)為白帶過多，色黃稠粘；慢性宮頸炎見以上證候者。分布于江蘇、浙江、江西、福建、臺(tái)灣、湖南、廣東等地。在中國江西省分布廣泛、自南至北均有，有時(shí)在群落中占有一定優(yōu)勢(成片生長)，資源豐富值得開發(fā)利用。臨床上慢性宮頸炎有難以完全治愈及治愈后易復(fù)發(fā)等特點(diǎn)，致病微生物復(fù)雜多樣，通常有細(xì)菌和病毒的雙重感染，目前在這方面還沒有特效藥物。目前市場上有杏香兔耳風(fēng)顆粒等粗制劑及其復(fù)方制劑，臨床應(yīng)用治療濕熱下注型的慢性宮頸炎表現(xiàn)了較好的療效，對(duì)陰道炎、盆腔炎等婦科炎癥疾病也有一定的效果。但現(xiàn)有杏香兔耳風(fēng)中藥均為水提醇沉的粗制劑，其中的功效成分不明，限制了該藥的應(yīng)用推廣。杏香兔耳風(fēng)化學(xué)成分的研究始于二十世紀(jì)八十年代，有關(guān)報(bào)道較少。到目前為止，文獻(xiàn)報(bào)道的化合物包括倍半萜內(nèi)酯類(例如:中美菊素C,8a-羥基-llca3-二氫中美菊素C,11cU3-二氫中美菊素C,4&14-二氫中美菊素C，4^,14,11043-四氫中美菊素C)，酚酸類(例如4,5-0-二咖啡?；鼘幩幔?,5-0-二咖啡?；鼘幩?，綠原酸等)，黃酮類，三萜類，有機(jī)酸類等，據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，這些綠原酸類、倍半萜內(nèi)酯類成分、黃酮類物質(zhì)有抗炎、殺菌、抗病毒等廣泛的藥理活性。公開號(hào)為CN1709417(國別中國，申請(qǐng)日2005年6月16日)的專利中，對(duì)杏香兔耳風(fēng)的提取物的化學(xué)成分的研究提示其中含有黃酮類和內(nèi)酯類物質(zhì)，但未進(jìn)行具體的化學(xué)成分分離和鑒定工作。公開號(hào)為CN1899337(國別中國，申請(qǐng)日2005年7月22日)的專利從其制備的杏香兔耳風(fēng)提取物中分離鑒定出綠原酸類似物，并指出提取物含有有機(jī)酸類成分的含量在50%以上。上述兩專利中提到的杏香兔耳風(fēng)提取物的制備工藝的關(guān)鍵步驟是藥材水煎煮液經(jīng)非極性(或弱極性)大孔樹脂精制，并且都提到大孔樹脂精制所得提取物與傳統(tǒng)的杏香兔耳風(fēng)粗制劑相比抗炎等活性增強(qiáng)。但總的看來，截至目前對(duì)這種有活性增加現(xiàn)象的杏香兔耳風(fēng)提取物的化學(xué)成分及藥理研究還不夠透徹，對(duì)其在治療慢性宮頸炎等婦科炎癥疾病方面的具體有效成分的研究也不清楚。我們對(duì)杏香兔耳風(fēng)大孔樹脂精制物進(jìn)一步的化學(xué)成分研究表明，發(fā)現(xiàn)該精制物主要有綠原酸類似物和倍半萜內(nèi)酯類兩大類成分組成，這兩類成分都具有明顯的治療慢性宮頸炎等婦科炎癥疾病的作用，同時(shí)性質(zhì)穩(wěn)定，容易檢測，適合作為兔兒風(fēng)提取物質(zhì)量控制的指標(biāo)成分。杏香兔耳風(fēng)作為一種中草藥，對(duì)其藥材、提取物及相關(guān)制劑的質(zhì)量進(jìn)行有效控制是必不可少的。目前，已公開的質(zhì)量控制方法是以紫外法或高效液相法測定有機(jī)酸類成分的含量。但是我們對(duì)杏香兔耳風(fēng)的活性提取物的化學(xué)成分研究發(fā)現(xiàn)，提取物不僅含有綠原酸類似物(總酚酸)，還含有倍半萜內(nèi)酯類成分，兩者都為主要成分，因此有必要對(duì)兩者同時(shí)進(jìn)行定性或定量測定，以達(dá)到有效控制其質(zhì)量的目的。杏香兔耳風(fēng)中的倍半萜內(nèi)酯類成分無明顯紫外吸收，先前的研究者可能由于檢測方法的限制，僅應(yīng)用紫外檢測，在研究過程中未發(fā)現(xiàn)倍半萜內(nèi)酯類成分的存在，因此僅僅應(yīng)用紫外法對(duì)有機(jī)酸類成份進(jìn)行測定，本發(fā)明增加了另一主要成分內(nèi)酯類成分的測定，使測定更加精準(zhǔn)，質(zhì)量控制更嚴(yán)，更加適合于工業(yè)化和中藥現(xiàn)代化的需要。本發(fā)明提供一種杏香兔耳風(fēng)提取物，該提取物中主要含有兩類化學(xué)成分。一種是通式為(1)的倍半萜內(nèi)酯類成分
