一種基于糖修飾的魚(yú)皮抗凍蛋白多肽及其制備方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了屬于水產(chǎn)品副產(chǎn)物加工領(lǐng)域的一種基于糖修飾的魚(yú)皮抗凍蛋白多肽，本發(fā)明主要是將魚(yú)皮打成漿，然后用膠體磨磨成魚(yú)皮漿液，離心去掉脂肪；再用超聲波處理，接著用風(fēng)味蛋白酶水解，超濾，得分子量為3000～5000道爾頓的多肽，冷凍干燥，得魚(yú)皮蛋白多肽粉；再將魚(yú)皮蛋白多肽粉與乳糖混合進(jìn)行糖基化反應(yīng)，即得魚(yú)皮抗凍蛋白多肽。本發(fā)明還公開(kāi)了魚(yú)皮抗凍蛋白多肽的制備方法。本發(fā)明魚(yú)皮抗凍蛋白多肽抗凍功能好，可以將冷凍干燥微生物的活率提高50%；其次，因采用超聲波處理，魚(yú)皮抗凍蛋白多肽得率高；此外，本發(fā)明制備方法反應(yīng)條件溫和，方法簡(jiǎn)單，設(shè)備投資少，操作場(chǎng)地小。
【專(zhuān)利說(shuō)明】一種基于糖修飾的魚(yú)皮抗凍蛋白多肽及其制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于水產(chǎn)品副產(chǎn)物加工領(lǐng)域，具體涉及一種基于糖修飾的魚(yú)皮抗凍蛋白多肽，以及該魚(yú)皮抗凍蛋白多肽的制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002]抗凍蛋白具有低溫保護(hù)功能，可作為一種高級(jí)防凍劑應(yīng)用，在醫(yī)學(xué)、化妝品、生物、食品、農(nóng)學(xué)等領(lǐng)域有廣泛的應(yīng)用價(jià)值，如抗凍蛋白可用于人體或動(dòng)物器官的超低溫保存，改善其冷凍質(zhì)量；抗凍蛋白可提高特定微生物的抗凍能力，減少食品凍藏時(shí)冰晶形成和重結(jié)晶對(duì)食品結(jié)構(gòu)的破壞，改善食品品質(zhì)。
[0003]1957年，Scholander等首次報(bào)道一些海洋魚(yú)類(lèi)存在具有抗凍活性的蛋白。1969年,Devries和Wohlschlag在南極海洋魚(yú)類(lèi)的血液中首次提取并證明了具有抗凍活性的物質(zhì)是蛋白。此后，人們相繼對(duì)極區(qū)魚(yú)類(lèi)、植物、昆蟲(chóng)、真菌和細(xì)菌中的抗凍蛋白進(jìn)行了研究。從現(xiàn)有的報(bào)道來(lái)看，關(guān)于魚(yú)類(lèi)抗凍蛋白的研究主要集中在分離純化、功能結(jié)構(gòu)特性等方面。由于動(dòng)植物自身存在的抗凍蛋白數(shù)量非常有限，采用傳統(tǒng)的分離提純方法從動(dòng)植物得到的抗凍蛋白數(shù)量十分有限，導(dǎo)致最終產(chǎn)品價(jià)格昂貴，很難實(shí)現(xiàn)規(guī)?；a(chǎn)，也很難在農(nóng)業(yè)，生物及醫(yī)藥工業(yè)等領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用。
