專利名稱：一種可誘導癌細胞凋亡的載體及其應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種可誘導癌細胞凋亡的載體及其應用。
背景技術：
caspase-3是參與細胞凋亡信號通路中眾多半胱天冬酶的一種，正常情況下 caspase-3以無活性酶原的形式存在于細胞漿中。當細胞在一系列內源性基因的調 控下要發(fā)生凋亡時，處于細胞凋亡信號通路上游起始凋亡的半胱天冬酶便被激活， 而caspase-3正是被這些上游的caspases激活，生成活化的caspase-3 p17和p12 亞基，兩種亞基再組裝成活性形式的ca印ase-3，發(fā)揮其執(zhí)行凋亡的功能。所以 caspase-3通常被認為是細胞凋亡過程中最主要的終末剪切酶。
目前，雖然雙啟動子載體可用于兩個基因的協(xié)同表達,但是兩個基因往往會轉 錄干擾和/或不同水平的表達，有時報告基因表達了但插入的目的基因不一定表達。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的是提供一種重組表達載體，該載體可同時表達兩個蛋白，這兩個 蛋白可形成活性形式的caspase-3，進而激活細胞凋亡信號通路，促進腫瘤細胞凋 亡。
本發(fā)明提供了轉錄融合雙基因片段K，自上游至下游依次為caspase-3 P17亞 基基因序列、IRES序列和caspase-3 P12亞基基因序列。
所述caspase-3 P17亞基基因序列是如下1)或2)或3)的DNA分子
1) 其核苷酸序列是序列表中序列1所示的DNA分子；
2) 在嚴格條件下與l)限定的DNA序列雜交且具有相同功能的DNA分子；
3) 與序列表中序列1限定的DNA序列具有90y。以上同源性，且具有相同功能的 DNA分子。
所述IRES序列是如下4)或5)或6)的DNA分子
4) 其核苷酸序列是序列表中序列3所示的DNA分子；
5) 在嚴格條件下與l)限定的DNA序列雜交且具有相同功能的DNA分子；
6) 與序列表中序列3限定的DNA序列具有90%以上同源性，且具有相同功能的 DNA分子。所述caspase-3 P12亞基基因序列是如下7)或8)或9)的DNA分子
7) 其核苷酸序列是序列表中序列2所示的DNA分子；
8) 在嚴格條件下與l)限定的DNA序列雜交且具有相同功能的DNA分子；
9) 與序列表中序列2限定的DNA序列具有90%以上同源性，且具有相同功能的 DNA分子。
上述嚴格條件可為在6XSSC， 0.5。/。SDS的溶液中，在65。C下雜交，然后用2X SSC， 0. 1% SDS和1 XSSC， 0. 1% SDS各洗膜一次。
含有上述任一所述基因片段K的表達盒或重組表達載體均屬于本發(fā)明的保護范圍。
所述重組表達載體為真核表達載體。
所述載體中還可包含PBR322復制起點和/或氨芐青霉素抗性基因。 所述重組表達載體可按照基因工程領域的常規(guī)方法構建，如可按照如下方法構 建PCRC:
所述PCRC是將IRES序列插入質粒PC1的caspase-3 P17亞基基因序列和 caspase-3 P12亞基基因序列間得到的；
所述質粒PC1是將pcDNA3. 1 (-)的Jfel和^adH位點間的小片段取代為 caspase-3 P17和caspase-3 P12亞基基因序列得到的。
含有上述任一所述基因片段K的細胞系或重組菌也都屬于本發(fā)明的保護范圍。
所述重組表達載體、表達盒、細胞系和重組菌均可應用于制備誘導癌細胞凋亡 的藥物或抗癌藥物。
本發(fā)明通過IRES將caspase-3 P17亞基基因和caspase-3 P12亞基基因融合 形成轉錄融合雙基因，將該轉錄融合雙基因插入真核表達載體得到的重組表達載體 可以在轉染細胞中高效地表達活性形式的caspase-3，從而激活細胞凋亡信號通路， 促進細胞凋亡。將本發(fā)明的重組表達載體轉入癌細胞，可以有效地誘導腫瘤細胞的 凋亡，為基因治療提供新的手段。本發(fā)明的重組表達載體可以用于制備誘導癌細胞 凋亡的藥物或抗癌藥物。本發(fā)明將在生物醫(yī)藥領域及基因功能的研究中發(fā)揮重要作 用，應用前景廣闊。
以下的實施例便于更好地理解本發(fā)明，但并不限定本發(fā)明。


圖1為針對PARP的western blot圖