發(fā)明內(nèi)容6r70、Ha,.,oh(1)倍半萜內(nèi)酯類化合物(2)綠原酸類似物其中通式(1)中&為氫或葡萄糖基，R2為氫或羥基，R3為亞甲基或甲基，R卜R2和R3在各自的可選基團(tuán)范圍內(nèi)可以自由組合。通式(1)中R產(chǎn)葡萄糖基，R2二羥基，&=甲基。其化合物為8a-羥基-lla13-二氫葡萄糖中美菊素C;通式(1)中R產(chǎn)葡萄糖基，R產(chǎn)氫，R3-甲基。其化合物為11>13-二氫葡萄糖中美菊素C;通式(1)中R產(chǎn)葡萄糖基，112=氫，&=亞甲基。其化合物為中美菊素C;通式(1)中R產(chǎn)氫，R2二羥基，113=甲基。其化合物為8a-輕基-llA13-二氫中美菊素C。另一種是通式(2)的綠原酸類似物，其通式(2)中Ri、R2和R3可以是咖啡?；驓?。具體化合物是3,5-0-二咖啡酰基奎寧酸，和4,5-0-二咖啡酰基奎寧酸。其中，8a-羥基-llcU3-二氫葡萄糖中美菊素C，為一新化合物，稱為化合物l。其中，11cU3-二氫葡萄糖中美菊素C，為一新化合物。稱為化合物3為此，本發(fā)明要求保護(hù)以上杏香兔耳風(fēng)提取物和以上兩種新的化合物。本發(fā)明的提取物其制備工藝如下選取杏香兔耳風(fēng)藥材，切段。加水煎煮，過濾，合并濾液，減壓濃縮后上AB-8型大孔樹脂，放置一段時(shí)間后首先用水洗脫至近無色，然后改用80-95%乙醇洗脫，收集80-95%乙醇洗脫部分，蒸干即得杏香兔耳風(fēng)提取物。上述杏香兔耳風(fēng)提取物經(jīng)硅膠、反相硅膠、聚酰胺等多種填料多次柱層析分離后得到化合物1和2，具體方法見實(shí)施例。本發(fā)明還包括本發(fā)明的杏香兔耳風(fēng)提取物的質(zhì)量控制方法，該方法是對(duì)其中所含通式(1)倍半萜內(nèi)酯類成分和通式(2)綠原酸類成分進(jìn)行定性或定量測定以達(dá)到控制提取物產(chǎn)品質(zhì)量的目的，本發(fā)明的質(zhì)量控制方法如下用高效液相法對(duì)杏香兔耳風(fēng)中的通式(1)倍半萜內(nèi)酯類成分和通式(2)綠原酸類成分進(jìn)行定性或定量分析，應(yīng)用蒸發(fā)光散射檢測器進(jìn)行檢測分析。其中高效液相所用的流動(dòng)相為甲醇-水或乙腈-水，色譜柱填充劑為十八烷基鍵合相硅膠。高效液相所用的流動(dòng)相中添加有機(jī)酸類改性劑甲酸或乙酸，有機(jī)酸用量為流動(dòng)相的0.1~1%(體積百分比)。所用對(duì)照品為8a-羥基-lla13-二氫葡萄糖中美菊素C和llcU3-二氫葡萄糖中美菊素C中的1至2種?；?qū)φ掌窞橹忻谰账谻和8a-羥基-lla13-二氫中美菊素C中的1至2種。或?qū)φ掌窞?，5-0-二咖啡?；鼘幩岷?,5-0-二咖啡酰基奎寧酸中的1至2種。具體操作方法見實(shí)施例。本發(fā)明還提供本發(fā)明的提取物在制備治療急慢性宮頸炎等婦科炎癥疾病藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明對(duì)6種化合物進(jìn)行了結(jié)構(gòu)鑒定化合物1:無定形粉末。質(zhì)譜ESI(+)-MS,449[M+Na]+，229[M-C6H1206-OH]+;高分辨質(zhì)譜HR-ESI(+)-MS:449.1784(分子式C21H3()09Na，計(jì)算值449.1788，+);[a]2fl。