[0004]抗凍蛋白的抗凍活性片段主要存在于局部的特異多肽鏈結(jié)構(gòu)域，并不是整體蛋白質(zhì)在起作用(Evans, R.P.等.Biochimicaet Biophysica Acta(BBA)-Proteinsand Proteomics, 2004 .1700 (2), 209-217.Fletcher, G.L.等.Annual Reviewof Physiology,2001.63,359-390.Low, ff.K.等.Journal of Biological Chemistry, 2001.276(15), 11582-11589.Wang, S.Y.等.Applied Mechanics andMaterials, 2012.140，411-415)。國(guó)內(nèi)已有從小麥、沙冬青、牛皮、豬皮、昆蟲(chóng)中提取制備抗凍蛋白的相關(guān)專(zhuān)利申請(qǐng)(如 CN200610166427.4，CN201010277569.4，CN200810072986.8，CN201110091198.5，CN201010292036.3)，其中專(zhuān)利申請(qǐng)《一種魚(yú)源抗凍多肽及其制備方法》(申請(qǐng)?zhí)枮?201310441149.9)公開(kāi)了以魚(yú)皮膠原蛋白為原料，通過(guò)木瓜蛋白酶酶解，再經(jīng)過(guò)分離純化得到純化的特異性抗凍多肽。國(guó)外方面，歐洲專(zhuān)利EP9301969W公開(kāi)了一種獲得抗凍蛋白基因的方法，并利用其在酵母中的表達(dá)生產(chǎn)抗凍蛋白多肽，而含有抗凍多肽的酵母可以用在冷凍面團(tuán)等的生產(chǎn)中。日本專(zhuān)利JP2003142850公開(kāi)了一些魚(yú)類(lèi)血中的抗凍蛋白以及它們的氨基酸序列和堿基序列。
[0005]經(jīng)檢索，沒(méi)有發(fā)現(xiàn)利用以魚(yú)皮為原料，通過(guò)酶解制備蛋白多肽，再與糖經(jīng)過(guò)糖基化反應(yīng)制備具有抗凍功能的魚(yú)皮蛋白多肽的報(bào)道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明的目的在于提供一種基于糖修飾的魚(yú)皮抗凍蛋白多肽。該魚(yú)皮抗凍蛋白多肽具有較好的微生物低溫保護(hù)作用。
[0007]本發(fā)明另一目的在于提供上述魚(yú)皮抗凍蛋白多肽的制備方法。[0008]本發(fā)明第三目的在于提供上述魚(yú)皮抗凍蛋白多肽在微生物抗凍保護(hù)上的用途。
[0009]實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的技術(shù)方案如下:
[0010]本發(fā)明一種基于糖修飾的魚(yú)皮抗凍蛋白多肽，按照如下方法制備:
[0011](I)、將冷凍魚(yú)皮在10~12°C下進(jìn)行解凍，然后用水將魚(yú)皮清洗干凈，再將魚(yú)皮打成漿，得魚(yú)皮漿；接著向魚(yú)皮漿中加入2.0~5.0倍魚(yú)皮漿重量的水，然后利用膠體磨將魚(yú)皮漿磨成魚(yú)皮漿液，再在3000~5000g條件下離心5~8分鐘，去上層脂肪，得去脂魚(yú)皮漿液；
[0012](2)、將去脂魚(yú)皮漿液用超聲波處理5~10分鐘；然后按照0.4~0.7%魚(yú)皮重量的重量百分比比例向經(jīng)過(guò)超聲波處理的魚(yú)皮漿液體中加入風(fēng)味蛋白酶，在40~50°C、pH6.5~7.5條件下進(jìn)行酶解反應(yīng)1.5~2.5小時(shí)；再在85~90°C下保溫3~5分鐘，冷卻至室溫；在3000~5000g條件下離心3~6分鐘，收集上清液；