具體實施例方式
下述實施例中所用方法如無特別說明均為常規(guī)方法，具體步驟可參見 《Molecular Cloning: A Laboratory Manual》 (Sambrook， J. ， Russell, David W. ， Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd edition, 2001， NY， Cold Spring Harbor)。所用引物及DNA序列均由上海Invitrogen公司合成。
實施例l、載體PCRC的構建
一、 caspase-3全基因序列的克隆
根據文獻調研，人慢性粒細胞白血病細胞株K562中caspase-3表達量遠高于 其他癌細胞。根據GeneBank中公布的caspase-3全基因序列以及它的上下游序列， 設計一對PCR引物PI和P2。以K562細胞的cDNA為模板克隆caspase-3。
PI: 5， -ACCTGTGGCTGTGTATCCG-3，；
P2: 5， -ATGCCCACAGATGCCTAAG-3，。
PCR反應體系為19uLddH20， 5ixLDMS0， 10u L 5XPrimerstar buffer (含 Mg2+)， 4 u L dNTPs (2. 5mM) ， 5wLPl (4um/uL) ， 5 n L P2 (4 u m/u L) ， 2 u L K562 cDNA (Ing/tiU ， 0. 5tiL Primerstar。
PCR反應條件為98°C、 10秒，59°C、 10秒，72°C、 l分20秒，共40個循環(huán)。
反應產物記做C1，對(]1進行1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測。結果表明，獲得了 1400bp的DNA片段，與預期結果相符。
根據CI的序列設計一對PCR引物P3和P4。以CI為模板進行PCR。
P3: 5' -AACGGATCCATGGAGAACACTGAAAACTCAG-3，；
P4: 5' - GTCGAATTCTTAGTGATAAAAATAGAGTTCTTTTG-3，。
PCR反應體系為:20uLddH20， 5uLDMS0， 10u L 5XPrimerstar buffer(含 Mg2+)， 4 u L dNTPs (2. 5mM) ， 5 u L P3 (4 y m/u L) ， 5 u L P4 (4 y m/y L) ， luLCl， 0.5 u L Primerstar。
PCR反應條件為98°C、 10秒，59°C、 10秒，72°C、 50秒，共35個循環(huán)。
反應產物記做C2，對C2進行1. 2%瓊脂糖凝膠電泳檢測。結果表明，獲得了 800bp 的DNA片段，C2即為caspase-3的全基因序列。
二、 ca印ase-3 P17亞基和P12亞基的克隆 1、 caspase-3 P17亞基的克隆
設計一對引物P5和P6，并在序列兩端分別添加限制性內切酶JZ^I和尸"I識別位點。P5中帶下劃線堿基為限制性內切酶Ztel識別位點，P6中帶下劃線堿基為 限制性內切酶尸WI識別位點。以C2為模板進行PCR。
P5: 5' - GAATCTAGAGCCACCATGTCAGGCTCTGGAATATCCCTGGACAAC-3，;
P6: 5， - CCTCTGCAGTTAGTCTGTCTCAATGCCACAGTCC-3，。
PCR反應體系為:20uLddH20， 5uLDMS0， 10 u L 5XPrimerstar buffer (含 Mg2+)， 4 u L dNTPs (2. 5mM) ， 5 u L P5 (4 u m/u L) ， 5 u L P6 (4 u m/u L) ， luLC2， 0.5 u L Primerstar。
PCR反應條件為98°C、 10秒，59°C、 10秒，72°C、 30秒，共30個循環(huán)。
所得反應產物即為P17，對其進行1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測。結果表明，獲得 了 453bp的DNA片段。將得到的DNA片段進行測序，結果表明，該基因片段含有P17 亞基基因序列，P17亞基基因序列如序列表中的序列1所示，自序列1的5'末端 第1位脫氧核苷酸到第453位脫氧核苷酸為P17亞基基因序列。
