專利名稱：：杏香兔耳風總酚酸提取物及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種杏香兔耳風總酚酸提取物及其制備方法，屬于天然藥物有效成分制備領(lǐng)域。技術(shù)背景杏香兔耳風(AinsliaeafragransChamp.)是菊科兔耳風屬植物，具有清熱解毒、利濕、止血等功效，民間以全草入藥，用于治療肺結(jié)核吐血、跌打損傷、無名腫痛、空腔炎、水腫、慢性子宮頸炎等疾患，為《江西省中藥材標準》1996年版收載，其成藥復(fù)方杏香兔耳風顆粒及片為中藥保護品種。有報道對金葡菌、乙型鏈球菌、脊髓灰質(zhì)炎病毒、單純疽疹病毒(HSV-1)、麻疹病毒等有抑制作用?，F(xiàn)代研究表明，杏香兔耳風藥材含酚類、黃酮類、有機酸類、倍半萜內(nèi)酯類、三萜類等成分，其中包括綠原酸、咖啡?？鼘幩?、無羈萜酮、三十二垸酸、3-谷甾醇、黃酮類化合物檉柳素及其苷等，其中酚酸類化合物為其有效的抗病毒成分，綠原酸常作為兔耳風的質(zhì)量控制指標。現(xiàn)有劑型中，兔耳風常是經(jīng)粗步提取后直接制成單位機制，日服用量大。中國專利申請200510087008.7中，公開了一種制備兔耳風總有機酸的方法，其采用的是水提取濃縮后往濃縮液中加鹽酸調(diào)pH，而在兔耳風藥材中，存在一些劑性相對較小的有機酚酸類成分，在水中游離后溶解度不是很好，這樣的提取操作會導(dǎo)致一些有效成分的損失。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于提供一種制備杏香兔耳風總酚酸提取物的方法，本發(fā)明提取時采用乙醇提取，提取后的回收液在含乙醇約30%的情形下加鹽酸調(diào)pH使酚酸類成分從中游離而溶于乙醇溶液中，克服了對一些極性相對較小的酚酸類成分不易溶解于水腫而隨沉淀一起損失的缺陷，且最終提取物得率高，提取物中酚酸含量也有較大提高。本發(fā)明杏香兔耳風酚酸類提取物的制備方法可以通過如下方式制備而得，杏香兔耳風干燥藥材，粉碎成粗粉，以40%-70%的乙醇提取，過濾，取濾液，濾液減壓濃縮，加乙醇使溶液乙醇濃度為20°/。-40%，每毫升溶液相當于原藥材0.8-1.0g，往溶液中加鹽酸調(diào)pH至1.0-3.0，靜置，冷處放置12-24小時，離心或過濾，取清液，清液減壓濃縮至無醇，濃縮物加蒸餾水溶解分散，將分散物上以處理好的大孔吸附樹脂柱上，先用去離子水洗脫至水洗液顏色變淡，改用含水乙醇洗脫，至酚酸顯色反應(yīng)呈陰性，收集乙醇洗脫液，合并，減壓濃縮，干燥，即得兔耳風酚酸提取物。本發(fā)明中，在用鹽酸調(diào)pH使酚酸完全游離時，優(yōu)選將pH調(diào)至約l.O。本發(fā)明中，大孔吸附樹脂柱所用填料可以選自AB-8型、NKA-9型、D-101型、HP-20型大孔樹脂，洗脫樹脂柱時，所使用的乙醇優(yōu)選為70%的乙醇。采用本發(fā)明方法制備所得到的杏香兔耳風提取物中，提取物總酚酸含量大于60%，總酚酸中包括有機酚酸和一些黃酮類成分，提取物以綠原酸計，綠原酸的含量不低于l°/o，其含量范圍為1%~5%之間，其含量的不同視不同產(chǎn)地的藥材而不同，本發(fā)明采用江西產(chǎn)杏香兔耳風，其藥材中綠原酸含量約為0.25%，所得提取物中，綠原酸含量約為3.6%。本發(fā)明中，提取總酚酸類成分的藥材除可以為杏香兔耳風外，還可以是兔耳風屬中的其它兔耳風藥材。本發(fā)明提取物具有抗炎抗病毒的作用，可用于制備具有抗炎看病毒的藥物。杏香兔耳風藥材有效成分的具體提取方案為取杏香兔耳風干燥藥材1000g，粉碎成粗粉，加8倍量的70%的乙醇回流提取3次，每次1.5小時、過濾，合并各次提取濾液，60'C減壓濃縮，加乙醇調(diào)至濃縮液中，使藥液最終含醇量約為30%，每毫升藥液相當于杏香兔耳風原藥材約0.9g，然后加1N的鹽酸調(diào)pH至pH約為1.0，充分攪拌均勻，室溫放置18小時，離心，取上清液，上清液繼續(xù)減壓濃縮至無醇，將濃縮物上已處理好的AB-8型大孔吸附脂柱，先以去離子水洗脫至水洗脫液顏色變淡，改用70%的乙醇洗脫，至FeCB顯色反應(yīng)呈陰性，合并70%的乙醇洗脫部分，減壓濃縮，真空干燥，得杏香兔耳風酚酸提取物51.3g，依此法制備三批樣品。