+35.6°(c=0.56,CH3OH);IR(KBr)，^ax(cm"):3418(sh)，2926(m)，1752(sh),1636(m),1456(w),1384(w),1267(w),1226(w),1160(w)，1072(sh)，903(w);1HNMR(CD3OD,400MHz):1.23(3H,d，7.7,H-13),1.96(1H，m,H-2/3),2.15(1H，dd'12.5,8，H-9a)，2'71(1H,dd，12.8,5，H-9j3)，2.30(1H，m，H-2a),2'36(1H,m，H-7),2.77(1H，dd，8,8,H-ll),2,83(1H,dd，9.9，9.9，H-5),3.0(1H，m，H-l)，3.2(1H，與鄰近信號(hào)交疊，H-17),3.26(1H，與鄰近信號(hào)交疊，H-19),3.24(1H，與鄰近信號(hào)交疊，H-20),3.31(1H，與鄰近信號(hào)交疊，H-18),3.64(1H，dd,12,6，H-21),3.72(1H,m,H-8)，3.87(1H,dd,12,2，H-21),4.38(1H,dd，10.6，10.3,H-6)，4.44(1H,d，7.7，H-16),4.61(1H,m,H-3),4.98(1H,s，H-14b)，5.09(1H，s，H-14a),5'32(1H，d，1.5,H-15b)，5.36(1H，d,1.1，H-15a);13CNMR(CD3OD,100MHz):11.84(C-13),38.44(C-2),40.47(C-11),46.01(01orC-9),46.33(C-1orC-9)，52.51(C-5)，54.68(C-7),63.41(C-21),70.94(C-8)，72.36(C-19),75.77(C-17),78.39(C-20)，78.85(C-18)，81.22(C-6),81.6(C-3),102.55(C-16)，115.69(C-15),116.44(C-14),145.91(C-10),151.01(C-4),182.53(C-12).化合物l的iHNMR和"CNMR與8a-羥基-llcU3-二氫中美菊素C(化合物2)多數(shù)信號(hào)相似，但比化合物2多出6個(gè)碳信號(hào)(63103ppm)，ESI(+)-MS顯示化合物l的分子離子峰為449[M+Na]+,分子量比化合物2大162，推測化合物l是由化合物2的3位羥基糖基化后產(chǎn)生的?；衔?與化合物3的NMR多數(shù)信號(hào)相似，但與化合物3的'HNMR相比，化合物l在高場區(qū)(1.03.0)少了兩個(gè)氫信號(hào)(化合物3中的1.88(lH，m,H-8a)和1.44(lH，m,H-8/3))，在低場區(qū)多了一個(gè)H信號(hào)3.72(1H，m)，同時(shí)與化合物3的UCNMR相比，總碳信號(hào)個(gè)數(shù)相同，但化合物l有一碳信號(hào)從低場區(qū)位移至連羥基碳信號(hào)區(qū)域，與化合物3相比化合物1在NMR中發(fā)生的這些變化符合"化合物1是由化合物2的3位羥基糖基化后產(chǎn)生的"的推測。HSQC和^」HCOSY進(jìn)一步確證碳?xì)溥B接關(guān)系，驗(yàn)證了上述推測，并就此對(duì)碳?xì)湫盘?hào)進(jìn)行了歸屬，可以看到化合物3相對(duì)于化合物2在C-3上發(fā)生的向低場約8ppm的位移。ROESY中，H-8分別與H-90、H-13相關(guān)，故H-8為/3構(gòu)型，8位羥基應(yīng)為a取代。H-3與H-2a有相關(guān)信號(hào)而與H-2/3無相關(guān)信號(hào)，表明H-3為a構(gòu)型。