按照TIANGEN公司提供的DNA產物純化試劑盒說明書純化獲得的DNA片段，將 純化所得的產物用限制性內切酶i^al和尸"I (均購自TaKaRa)進行雙酶切，酶切 反應體系為5.4uLddH20， 20 u L (90ng/ix L) P17， 3 n L 10XM buffer, 0,8ixL Z力al， 0. 8 ix L尸WI。 37。C反應3小時后，用DNA產物純化試劑盒回收經和尸"I 酶切的P17亞基片段。
將回收產物純化、定量，記做M1， Ml濃度為50ng/yL。
2、 caspase-3 P12亞基的克隆
設計一對引物P7和P8，并在序列兩端分別添加限制性內切酶和Sa/rfH
識別位點。P7中帶下劃線堿基為限制性內切酶尸WI識別位點，P8中帶下劃線堿基
為限制性內切酶53/dn識別位點。以C2為模板進行PCR。
P7: 5' -CGTCTGCAGGCCACCATGTCAGGCAGTGGTGTTGATGATGACATGG-3，;
P8: 5， - GTCGGATCCTTAGTGATAAAAATAGAGTTCTTTTGTG-3，。
PCR反應體系為20iiLddH20， 5uLDMS0， 10 n L 5XPrimerstar buffer (含
Mg2+), 4 ii L dNTPs (2. 5mM) ， 5 n L P7 (4 u m/u L) ， 5 u L P8 (4 u m/y L) ， luLC2，
0. 5" Primerstar。
PCR反應條件為98°C、 10秒，63°C、 10秒，72°C、 25秒，共30個循環(huán)。 所得反應產物即為P12，對其進行了 1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測。結果獲得了
318bp的DNA片段。將得到的DNA片段進行測序，結果表明，該基因片段含有P12亞基基因序列，P12亞基基因序列如序列表中的序列2所示，自序列2的5'末端第l 位脫氧核苷酸到第318位脫氧核苷酸為P12亞基基因序列。
按照TIANGEN公司提供的DNA產物純化試劑盒說明書純化獲得的DNA片段，將 純化所得的產物用限制性內切酶尸^I和5a/rfil (均購自TaKaRa)進行雙酶切，酶 切反應體系為45uL (40ng/uL) P12， 5. 2 u L 10XK buffer, 0.8uL尸Wl， 0.8 u L ^s/rfH。 37。C反應3小時后，用DNA產物純化試劑盒回收經戶"I和酶切 的P12亞基片段。
將回收產物純化、定量，記做M2， M2濃度為40ng/yL。
三、 IRES序列的克隆
設計一對引物P9和PIO，并在序列兩端都添加了限制性內切酶尸WI識別位點， P9和P10中，帶下劃線的為尸WI酶切位點。以pEGFP-IRES2質粒(購自BD bioscience 公司)為模板進行PCR。
P9: 5， -CCTCTGCAGGCCCCTCTCCCTCCCCC-3 ，;
P10: 5' - GCTCTGCAGTGTGGCCATATTATCATCGTGTTTTTC-3，。
PCR反應體系為:15uLddH20， 5uLDMS0， 10 u L 5XPrimerstar buffer (含 Mg2+)， 4u L d證s(2. 5raM) ， 5 u L P9 (4u m/u L) ， 5 u L P10(4u m/u U ， 5uL質 粒(lng/uO ， 0. 5uL Primerstar。
PCR反應條件為98°C、 10秒，64°C、 10秒，72°C、 35秒，共40個循環(huán)。
所得反應產物即為IRES,對其進行了 1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測。結果獲得了 585bp的DNA片段。將得到的DNA片段進行測序，結果表明，該基因片段含有IRES 序列，IRES序列如序列表中的序列3所示，自序列3的5'末端第l位脫氧核苷酸 到第585位脫氧核苷酸為IRES序列。
按照TIANGEN公司提供的DNA產物純化試劑盒說明書純化獲得的DNA片段，將 純化所得的產物用限制性內切酶尸WI(購自TaKaRa)進行單酶切，酶切反應體系為 30uL IRES (70ng/uL) ， 4uL 10XH buffer, 4uL ddH20， 2uL尸stl。 37。C反 應3小時后，用DNA產物純化試劑盒回收經尸WI單酶切后的IRES片段。