提取物中綠原酸含量的測定。色譜條件色譜柱DiamonsilTMC180DS柱(5ym，200mmX4.6腿)，流動相甲醇-2%冰醋酸(20:80)，流速lml/min，檢測波長327nm，柱溫25°C，理論塔板數(shù)按綠原酸計不得低于3000.對照品、供試品的制備對照品溶液的配置精密稱取綠原酸對照品適量，置棕色容量瓶中，加5(m的甲醇制成每毫升含30yg綠原酸；供試品溶液的配置精密稱取杏香兔耳風提取物O.lg，置100ml容量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度，微孔濾膜過濾，備用。依次測定各批提取物中綠原酸含量，結(jié)果見表l表l三批杏香兔耳風提取物中綠原酸含量測定結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>三批樣品中綠原酸在提取物中的平均含量為3.63%。提取物中總酚酸含量的測定。標準曲線的繪制精密稱取干燥至恒重的原兒茶醛對照品10.4mg至50ml容量瓶中，加無水乙醇溶解，稀釋至刻度。分別吸取0.2、0.4、0.6、0.8、l.OmL至lOmL容量瓶屮，加無水乙醇至2mL，再分別加0.3%的十二烷基硫酸鈉0.8mL及0.6%三氯化鐵-0.9%鐵氰化鉀(1:0.9)混合溶液0.4mL，混勻，在暗處放置5min，加0.1mol/L的HCl溶液至刻度，暗處放置20min，隨行無水乙醇溶液做空白對照，用紫外-可見分光光度計于500nm處依次測定吸光度，各濃度吸收度依次為0.122、0.256、0.376、0.498、0.621，以濃度為橫坐標，吸收度為縱坐標繪制標準曲線，回歸方程為A=0.024C+0.0026,A為吸收度，C為濃度，R二0.9998。曲線如附圖6樣品溶液的制備精密稱取杏香兔耳風提取物40.2、40.8、40.5mg，置50mL容量瓶中，無水乙醇溶解并定容至刻度，過0.5um微孔濾膜，備用，三份樣品各精密吸取0.5mL至10mL容量瓶中，顯色過程同對照品處理，以500nm處測定其吸收度，計算總酚酸含量。含量測定結(jié)果見表1表1三批提取物總酚酸含量測定結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>三批樣品提取物中總酚酸提取物的平均含量為65.77%。圖1為本發(fā)明綠原酸對照品液相色譜圖；圖2為本發(fā)明杏香兔耳風液相色譜圖；圖3為本發(fā)明第一批杏香兔耳風總酚酸提取物液相色譜圖;圖4為本發(fā)明第二批杏香兔耳風總酚酸提取物液相色譜圖;圖5為本發(fā)明第三批杏香兔耳風總酚酸提取物液相色譜圖;圖6為原兒茶醛紫外-可見分光光度標準曲線圖。具體實施例以下從提取物制備實施例簡單說明本發(fā)明，但所列舉的實施例并不是為了限制本發(fā)明實施方案。實施例1取杏香兔耳風干燥藥材lOOOg，粉碎成粗粉，加10倍量的40%的乙醇回流提取3次，每次2小時，過濾，合并各次提取濾液，6(TC減壓濃縮，加乙醇調(diào)至濃縮液中，使藥液最終含醇量約為20%，每毫升藥液相當于杏香兔耳風原藥材約l.Og，然后加1N的鹽酸調(diào)pH至pH約為2.0，充分攪拌均勻，室溫放置24小時，離心，取上清液，上清液繼續(xù)減壓濃縮至無醇，將濃縮物上已處理好的NKA-9型大孔吸附脂柱，先以去離子水洗脫至水洗脫液顏色變淡，改用60%的乙醇洗脫，至FeCl3顯色反應(yīng)呈陰性，合并60%的乙醇洗脫部分，減壓濃縮，真空干燥，得杏香兔耳風酚酸提取物55.7g。實施例2取兔耳風干燥藥材1000g，粉碎成粗粉，加12倍量的60%的乙醇回流提取3次，每次1小時，過濾，合并各次提取濾液，6(TC減壓濃縮，加乙醇調(diào)至濃縮液中，使藥液最終含醇量約為40%，每毫升藥液相當于杏香兔耳風原藥材約0.8g，然后加lN的鹽酸調(diào)pH至pH約為1.5，充分攪拌均勻，室溫放置12小時，離心，取上清液，上清液繼續(xù)減壓濃縮至無醇，將濃縮物上已處理好的HP-20型大孔吸附脂柱，先以去離子水洗脫至水洗脫液顏色變淡，改用70%的乙醇洗脫，至FeC13顯色反應(yīng)呈陰性，合并70%的乙醇洗脫部分，減壓濃縮，真空干燥，得杏香兔耳風酚酸提取物4S.7g.