H-13分別與H-8/3、H-ll、H-6有相關(guān)信號(hào)而與H-7無相關(guān)信號(hào)，表明H-ll應(yīng)為a構(gòu)型，則CH3-ll為/5取代。因此化合物l應(yīng)為8a-羥基-llcU3-二氫葡萄糖中美菊素C，為一新化合物?；衔?:無定形粉末。質(zhì)譜ESI(+)-MS，433[M+Na]+，231[M-C6H1206+H]+;高分辨質(zhì)譜HR-ESI(+)-MS:433.1828(分子式C21H3()08Na，計(jì)算值433.1838，+)。+41.7°(c=0.40,CH3OH);IR(KBr),ax(cm"):3414(sh)'2932(m),1767(sh)，1637(m)，1452(w),1383(w),1321(w),1226(m),1162(w),1075(sh),1039(sh),899(w);^NMR(CD3OD，400MHz):1.12(3H,dd,7.7,1.5，H-13),1.44(1H，m,H-8/3),1.88(1H,m,H-8a),1.96(1H，m,H-2/3),2.03(1H,m,H-9a),2.35(1H,m，H-2a),2.43(1H，m,H-7),2.53(1H,m,H陽9j8),2.67(1H，m,H-ll)，2.79(1H,m，H-5),2.96(1H，m,H-l),3.24(1H,m,H-17),3.28(1H,m，H陽19)，3.28(1H，m,H-20),3.36(1H，m，H-18),3.66(1H,m,H-21)，3.86(1H,m,H-21'),4.33(1H，dd，9.9，9.9,H-6),4.46(1H,d,9.5,H-16),4.62(1H,m，H陽3),4.91(1H,s,H-14b),4.99(1H，s，H-14a),5,31(1H,s,H-15b)，5,40(1H，s,H-15a);13CNMR(CD3OD，100MHz):12.2(C-13),30(C-8),37(C-9),38.5(C-2),41.4(C-7),45.8(C-1),47.7(C-11),52(C-5)，63.3(C-21),72,2(C-19)，75.7(C-17)，78.4(C-20)，78.7(C-18),81.7(C-3),85.7(C-6),103.3(C-16),114.17(C-15),U4.22(C陽14)，151.4(C-10)，151.5(C-4)，183.1(C-12).化合物3的!HNMR與1113-二氫中美菊素C(BohlmannFetal.GuaianolidesfromA"steea/ragra"s.phytochemistry,1982,21(8):2120)相4以，比較具有特征性的信號(hào)(如兩個(gè)環(huán)外雙鍵4.84,5.10，5.07,5.35、一個(gè)甲基1.12)的位移都極為接近，UCNMR中也出現(xiàn)了兩個(gè)環(huán)外雙鍵114.17(亞甲基)、114.22(亞甲基)、151.4(C)、151.5(C)、一個(gè)甲基12.2和一個(gè)羰基183.1等特征信號(hào)，但從NMR看化合物3比11513-二氫中美菊素C多出了一糖基信號(hào)。HNMR，3.23.9，m，多個(gè)氫；13CNMR，63103，6個(gè)碳信號(hào))，ESI(+)-MS提示化合物3的分子量比11*13-二氫中美菊素C大162，因此我們推測化合物3可能是11*13-二氫中美菊素C的3位羥基糖基化而產(chǎn)生的，'H」HCOSY、HSQC、HMBC和ROESY證實(shí)了上述推測，并就此對(duì)碳?xì)湫盘?hào)進(jìn)行了歸屬，HMBC顯示H-l'與C-3相關(guān)、H-3與C-1'相關(guān)，表明糖基確實(shí)連接在C-3上。