將回收產物純化、定量，記做E1， El的濃度為70ng/uL。
四、 重組表達載體的獲得
1、第一次連接反應(連接M1和M2) 1)酶切反應以pcDNA3. 1 (-)為出發(fā)載體，用J&I和5a/dn進行雙酶切。 酶切反應體系5iiLpcDNA3.1 (-) (lyg/uL) ， 1 u L 10 XK buffer, 1 u L ifel， 1 u L Aa/dH， 0. 5 u L牛腸堿性磷酸酶(CIAP)。 37°C、 3-5h，產物記作P1并純化、定量。 2)連接反應
連接反應體系為2uLPl (70ng/uL) ， luLMl (50ng/nL)， luLM2(40ng/ uL)， 6uL ddH20。 60°C、 2分鐘，4。C保存。然后再加入6uL ddH20， 2uL 10X T4 ligase buffer, 1 P L T4 ligase (TaKaRa) ， 1 u L ATP (50mM) 。 16。C反應5 個小時。
反應結束后，用該連接產物轉化大腸桿菌JM109感受態(tài)細胞，將轉化細胞涂布 于含有50mg/ml的氨芐青霉素的LB平板上，倒置培養(yǎng)12-24小時后，挑取長出的 單菌落接種于3ml含50mg/ml氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中，在37。C搖床中過夜 培養(yǎng)。待培養(yǎng)結束后，取出其中2ml進行質粒少量提取，然后用和^ayrfn進 行初步酶切鑒定，能切出760bp條帶的為陽性克隆。將得到的陽性克隆質粒命名為 PC1。
2、第二次連接反應(連接E1)
1) 酶切反應
酶切反應體系為5uLPCl (lug/uU ， 2uL 10XH buffer, 12iiLddH20， lyL尸WI， 0. 5uL牛腸堿性磷酸酶(CIAP)。
在37"C下反應3小時后，用DNA產物純化試劑盒回收經尸"I單酶切后的PC1 質粒。將回收產物純化、定量，記做PC2， PC2的濃度為70ng/uL。
2) 連接反應
連接反應體系為2uL PC2 (70ng/uL) ， 2uL El(50ng/uL)， 6uL ddH20。 60°C、 2分鐘，4。C保存。然后再加入6uL ddH20， 2y L 10XT4 ligase buffer, 1 uL T4 ligase (TaKaRa) ， 1 y L ATP (50mM) 。 16。C反應5個小時。
反應結束后，用該連接產物轉化大腸桿菌JM109感受態(tài)細胞，將轉化細胞涂布 于含有50mg/ml的氨芐青霉素的LB平板上，倒置培養(yǎng)12-24小時后，挑取長出的 單菌落接種于3ml含50mg/ml氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中，在37。C搖床中過夜 培養(yǎng)。待培養(yǎng)結束后，取出其中2ml進行質粒少量提取，然后用歷V2dlI進行酶切 鑒定，能切出500bp左右條帶的為陽性克隆。因為El兩端都引入了尸WI的酶切位點，所以連接的時候，有正向連接和反向連接兩種可能。根據IRES序列和caspase-3 小亞基序列上的HindIII酶切位點，IRES若正向插入后，歷'"aail可以切出500bp 左右的帶。
將酶切鑒定正確的陽性重組菌的菌液接種入200ml LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)12小 時。培養(yǎng)結束后，取lml菌液送上海Invirogen公司進行測序，測序結果表明獲得 了正確的基因序列，將上述質粒命名為PCRC。
實施例2、載體PCRC的抗腫瘤生物活性檢測
1、 轉染
以5X105細胞密度在6孔板上鋪人鼻咽癌細胞CNE-2， 24小時后進行轉染，方 法為在lipotamine2000 (Invitrogen)介導下，將PCRC質粒轉染CNE-2細胞， 同時用pCDNA3. 1空質粒轉染CNE-2細胞作為對照。轉染36小時之后，收集6孔板 中的細胞，釆用RIPA蛋白裂解液提取細胞中的總蛋白。考馬斯亮藍定量法測定蛋 白的濃度。用4X上樣緩沖液按1: 3的體積混合蛋白，IO(TC沸水浴加熱10min， -20。C保存以備后續(xù)western blot實驗。