[0013](3)、將步驟(2)所得的上清液通過(guò)二步超濾方法進(jìn)行處理，先用孔徑為5000道爾頓的陶瓷膜超濾，取濾過(guò)液，得分子量小于5000的多肽，再將濾過(guò)液用孔徑為3000道爾頓的陶瓷膜超濾，截留分子量為3000~5000道爾頓的多肽，冷凍干燥，得魚(yú)皮蛋白多肽粉；
[0014](4)、按照魚(yú)皮蛋白多肽粉和乳糖之間質(zhì)量比為3.5~5:1的比例將魚(yú)皮蛋白多肽粉和乳糖混合，然后溶解于去離子水中，輕輕攪拌5~10分鐘，溶液最終濃度為12~15%(w/w);冷凍干燥，得魚(yú)皮蛋白多肽-乳糖凍干粉；
[0015](5)、將所得的魚(yú)皮蛋白多肽-乳糖凍干粉在50~60°C、相對(duì)濕度為76~79%條件下反應(yīng)15~20小時(shí)，得基于糖修飾的魚(yú)皮抗凍蛋白多肽。
[0016]上述魚(yú)皮抗凍蛋白多肽步驟(1)中所述的魚(yú)皮來(lái)自于河豚魚(yú)、鱈魚(yú)、馬面魚(yú)或鰈魚(yú)
坐寸ο
[0017]上述魚(yú)皮抗凍蛋白多肽步驟(1)中所述的魚(yú)皮解凍的時(shí)間為5~10小時(shí)。
[0018]上述魚(yú)皮抗凍蛋白多肽步驟(1)中所述的清洗魚(yú)皮的水的溫度為10~12°C。
[0019]上述魚(yú)皮抗凍蛋白多肽步驟(2)中所述的超聲波的頻率為25-30kH。
[0020]上述魚(yú)皮抗凍蛋白多肽步驟(2)中所述的pH用lmol/L的NaOH或HCl調(diào)節(jié)。
[0021]上述基于糖修飾的魚(yú)皮抗凍蛋白多肽的制備方法，包括如下步驟:
[0022](I)、將冷凍魚(yú)皮在10~12°C下進(jìn)行解凍，然后用水將魚(yú)皮清洗干凈，再將魚(yú)皮打成漿，得魚(yú)皮漿；接著向魚(yú)皮漿中加入2.0~5.0倍魚(yú)皮漿重量的水，然后利用膠體磨將魚(yú)皮漿磨成魚(yú)皮漿液，再在3000~5000g條件下離心5~8分鐘，去上層脂肪，得去脂魚(yú)皮漿液；
[0023](2)、將去脂魚(yú)皮漿液用超聲波處理5~10分鐘；然后按照0.4~0.7%魚(yú)皮重量的重量百分比比例向經(jīng)過(guò)超聲波處理的魚(yú)皮漿液體中加入風(fēng)味蛋白酶，在40~50°C、pH6.5~7.5條件下進(jìn)行酶解反應(yīng)1.5~2.5小時(shí)；再在85~90°C下保溫3~5分鐘，冷卻至室溫；在3000~5000g條件下離心3~6分鐘，收集上清液；
[0024](3)、將步驟(2)所得的上清液通過(guò)二步超濾方法進(jìn)行處理，先用孔徑為5000道爾頓的陶瓷膜超濾，取濾過(guò)液，得分子量小于5000的多肽，再將濾過(guò)液用孔徑為3000道爾頓的陶瓷膜超濾，截留分子量為3000~5000道爾頓的多肽，冷凍干燥，得魚(yú)皮蛋白多肽粉；
[0025](4)、按照魚(yú)皮蛋白多肽粉和乳糖之間質(zhì)量比為3.5~5:1的比例將魚(yú)皮蛋白多肽粉和乳糖混合，然后溶解于去離子水中，輕輕攪拌5~10分鐘，溶液最終濃度為12~15%(w/w);冷凍干燥，得魚(yú)皮蛋白多肽-乳糖凍干粉；
[0026](5)、將所得的魚(yú)皮蛋白多肽-乳糖凍干粉在50~60°C、相對(duì)濕度為76~79%條件下反應(yīng)15~20小時(shí)，得基于糖修飾的魚(yú)皮抗凍蛋白多肽。
[0027]上述制備方法步驟(1)中所述的魚(yú)皮來(lái)自于河豚魚(yú)、鱈魚(yú)、馬面魚(yú)或鰈魚(yú)等。
[0028]上述制備方法步驟(1)中所述的魚(yú)皮解凍的時(shí)間為5~10小時(shí)。