ROESY中H-3與H-2a相關(guān)而不與H-2/相關(guān)表明H-3為a構(gòu)型；H-13分別與H-8/3、H-ll、H-6有相關(guān)信號(hào)而與H-7無相關(guān)信號(hào)，表明H-ll應(yīng)為a構(gòu)型，貝ijCH3-ll為i3取代；H-14b與H-9針目關(guān)，H-14a與H-l、H-2ot目關(guān)，故可以將C-14上的兩個(gè)烯氫區(qū)分開，空間上靠近H-l—側(cè)的為H-14a(4.99)，靠近H-鄰一側(cè)的為H-14b(4.91);從H-15a與H-l'的弱相關(guān)信號(hào)和H-15b與H-5、H-6的弱相關(guān)信號(hào)也可以區(qū)分C-15上的兩個(gè)烯氫，空間上靠近H-l'—側(cè)的為H-15a(5.40)，靠近H-5—側(cè)的為H-15b(5.31)。因此化合物3應(yīng)為UaJ3-二氫葡萄糖中美菊素C，為一新化合物。化合物2的ESI(+)-MS分子離子峰為287[M+Na]+，'HNMR(CDC13,400MHz)數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)(BohlmannFetal.Guaianolidesfrom/ragra肌phytochemistry，1982,21(8):2120)—致，鑒定為8-羥基-11)13-二氫中美菊素C。化合物4的ESI(+)-MS分子離子峰為431[M+Na]+，！HNMR(C5DsN，400MHz)和13CNMR(C5D5N,100MHz)數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)(AdegawaSetal.SesquiterpenelactonesfromD/a印朋朋^Msw"i/7onw(SCH.BIP.)KITAM.Chem.Pharm.Bull.，1987，35(4):1479)—致，鑒定為葡萄糖中美菊素C，為首次從杏香兔耳風(fēng)中分離得到?；衔?和化合物6的MS、NMR等數(shù)據(jù)，經(jīng)與文獻(xiàn)對(duì)照，分別確證為3,5-0-二咖啡?；鼘幩岷?,5-0-二咖啡?；鼘幩帷１景l(fā)明的提取物具有良好的治療急慢性宮頸炎等婦科炎癥疾病的作用，其中的通式(1)倍半萜內(nèi)酯類成分和通式(2)綠原酸類成分也具有這方面的作用，新的化合物1和3也具有這方面的作用。本發(fā)明應(yīng)用高效液相-蒸發(fā)光散射法(HPLC-ELSD)，研究了杏香兔耳風(fēng)提取物的圖譜，對(duì)其主要峰進(jìn)行指認(rèn)?？疾炝艘译?水、甲醇-水不同比例的流動(dòng)相以及水相中加入0.1-1.0%甲酸的濃度對(duì)指紋圖譜的影響。最后優(yōu)選的色譜條件為Agilent1100HPLC-DAD,AlltechELSD2000蒸發(fā)光檢測器；依利特hypersil0DS25|im(4.6mmX250mm)色譜柱；梯度洗脫條件見下表l，流速lml/min，柱溫室溫；ELSD設(shè)置漂移管溫度l12.8°C，載氣(空氣)流速3.lL/min。表lHPLC-ELSD梯度洗脫條件<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>提取物ELSD的指紋圖譜中共顯示8個(gè)主峰(附圖l)，倍半萜內(nèi)酯類成分和綠原酸類似物各占4個(gè)。采用化合物l-6作為對(duì)照品，指認(rèn)出相應(yīng)峰位依次為8a-羥基-lla13-二氫葡萄糖中美菊素C(峰l，19.1min)、8a-羥基-llcU3-二氫中美菊素C(峰2,20.6min)、4,5-0-二咖啡?；鼘幩?峰3，27.4min)、3,5-0-二咖啡酰基奎寧酸(峰4，28.1min)、llcU3-二氫葡萄糖中美菊素C(峰5，32.8min)和葡萄糖中美菊素C(峰6，34.0min)。采用同一條件，測定了其中3個(gè)成份的含量(峰l、4、6)，其中峰l(8a-羥基-110)13-二氫葡萄糖中美菊素C)的平均含量為3.5%，峰4(3，5-0-二咖啡?