RIPA蛋白裂解液的配方為50mM Tris-base, 1. OmM EDTA， 150mMNaCl， 0.1% SDS， 1% TritonX-100， 1% Sodium deoxycholate (去氧膽酸鈉)，IraM PMSF (苯 甲基磺酰氟)(現加)。
2、 Western blot檢測PCRC質粒對聚腺苷二磷酸核糖聚合酶(poly ADP-ribose polymerase, PARP)的影響
PARP作為caspase-3的主要剪切對象，被稱為caspase-3的死亡底物，因而 PARP被剪切是caspase-3激活的一個重要標志，也是細胞凋亡的一個重要指標。
Western blot試驗中所用的一抗為抗PARP抗體(購自碧云天生物技術研究所)， 二抗為山羊抗兔抗體(購自碧云天生物技術研究所)。
Western blot實驗結果如圖1所示。圖1中，1為轉染PCRC質粒的細胞；2 為轉染空質粒的細胞。結果表明，PCRC質粒能夠表達出活性形式的caspase-3，促 進腫瘤細胞的凋亡。序列表
<110〉清華大學深圳研究生院
<120> —種可誘導癌細胞凋亡的載體及其應用
<130> CGGNARY81299
<160> 3
<210〉 1
<211〉 453
<212> DNA
<213〉 人屬人(/fo/Z7d 5V3/3imS)
<400〉 1
atgtcaggct ctggaatatc cctggacaac agttataaaa tggattatcc tgagatgggt 60
ttatgtataa taattaataa taagaatttt cataaaagca ctggaatgac atctcggtct 120
ggtacagatg tcgatgcagc aaacctcagg gaaacattca gaaacttgaa atatgaagtc 180
aggaataaaa atgatcttac acgtgaagaa attgtggaat tgatgcgtga tgtttctaaa 240
gaagatcaca gcaaaaggag cagttttgtt tgtgtgcttc tgagccatgg tgaagaagga 300
ataatttttg gaacaaatgg acctgttgac ctgaaaaaaa taacaaactt tttcagaggg 360
gatcgttgta gaagtctaac tggaaaaccc aaacttttca ttattcaggc ctgccgtggt 420
ax:aga^ctgg sctgtggcat tgaigacsggic tsai 453
<210> 2
<211〉 318
<212> DNA
〈213〉 人屬人(7%M70 5^J'e/LS)
<400> 2
11atgtcaggcagtggtgttgatga^gacatggCgtgtC3t3aaataccagtggsggccgac60
ttcttgtatgcatactccacagcacctggttattattcttggcgaaattcaaaggatggc120
tcctggttcatccagtcgctttgtgccatgctgaa^cagtatgccgacaagcttgaattt180
atgcacattcttacccgggtgtggC犯C3gaatttgagtccttttccttt240
gacgctacttttcatgcaaag犯gicagattccatgtattgtttccatgct300
ctctattttt318
〈210〉 3
〈211〉 585
<212> DNA
〈213〉人工序列
<400> 3
gcccctctccctcccccccccctaacgttactggccga^gccgcttggaat卿gccggt60
gtgcgtttgtctatatgttattttccaccatattgccgtcttttggcaatgtgagggccc120
gg腿cctggccctgtcttcttgacgagca^ttcctaggggtctttcccctctcgccaaag180
gaatgcaaggtctgttgaatgtcgtgaaggaagcagttcctctggaagcttcttgaagac240