[0029]上述制備方法步驟(1)中所述的清洗魚(yú)皮的水的溫度為10~12°C。
[0030]上述制備方法步驟(2)中所述的超聲波的頻率為25~30kH。
[0031]上述制備方法步驟(2)中所述pH用lmol/L的NaOH或HCl調(diào)節(jié)。
[0032]上述魚(yú)皮抗凍蛋白多肽在微生物抗凍保護(hù)上的應(yīng)用。
[0033]本發(fā)明具有的優(yōu)點(diǎn)和有益效果:(I)、本發(fā)明魚(yú)皮抗凍蛋白多肽抗凍功能好，可以將冷凍干燥微生物的活率提高50%。(2)、本發(fā)明采用超聲波技術(shù)處理魚(yú)皮漿，魚(yú)皮抗凍蛋白多肽的得率高。(3)、本發(fā)明制備方法反應(yīng)條件溫和，反應(yīng)溫度較低，反應(yīng)時(shí)間較短，制備過(guò)程中不會(huì)產(chǎn)生任何對(duì)身體不利的物質(zhì)，安全性好。(4)、本發(fā)明方法操作工藝簡(jiǎn)單，設(shè)備投資少，操作場(chǎng)地小，適用于工業(yè)化生產(chǎn)。(5)、本發(fā)明魚(yú)皮抗凍蛋白多肽，能廣泛應(yīng)用于微生物的冷凍保護(hù)作用、改善冰淇淋的組織結(jié)構(gòu)。
【具體實(shí)施方式】
[0034]實(shí)施例1本發(fā)明基于糖修飾的鱈魚(yú)魚(yú)皮抗凍蛋白多肽的制備
[0035]按照如下方法進(jìn)行:
[0036](I)、將冷凍鱈魚(yú)魚(yú)皮50克在10°C下進(jìn)行解凍5小時(shí)，然后用溫度為10°C的水將魚(yú)皮清洗干凈，再用打漿機(jī)將魚(yú)皮打成漿，得魚(yú)皮漿；接著向魚(yú)皮漿中加入4.0倍魚(yú)皮漿重量的水200克，然后利用膠體磨將魚(yú)皮漿磨成魚(yú)皮漿液，再在3000g條件下離心8min，去掉上層脂肪，得去脂魚(yú)皮漿液235克。
[0037](2)、將去脂魚(yú)皮漿液于超聲波發(fā)生器中，用頻率為30kH的超聲波處理5分鐘；然后按照0.7%魚(yú)皮重量的重量百分比比例向經(jīng)過(guò)超聲波處理的魚(yú)皮漿液體中加入風(fēng)味蛋白酶(購(gòu)自Novozymes,以下同)0.35克，在50°C、pH為7.5 (用lmol/L的NaOH或HCl來(lái)調(diào)節(jié))條件下進(jìn)行酶解1.5h ;然后在90°C下保溫3分鐘，冷卻至室溫；在4000g條件下離心5min,收集上清液，得上清液208克；
[0038](3)、將步驟(2)所得的上清液208克通過(guò)二步超濾方法進(jìn)行處理，先用孔徑為5000道爾頓的陶瓷膜超濾，取濾過(guò)液，留取分子量小于5000的蛋白多肽，再將濾過(guò)液用孔徑為3000道爾頓的陶瓷膜超濾，截留分子量為3000-5000道爾頓的多肽，得蛋白液95克；冷凍干燥，得魚(yú)皮蛋白多肽粉3.1克。
[0039](4)、將魚(yú)皮蛋白多肽粉3.1克和乳糖0.8克混合均勻，然后溶解于去離子水中，輕輕攪拌10分鐘，溶液最終濃度為12% (w/w);冷凍干燥，得魚(yú)皮蛋白多肽-乳糖凍干粉3.9克；
[0040](5)、將所得的魚(yú)皮蛋白多肽-乳糖凍干粉在溫度為50°C、相對(duì)濕度為79%條件下反應(yīng)20小時(shí)，得基于糖修飾的魚(yú)皮抗凍蛋白多肽3.7克。
[0041]實(shí)施例2本發(fā)明基于糖修飾的河豚魚(yú)魚(yú)皮抗凍蛋白多肽的制備