實施例3對大腸桿菌所致大鼠慢性盆腔炎的作用Wister大鼠40只，隨機分為四組，依次為假手術(shù)組、模型組、杏香兔耳風總酚酸提取物組和婦科千金片組，杏香兔耳風給藥量為60mg/kg.d"，每天給藥1次，連續(xù)給藥21天，然后測定大鼠免疫功能并進行大鼠子宮形態(tài)學觀察，結(jié)果表明，杏香兔耳風總酚酸提取物給藥GOmg/kg-d—1,凝集素效價為85.8±1.7，與模型組(36.9±1.7)相比，大鼠血清凝集素效價顯著升高，PO.01;本發(fā)明提取物給藥組淋巴細胞轉(zhuǎn)化指數(shù)為1.6±0.6，與模型組1.2±0.2相比，具有顯著性差異，PO.Ol，淋巴細胞轉(zhuǎn)化指數(shù)明顯提高。組織形態(tài)學觀察發(fā)現(xiàn)，模型組肉眼觀察子宮腫脹、發(fā)硬，與周圍組織粘連，形成硬結(jié)，鏡下見宮壁粘膜與肌層結(jié)構(gòu)模糊，多數(shù)上皮細胞變性壞死脫落，宮壁各層組織充血水腫伴隨大量嗜酸性粒細胞及少量淋巴細胞細胞浸潤，粘膜層、肌層中有多量成纖維細胞增生給藥組大鼠慢性盆腔炎病理改變明顯減輕；杏香兔耳風60mg/kg.cf1組，肉眼觀子宮略微增大，鏡下宮壁各層結(jié)構(gòu)尚清晰，少數(shù)上皮細胞脫落，內(nèi)膜淺層組織充血水腫伴中等量嗜酸性粒細胞浸潤，粘膜中僅有極少量成纖維細胞增生。上述結(jié)果說明杏香兔耳風總酚酸提取物對大腸桿菌所致大鼠慢性盆腔炎有明顯治療作用。權(quán)利要求1、一種杏香兔耳風總酚酸提取物，其特征是所述提取物通過下述方法制備取杏香兔耳風干燥藥材，粉碎成粗粉，以40％-70％的乙醇提取，過濾，取濾液，濾液減壓濃縮，加乙醇使溶液乙醇濃度為20％-40％，每毫升溶液相當于原藥材0.8-1.0g，往溶液中加鹽酸調(diào)pH至1.0-3.0，靜置，冷處放置12-24小時，離心或過濾，取清液，清液減壓濃縮至無醇，濃縮物加蒸餾水溶解分散，將分散物上已處理好的大孔吸附樹脂柱上，先用去離子水洗脫至水洗液顏色變淡，改用含水乙醇洗脫，至酚酸顯色反應(yīng)呈陰性，收集乙醇洗脫液，合并，減壓濃縮，干燥，即得兔耳風酚酸提取物。2、根據(jù)權(quán)利要求1所述的酚酸提取物，其特征是洗脫柱用的含水乙醇優(yōu)選為70%的乙醇。3、根據(jù)權(quán)利要求1所述的酚酸提取物，其特征是加鹽酸調(diào)pH值優(yōu)選為1.0。4、根據(jù)權(quán)利要求1所述的酚酸提取物，其特征是所述的酚酸提取物含有有機酚酸類和黃酮類成分。5、根據(jù)權(quán)利要求3所述的酚酸提取物，其特征是所述的有機酚酸類成分包括綠原酸。6、根據(jù)權(quán)利要求1所述的酚酸提取物，其特征是所述的酚酸提取物中總酚酸的含量大于60%。7、根據(jù)權(quán)利要求1所述的酚酸提取物，其特征是以綠原酸計，提取物中綠原酸的含量為1%5%。8、根據(jù)權(quán)利要求6所述的酚酸提取物，其特征是提取物中綠原酸的含量為2%~4%。9、如權(quán)利要求1-8中任一權(quán)利要求在制備治療婦科炎癥藥物中的應(yīng)用。全文摘要本發(fā)明涉及一種杏香兔耳風總酚酸提取物及其制備方法，杏香兔耳風藥材經(jīng)70％乙醇回流提取后，乙醇提取液濃縮至少體積并控制溶液中乙醇含量為20％-40％，以鹽酸調(diào)pH至1-3后，靜置過濾，清液濃縮后上大孔吸附樹脂柱，水洗后再以乙醇洗脫，收集乙醇洗脫液濃縮干燥即得本發(fā)明提取物，其總酚酸含量可達60％以上，提取物中綠原酸可達3％以上。本發(fā)明提取物具有抗炎作用，可以用于制備具有治療婦科炎癥的藥物。文檔編號A61P31/12GK101332216SQ20081011190公開日2008年12月31日申請日期2008年5月20日優(yōu)先權(quán)日2008年5月20日發(fā)明者熊國裕申請人:北京星昊醫(yī)藥股份有限公司