aaacaacgtctgtagcgaccctttgcaggcagcggaaccccccacctggcgacaggtgcc300
tctgcggccaaaagccacgtgtataagatacacctgcaaaggcggcacaaccccagtgcc360
acgttgtgagttggatagttgtggaa卿gtxaaatggctctcctcaagcgtattcaaca420
3"ggggctga3ggatgcccag肌ggtaccccattgtatgggatctgatctggggcctcggt■
acacatgctttacatgtgttt^gtcgaggttaaaaaaacgtctaggccccccgaaccacg540
gggacgtggttttcctttgaaaaacacgatgataMa^tggCC3C358權利要求
1、一種轉錄融合雙基因片段K，自上游至下游依次為caspase-3P17亞基基因序列、IRES序列和caspase-3P12亞基基因序列。
2、 如權利要求1所述的基因片段K，其特征在于所述caspase-3P17亞基基因 序列是如下l)或2)或3)的DNA分子1) 其核苷酸序列是序列表中序列1所示的DNA分子；2) 在嚴格條件下與l)限定的DNA序列雜交且具有相同功能的DNA分子；3) 與序列表中序列l(wèi)限定的DNA序列具有90。/。以上同源性，且具有相同功能的 DNA分子。
3、 如權利要求1或2所述的基因片段K，其特征在于所述IRES序列是如下4) 或5)或6)的DNA分子4) 其核苷酸序列是序列表中序列3所示的DNA分子；5) 在嚴格條件下與l)限定的DNA序列雜交且具有相同功能的DNA分子；6) 與序列表中序列3限定的DNA序列具有90。/。以上同源性，且具有相同功能的 DNA分子。
4、 如權利要求3所述的基因片段K，其特征在于所述caspase-3 P12亞基基因 序列是如下7)或8)或9)的DNA分子7) 其核苷酸序列是序列表中序列2所示的DNA分子；8) 在嚴格條件下與l)限定的DNA序列雜交且具有相同功能的DNA分子；9) 與序列表中序列2限定的DNA序列具有90y。以上同源性，且具有相同功能的 DNA分子。
5、 含有權利要求1至4中任一所述基因片段K的表達盒或重組表達載體。
6、 如權利要求5所述的重組表達載體，其特征在于所述重組表達載體為真核 表達載體。
7、 如權利要求6所述的重組表達載體，其特征在于所述載體中包含有PBR322 復制起點和/或氨芐青霉素抗性基因。
8、 如權利要求7所述的重組表達載體，其特征在于所述重組表達載體是PCRC; 所述PCRC是將IRES序列插入質粒PC1的caspase-3 P17亞基基因序列和caspase-3 P12亞基基因序列間得到的；所述質粒PC1是將pcDNA3. 1 (-)的i7^1和^a/dll位點間的小片段取代為 caspase-3 P17和caspase-3 P12亞基基因序列得到的。
9、 含有權利要求1至4中任一所述基因片段K的細胞系或重組菌。
10、 權利要求1至4中任一所述基因片段K、權利要求5至8中任一所述重組表 達載體或表達盒、權利要求9所述細胞系或重組菌在制備誘導癌細胞凋亡藥物或抗癌 藥物中的應用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種可誘導癌細胞凋亡的載體及其應用。本發(fā)明通過IRES將caspase-3P17亞基基因和caspase-3P12亞基基因融合形成轉錄融合雙基因，將該轉錄融合雙基因插入真核表達載體得到的重組表達載體可以在轉染細胞中高效地表達活性形式的caspase-3，從而激活細胞凋亡信號通路，促進細胞凋亡。將本發(fā)明的重組表達載體轉入癌細胞，可以有效地誘導腫瘤細胞的凋亡，為基因治療提供新的手段。本發(fā)明的重組表達載體可以用于制備誘導癌細胞凋亡的藥物或抗癌藥物。本發(fā)明將生物醫(yī)藥領域及基因功能的研究中發(fā)揮重要作用，應用前景廣闊。
文檔編號A61K48/00GK101580845SQ20081011162
公開日2009年11月18日 申請日期2008年5月15日 優(yōu)先權日2008年5月15日
發(fā)明者劉華臣, 董愛君, 蔣宇揚, 謝振華 申請人:清華大學深圳研究生院