[0042]按照如下方法進(jìn)行:[0043](I)、將冷凍河豚魚(yú)魚(yú)皮100克在10°C下進(jìn)行解凍8小時(shí)，然后用溫度為10°C的水將魚(yú)皮清洗干凈，再用打漿機(jī)將魚(yú)皮打成漿，得魚(yú)皮漿；接著向魚(yú)皮漿中加入3.0倍魚(yú)皮漿重量的水300克，然后利用膠體磨將魚(yú)皮漿磨成魚(yú)皮漿液，再在4000g條件下離心5min，去掉上層脂肪，得去脂魚(yú)皮漿液370克。
[0044](2)、將去脂魚(yú)皮漿液于超聲波發(fā)生器中，用頻率為25kH的超聲波處理10分鐘；然后按照0.5%魚(yú)皮重量的重量百分比比例向經(jīng)過(guò)超聲波處理的魚(yú)皮漿液體中加入風(fēng)味蛋白酶0.5克，在45°C、pH為7.0 (用lmol/L的NaOH或HCl來(lái)調(diào)節(jié))條件下進(jìn)行酶解2.0h ;然后在88°C下保溫4分鐘，冷卻至室溫；在5000g條件下離心3min，收集上清液，得上清液320克。
[0045](3)、將步驟(2)所得的上清液320克通過(guò)二步超濾方法進(jìn)行處理，利用孔徑為5000道爾頓的陶瓷膜超濾，取濾過(guò)液，得分子量小于5000道爾頓的蛋白多肽，再用孔徑為3000道爾頓的陶瓷膜超濾，截留分子量為3000-5000道爾頓的多肽，得蛋白液155克；冷凍干燥，得魚(yú)皮蛋白多肽粉6.3克。
[0046](4)、將魚(yú)皮蛋白多肽粉6.3克和乳糖1.5克混合均勻，然后溶解于去離子水中，輕輕攪拌10分鐘，溶液最終濃度為13% (w/w);冷凍干燥，得魚(yú)皮蛋白多肽-乳糖凍干粉7.8克；
[0047](5)、將所得的魚(yú)皮蛋白多肽-乳糖凍干粉在溫度為55°C、相對(duì)濕度為79%條件下反應(yīng)18小時(shí)，得基于糖修飾的魚(yú)皮抗凍蛋白多肽7.6克。
[0048]實(shí)施例3 基于糖修飾的鱈魚(yú)魚(yú)皮抗凍蛋白多肽的制備
[0049]按照如下方法進(jìn)行:
[0050](I)、將冷凍鱈魚(yú)魚(yú)皮200克在10°C進(jìn)行解凍10小時(shí)，然后用溫度為10°C的水將魚(yú)皮清洗干凈，再用打漿機(jī)將魚(yú)皮打成漿，得魚(yú)皮漿；接著向魚(yú)皮漿中加入2.0倍魚(yú)皮漿重量的水400克，然后利用膠體磨將魚(yú)皮漿磨成魚(yú)皮漿液，再在4000g條件下離心8min，去掉上層脂肪，得去脂魚(yú)皮漿液562克。
[0051](2)、將步驟(1)所得的去脂魚(yú)皮漿液于超聲波發(fā)生器中，用頻率為25kH的超聲波處理8分鐘；按照魚(yú)皮重量0.4%的重量百分比比例向經(jīng)過(guò)超聲波處理的魚(yú)皮漿液體中加入風(fēng)味蛋白酶0.8克，在50°C、pH為6.5 (用lmol/L的NaOH或HCl來(lái)調(diào)節(jié))條件下進(jìn)行酶解
2.5h ;然后在90°C下保溫3分鐘，冷卻至室溫，在4000g條件下離心5min，收集上清液，得上清液478克。
[0052](3)、將步驟(2)所得的上清液478克通過(guò)二步超濾方法進(jìn)行處理，先用孔徑為5000道爾頓的陶瓷膜超濾，取濾過(guò)液，得分子量小于5000的蛋白多肽，再將濾過(guò)液用孔徑為3000道爾頓的陶瓷膜超濾，截取分子量為3000-5000道爾頓的多肽，得蛋白液375克，冷凍干燥，得魚(yú)皮蛋白多肽粉12.5克。