；鼘幩?的平均含量為7.5%，峰6(葡萄糖中美菊素C)的平均含量為3.5%。本發(fā)明的突出特點(diǎn)在于通過深入研究分析，首次明確了杏香兔耳風(fēng)提取物中的活性成分，主要由倍半萜內(nèi)酯類和綠原酸類成分構(gòu)成，倍半萜內(nèi)酯類化合物l-4中有2個(gè)為新化合物。本發(fā)明并首次確定了采用HPLC-ELSD法對(duì)倍半萜內(nèi)酯類和綠原酸類成分的定性和定量分析方法。文獻(xiàn)報(bào)道杏香兔耳風(fēng)中的倍半萜內(nèi)酯類和綠原酸類成分一般具有較強(qiáng)的抑菌、抗炎活性。本發(fā)明通過對(duì)杏香兔耳風(fēng)提取物中倍半萜內(nèi)酯類和綠原酸類成分的深入分離鑒定和分析研究，進(jìn)一步明確了兔兒風(fēng)提取物中的主要有效成份及其質(zhì)量控制方法，為安全、有效、可控地進(jìn)行杏香兔耳風(fēng)提取物的新藥開發(fā)奠定了物質(zhì)基礎(chǔ)。附圖1為本發(fā)明所述兔耳風(fēng)提取物樣品的HPLC-ELSD分析圖譜具體實(shí)施例方式以下所給出的優(yōu)選實(shí)施例，旨在進(jìn)一步闡明本發(fā)明的化合物、制備方法，而并非限定所舉例的化合物的范圍，即是說通過這些實(shí)施例所述的方法可很容易地制得化合物l-6，對(duì)本發(fā)明的互換或改動(dòng)，以及使用類似的溶劑，對(duì)于本專業(yè)的普通技術(shù)人員是不需要?jiǎng)?chuàng)造性勞動(dòng)的。且以下實(shí)施例不得理解為任何意義上的對(duì)本發(fā)明權(quán)利要求的限制。實(shí)施例l:杏香兔耳風(fēng)提取物的制備稱取杏香兔耳風(fēng)藥材lkg，用20倍水量分3次加熱煎煮(8倍、6倍、6倍，第一次煎煮前浸泡半小時(shí))，每次煎煮l小時(shí)，過濾，濾液合并，濃縮至每lml相當(dāng)于含lg藥材的量(濃縮溫度65-7(TC)。濃縮液上AB-8大孔樹脂(柱床體積約5L)，上樣后放置4小時(shí)使吸附平衡，先用蒸餾水洗脫至洗脫液基本無色，再用95%醫(yī)用酒精洗脫(約20L)，收集酒精洗脫液，濃縮，干燥，得杏香兔耳風(fēng)提取物約70g(浸膏)。實(shí)施例2:化合物l-6的分離純化實(shí)施例l中所得部分杏香兔耳風(fēng)提取物浸膏(約60g)，按約l:3加入硅膠拌樣，進(jìn)行減壓柱層析(薄層層析硅膠H，化學(xué)純，250g)，依次用氯仿4000ml、氯仿-甲醇(3:1)1500ml、甲醇1500ml、甲醇-甲酸(95:5)3000ml洗脫，收集各比例段洗脫部分，蒸干后得氯仿洗脫部分1.9g、氯仿-甲醇(3:1)洗脫部分16.8g(T3-2)和甲醇及甲醇-甲酸(95:5)洗脫部分24.6g。T3-2上中壓柱層析(49mmX230mm，薄層層2析硅膠H約200g)，依次用不同比例得氯仿-甲醇洗脫(99:1—65:35，純甲醇)，得浸膏T3-2-lT3-2-10共計(jì)10段，其中T3-2-2為1.6g、T3陽2陽5為2.1g、T3陽2-6為1.6g、T3-2-7為2.65g、T3-2-8為0.56g。T3-2-7(500mg)經(jīng)反相中壓柱層析(富士22-45/miODS,175g)，用乙腈-水(0.5%甲酸)梯度洗脫得到化合物1(97.8mg，乙腈-水7.5:92.5可洗脫出來)。T3-2-2(450mg)經(jīng)反相中壓柱層析(富士22-45/xmODS，175g)，用乙腈-水(5:95，水中含0.5%甲酸)洗脫得到化合物2(105mg)。T3-2-5(450mg)經(jīng)反相中壓柱層析，用乙腈-水(12.5:87.5至15:85，水中含0.5%甲酸)洗脫得到化合物3(76mg)和化合物4(105mg)。T3-2-6(500mg)經(jīng)反相中壓柱層析，用乙腈-水(15:85，水中含0.5%甲酸)洗脫得到化合物5(30mg)。T3-2-8(560mg)經(jīng)反相中壓柱層析，用乙腈-水梯度洗脫(10:卯至25:75,水中含0.5%甲酸)得到化合物6(17mg)。實(shí)施例3:杏香兔耳風(fēng)提取物的質(zhì)量控制方法供試品溶液的制備取實(shí)施例l中所得杏香兔耳風(fēng)提取物(浸膏)50.5mg置10ml容量瓶中，加甲醇定容，并超聲10min以上使充分溶解得供試品溶液。放入冰箱待用。對(duì)照品溶液的制備稱取10.80mg化合物5置10ml容量瓶中，加甲醇定容，搖勻，得對(duì)照品溶液C5-hl。精密量取C5-hl2.000m咖甲醇定容于5ml容量瓶得對(duì)照品溶液C5-h0.4，精密量取C5-hl1.000ml加甲醇定容于10ml容量瓶得對(duì)照品溶液C5-h0.1。稱取12.00mg化合物l和25.99mg化合物8置于同一容量瓶中，加甲醇定容，搖勻得對(duì)照品溶液(Cl+C8)-hl，精密量取(Cl+C8)-hl2.000ml置5ml容量瓶得對(duì)照品溶液(Cl+C8)-h0.4，精密量取(Cl+C8)-h0.42.500ml置5ml容量瓶得對(duì)照品溶液(Cl+C8)-h0.2，精密量取(Cl+C8)-hl1.000ml置10ml容量瓶得對(duì)照品溶液(Cl+C8)-h0.1。Cl、C5和C8的純度分別為96.7X、86.0%禾口97.6%。色譜條件Agilent1100HPLC系統(tǒng)，AlltechELSD2000蒸發(fā)光檢測器；依利特hypersil0DS25pm(4.6mmx250mm)色譜柱；梯度洗脫條件見下表2，流速lml/min，柱溫室溫；ELSD設(shè)置漂移管溫度112.8。C，載氣(空氣)流速3.1L/min，撞擊器關(guān)。表2流動(dòng)相梯度條件表<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>測定法分別精密吸取對(duì)照品溶液IO、20Ml和供試品溶液20Ml，注入液相色譜儀，測定，即得。結(jié)果峰l(8a-羥基-llcU3-二氫葡萄糖中美菊素C)的含量為3.822%，峰4(3,5-0-二咖啡?；鼘幩?的含量為7.786%,峰6(葡萄糖中美菊素C)的含量為3.760%。權(quán)利要求1、一種杏香兔耳風(fēng)提取物，其特征在于該提取物中含有通式為(1)的倍半萜內(nèi)酯類成分。通式(1)倍半萜內(nèi)酯類化合物其中通式(1)中R1為氫或葡萄糖基，R2為氫或羥基，R3為亞甲基或甲基，R1、R2和R3在各自的可選基團(tuán)范圍內(nèi)可以自由組合。2、如權(quán)利要求1所述的杏香兔耳風(fēng)提取物，其特征在于該提取物還含有通式為(2)的綠原酸類似物，其中通式(2)中R卜R2和R3可以是咖啡酰基或氫。3、如權(quán)利要求1所述的提取物，其特征在于該提取物中含有8a-羥基-llo;13-二氫葡萄糖中美菊素C,11aJ3-二氫葡萄糖中美菊素C，中美菊素C，8a-羥基13-二氫中美菊素C，3,5-0-二咖啡?；鼘幩岷?,5-0-二咖啡?；鼘幩?。4、如權(quán)利要求1提取物的質(zhì)量控制方法，其特征在于用高效液相法對(duì)杏香兔耳風(fēng)中通式為(1)的倍半萜內(nèi)酯類成分和通式為(2)的綠原酸類成分進(jìn)行定性或定量分析。5、如權(quán)利要求4所述的質(zhì)量控制方法，其特征在于應(yīng)用蒸發(fā)光散射檢測器進(jìn)行檢測分析。6、權(quán)利要求4所述的質(zhì)量控制方法，其特征在于高效液相所用的流動(dòng)相為甲醇-通式(l)倍半萜內(nèi)酯類化合物通式(2)綠原酸類似物水或乙腈-水，色譜柱填充劑為十八烷基鍵合相硅膠；高效液相所用的流動(dòng)相中添加有機(jī)酸類改性劑甲酸或乙酸，有機(jī)酸用量為流動(dòng)相的0.1~1%(體積百分比)。