[0053](4)、將魚(yú)皮蛋白多肽粉12.5克和乳糖3.0克混合均勻，然后溶解于去離子水中，輕輕攪拌10分鐘，溶液最終濃度為15% (w/w);冷凍干燥，得魚(yú)皮蛋白多肽-乳糖凍干粉15.5 克;
[0054](5)、將魚(yú)皮蛋白多肽-乳糖凍干粉在溫度為60°C、相對(duì)濕度為76%條件下反應(yīng)18小時(shí)，得基于糖修飾的的魚(yú)皮抗凍蛋白多肽15.3克。
[0055]實(shí)施例4本發(fā)明基于糖修飾的魚(yú)皮抗凍蛋白多肽對(duì)微生物抗凍保護(hù)對(duì)比試驗(yàn)[0056]按照如下方法進(jìn)行:
[0057]試驗(yàn)處理:A.空白對(duì)照(不加任何保護(hù)劑)B.乳糖；C.未進(jìn)行糖基化反應(yīng)的魚(yú)皮蛋白多肽；D.實(shí)施例1制備的魚(yú)皮抗凍蛋白多肽；E.實(shí)施例2制備的魚(yú)皮抗凍蛋白多肽；F.實(shí)施例3制備的魚(yú)皮抗凍蛋白多肽。
[0058]試驗(yàn)方法:將離心濃縮后的乳酸菌菌體(保加利亞乳桿菌(中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)提供，編號(hào):S_5)和嗜熱鏈球菌(中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)提供，編號(hào):5Y)分別添加不同凍干保護(hù)劑(見(jiàn)試驗(yàn)處理B~F)后(菌體與凍干保護(hù)劑的比例為4:1 (ν/ν)，置于_40°C的凍干機(jī)中，待菌液凍結(jié)后，于0.01mbar的真空度下冷凍干燥48小時(shí)，然后在適當(dāng)條件下復(fù)水，測(cè)定菌體存活率。
[0059]
【權(quán)利要求】
1.一種基于糖修飾的魚(yú)皮抗凍蛋白多肽，其特征在于按照如下方法制備: (1)、將冷凍魚(yú)皮在10~12°C下進(jìn)行解凍，然后用水將魚(yú)皮清洗干凈，再將魚(yú)皮打成漿，得魚(yú)皮漿；接著向魚(yú)皮漿中加入2.0~5.0倍魚(yú)皮漿重量的水，然后利用膠體磨將魚(yú)皮漿磨成魚(yú)皮漿液，再在3000~5000g條件下離心5~8分鐘，去上層脂肪，得去脂魚(yú)皮漿液； (2)、將去脂魚(yú)皮漿液用超聲波處理5~10分鐘；然后按照0.4~0.7%魚(yú)皮重量的重量百分比比例向經(jīng)過(guò)超聲波處理的魚(yú)皮漿液體中加入風(fēng)味蛋白酶，在40~50°C、pH6.5~.7.5條件下進(jìn)行酶解反應(yīng)1.5~2.5小時(shí)；再在85~90°C下保溫3~5分鐘，冷卻至室溫；在3000~5000g條件下離心3~6分鐘，收集上清液； (3)、將步驟(2)所得的上清液通過(guò)二步超濾方法進(jìn)行處理，先用孔徑為5000道爾頓的陶瓷膜超濾，取濾過(guò)液，得分子量小于5000的多肽，再將濾過(guò)液用孔徑為3000道爾頓的陶瓷膜超濾，截留分子量為3000~5000道爾頓的多肽，冷凍干燥，得魚(yú)皮蛋白多肽粉； (4)、按照魚(yú)皮蛋白多肽粉和乳糖之間質(zhì)量比為3.5~5:1的比例將魚(yú)皮蛋白多肽粉和乳糖混合，然后溶解于去離子水中，輕輕攪拌5~10分鐘,溶液最終濃度為12~15% (w/w);冷凍干燥，得魚(yú)皮蛋白多肽-乳糖凍干粉； (5)、將所得的魚(yú)皮蛋白多肽-乳糖凍干粉在50~60°C、相對(duì)濕度為76~79%條件下反應(yīng)15~20小時(shí)，得基于糖修飾的魚(yú)皮抗凍蛋白多肽。
2.按照權(quán)利要求1所述的魚(yú)皮抗凍蛋白多肽，其特征在于其步驟(1)中所述的魚(yú)皮來(lái)自于河豚魚(yú)、鱈魚(yú)、馬面魚(yú)或鰈魚(yú)。
3.按照權(quán)利要求1所述的魚(yú)皮抗凍蛋白多肽，其特征在于其步驟(1)中所述的魚(yú)皮解凍的時(shí)間為5~10小時(shí)；所述的清洗魚(yú)皮的水的溫度為10~12°C。
4.按照權(quán)利要求1所述的魚(yú)皮抗凍蛋白多肽，其特征在于其步驟(2)中所述的超聲波的頻率為25-30kH。
5.權(quán)利要求1所述的基于糖修飾的魚(yú)皮抗凍蛋白多肽的制備方法，其特征在于包括如下步驟: (1)、將冷凍魚(yú)皮在10~12°C下進(jìn)行解凍，然后用水將魚(yú)皮清洗干凈，再將魚(yú)皮打成漿，得魚(yú)皮漿；接著向魚(yú)皮漿中加入2.0~5.0倍魚(yú)皮漿重量的水，然后利用膠體磨將魚(yú)皮漿磨成魚(yú)皮漿液，再在3000~5000g條件下離心5~8分鐘，去上層脂肪，得去脂魚(yú)皮漿液； (2)、將去脂魚(yú)皮漿液用超聲波處理5~10分鐘；然后按照0.4~0.7%魚(yú)皮重量的重量百分比比例向經(jīng)過(guò)超聲波處理的魚(yú)皮漿液體中加入風(fēng)味蛋白酶，在40~50°C、pH6.5~.7.5條件下進(jìn)行酶解反應(yīng)1.5~2.5小時(shí)；再在85~90°C下保溫3~5分鐘，冷卻至室溫；在3000~5000g條件下離心3~6分鐘，收集上清液； (3)、將步驟(2)所得的上清液通過(guò)二步超濾方法進(jìn)行處理，先用孔徑為5000道爾頓的陶瓷膜超濾，取濾過(guò)液，得分子量小于5000的多肽，再將濾過(guò)液用孔徑為3000道爾頓的陶瓷膜超濾，截留分子量為3000~5000道爾頓的多肽，冷凍干燥，得魚(yú)皮蛋白多肽粉； (4)、按照魚(yú)皮蛋白多肽粉和乳糖之間質(zhì)量比為3.5~5:1的比例將魚(yú)皮蛋白多肽粉和乳糖混合，然后溶解于去離子水中，輕輕攪拌5~10分鐘,溶液最終濃度為12~15% (w/w);冷凍干燥，得魚(yú)皮蛋白多肽-乳糖凍干粉；(5)、將所得的魚(yú)皮蛋白多肽-乳糖凍干粉在50~60°C、相對(duì)濕度為76~79%條件下反應(yīng)15~20小時(shí)，得基于糖修飾的魚(yú)皮抗凍蛋白多肽。
6.按照權(quán)利要求5所述的制備方法，其特征在于其步驟(1)中所述的魚(yú)皮來(lái)自于河豚魚(yú)、鱈魚(yú)、馬面魚(yú)或鰈魚(yú)。
7.按照權(quán)利要求5所述的制備方法，其特征在于其步驟(1)中所述的魚(yú)皮解凍的時(shí)間為5~10小時(shí)；所述的清洗魚(yú)皮的水的溫度為10~12°C。
8.按照權(quán)利要求5所述的制備方法，其特征在于其步驟(2)中所述的超聲波的頻率為25 ~30kH。
9.權(quán)利要求1~4任一所 述的魚(yú)皮抗凍蛋白多肽在微生物抗凍保護(hù)上的應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】C12P21/06GK103805668SQ201410077871
【公開(kāi)日】2014年5月21日 申請(qǐng)日期:2014年3月5日 優(yōu)先權(quán)日:2014年3月5日
【發(fā)明者】劉鵬, 徐萍 申請(qǐng)人:山東瀚龍生物科技有限公司