7、權(quán)利要求4所述的質(zhì)量控制方法，其特征在于，步驟如下照中國藥典2005年版附錄VID高效液相色譜法操作進(jìn)行。色譜條件和系統(tǒng)適用性試驗(yàn)以十八垸基鍵合相硅膠為填充劑；以乙腈-水-甲酸為流動(dòng)相梯度洗脫(梯度洗脫條件見下表)；蒸發(fā)光散射檢測器。理論塔板數(shù)按葡萄糖中美菊素C計(jì)算應(yīng)不低于2000。<table>tableseeoriginaldocumentpage3</column></row><table>對(duì)照品溶液的制備精密稱取8a-羥基-llA13-二氫葡萄糖中美菊素C對(duì)照品、8a-羥基-lla13-二氫中美菊素C對(duì)照品、4，5-0-二咖啡?；鼘幩釋?duì)照品、3，5-0-二咖啡?；鼘幩釋?duì)照品、11"13-二氫葡萄糖中美菊素C對(duì)照品、葡萄糖中美菊素C對(duì)照品適量，加甲醇分別制成每lml含8a-羥基-llA13-二氫葡萄糖中美菊素0.3mg、8a-羥基-llA13-二氫中美菊素C0.5mg、4，5-0-二咖啡?；鼘幩?.5mg、3,5-0-二咖啡?；鼘幩?.5mg、lla13-二氫葡萄糖中美菊素C0.5mg、葡萄糖中美菊素C0.3mg、的溶液，即得。供試品溶液的制備取杏香兔耳風(fēng)提取物50.5mg置10ml容量瓶中，加甲醇定容，并超聲處理(功率300W，頻率45kHz)20分鐘，取出，放至室溫，稱定重量，用甲醇補(bǔ)足失重，搖勻，過濾，取續(xù)濾液，即得。測定法分別精密吸取8a-羥基-llA13-二氫葡萄糖中美菊素C、3,5-0-二咖啡酰基奎寧酸、葡萄糖中美菊素c3種對(duì)照品溶液10Ad、20m1，供試品溶液20m1，注入液相色譜儀，測定，以外標(biāo)兩點(diǎn)法對(duì)數(shù)方程計(jì)算，即得。分別精密吸取8a-羥基-llcU3-二氫中美菊素C、4，5-0-二咖啡?；鼘幩帷?3-二氫葡萄糖中美菊素C1020M1，注入液相色譜儀，供試品色譜圖中，在相同保留時(shí)間處出現(xiàn)與對(duì)照品相同的色譜峰?？蓪?duì)上述3種成分進(jìn)行定性鑒別。8、如權(quán)利要求4所述的質(zhì)量控制方法，其特征在于所用指標(biāo)性成分或?qū)φ掌窞?a-羥基-llc^13-二氫葡萄糖中美菊素C和11CU3-二氫葡萄糖中美菊素C中的1至2種，或中美菊素C和8a-羥基-llA13-二氫中美菊素C中的1至2種或3，5-0-二咖啡酰基奎寧酸和4,5-0-二咖啡?；鼘幩嶂械?至2種。9、如權(quán)利要求1所述的提取物在制備治療急慢性宮頸炎等婦科炎癥疾病藥物中的應(yīng)用。10、權(quán)利要求l所述的提取物中含有的兩種化合物，是8a-羥基-llcU3-二氫葡萄糖中美菊素C，和llc^3-二氫葡萄糖中美菊素C。全文摘要本發(fā)明涉及一種杏香兔耳風(fēng)提取物及其活性成分以及它們的質(zhì)量控制方法，該杏香兔耳風(fēng)提取物含有通式為(1)的倍半萜內(nèi)酯類和通式為(2)的綠原酸類兩類成分，通式(1)中R₁為氫或葡萄糖基，R₂為氫或羥基，R₃為亞甲基或甲基，R₁、R₂和R₃在各自的可選基團(tuán)種類內(nèi)可以自由組合；通式(2)中R₁、R₂和R₃可以是咖啡?；驓?，以上兩類成分可應(yīng)用于杏香兔耳風(fēng)藥材或其提取物的質(zhì)量控制。文檔編號(hào)A61P17/00GK101347482SQ200810084928公開日2009年1月21日申請(qǐng)日期2008年3月7日優(yōu)先權(quán)日2008年3月7日發(fā)明者劉江云,李興尚,蔡金娜申請(qǐng)人:上海中創(chuàng)醫(yī)藥科技有限公司