篩選乳腺炎抗性奶牛的引物、試劑盒及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一對(duì)篩選乳腺炎抗性奶牛的引物：上游引物的序列如SEQ?ID?NO.7所示，下游引物的序列如SEQ?ID?NO.8所示。本發(fā)明還公開了一種篩選乳腺炎抗性奶牛的試劑盒，包括上述引物，以及PCR擴(kuò)增所需常規(guī)試劑。本發(fā)明的引物和試劑盒可以用于篩選乳腺炎抗性奶牛，應(yīng)用方法為：提取待檢測(cè)奶牛的基因組DNA，利用上述引物進(jìn)行特異性PCR擴(kuò)增，對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)，以判斷基因型；雜合型具有較強(qiáng)的乳腺炎抗性，因此，選擇基因型為雜合型的奶牛個(gè)體用于奶牛遺傳分子育種。本發(fā)明的方法提高了奶牛乳腺炎抗性個(gè)體選擇的準(zhǔn)確性，節(jié)省了奶牛乳腺炎抗性遺傳改良時(shí)間，具有良好的應(yīng)用前景。
【專利說明】篩選乳腺炎抗性奶牛的引物、試劑盒及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及篩選乳腺炎抗性奶牛的引物、試劑盒，以及在奶牛乳腺炎抗性育種中的應(yīng)用，屬于動(dòng)物遺傳育種【技術(shù)領(lǐng)域】。
【背景技術(shù)】
[0002]奶牛乳腺炎是奶牛飼養(yǎng)中最常見和復(fù)雜的疾病之一，給奶牛業(yè)造成了巨大的損失(Seegers等，2003)。乳腺炎抗性候選基因的選擇作為一種長期的防治與預(yù)防手段可以降低奶牛生產(chǎn)中抗生素的使用，改善牛奶的品質(zhì)和安全，減少經(jīng)濟(jì)損失。
[0003]CD46蛋白(膜輔助蛋白)屬于補(bǔ)體調(diào)節(jié)蛋白家族，錨定于幾乎所有有核細(xì)胞上的跨膜糖蛋白，它可以調(diào)節(jié)補(bǔ)體因子的活性，阻止正常細(xì)胞遭受補(bǔ)體調(diào)節(jié)的損傷(Barilla-LaBarca等,2002 ;Hawkins等,2010)。據(jù)報(bào)道,引起奶牛乳腺炎發(fā)生的主要原因是環(huán)境中的病原菌，如金黃色葡萄球菌、鏈球菌、大腸桿菌等。而CD46蛋白作為細(xì)胞表面受體可以通過結(jié)合鏈球菌誘導(dǎo)細(xì)胞自噬，從而控制機(jī)體感染，增強(qiáng)宿主的抗病力(Cattaneo等，2004 Joubert等，2009)，所以⑶46可能在鏈球菌感染奶牛乳腺炎方面發(fā)揮了重要作用。而作為候選基因轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)的重要機(jī)制，選擇性剪切在細(xì)胞發(fā)育和分化、生理功能和狀態(tài)發(fā)揮了重要的作用。外顯子剪切增強(qiáng)子(ESE)作為基因選擇性剪切重要的調(diào)控元件，在其內(nèi)部的單核苷酸多態(tài)性(SNP)可以導(dǎo)致基因的異常剪切。許多研究報(bào)道了基因異常剪切和機(jī)體免疫疾病的關(guān)系。
[0004]通過分子生物學(xué)手段對(duì)奶牛乳腺炎抗性候選基因的SNP進(jìn)行功能性驗(yàn)證并對(duì)其進(jìn)行分子標(biāo)記選擇，用于奶牛遺傳育種，可改善奶?？谷橄傺啄芰Γ档退幬锏氖褂昧?，提高牛奶質(zhì)量，減少經(jīng)濟(jì)損失。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]針對(duì)上述現(xiàn)有技術(shù)，為解決現(xiàn)有驗(yàn)證功能性SNP技術(shù)的不足，本發(fā)明提供了一種鑒定奶牛乳腺炎抗性候選基因SNP可導(dǎo)致基因異常可變剪切體產(chǎn)生的方法及其專用引物與試劑盒。
[0006]本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的:
[0007]一對(duì)篩選乳腺炎抗性奶牛的引物，包括上游引物和下游引物，上游引物的序列如SEQ ID N0.7所示，下游引物的序列如SEQ ID N0.8所示。
[0008]上述引物可以用于制備篩選乳腺炎抗性奶牛的試劑盒，以用于篩選乳腺炎抗性奶牛。
[0009]一種篩選乳腺炎抗性奶牛的試劑盒，包括一對(duì)進(jìn)行分型鑒定的引物，包括上游引物和下游引物，上游引物的序列如SEQ ID N0.7所示，下游引物的序列如SEQ ID N0.8所示(對(duì)應(yīng)擴(kuò)增片段的序列如SEQ ID N0.9所示)，以及PCR擴(kuò)增所需常規(guī)試劑。
[0010]進(jìn)一步地，所述篩選乳腺炎抗性奶牛的試劑盒，是由以下組分組成的:上游引物100 μ mol/L ;下游引物 100 μ mol/L ；2 X Taq PCR MasterMix ；FastDigest 酶切緩沖液;FastDigest 限制性內(nèi)切酶 EcoRI ；ddH20 ；DNA Marker。
[0011]所述篩選乳腺炎抗性奶牛的試劑盒可以用于篩選乳腺炎抗性奶牛(檢測(cè)奶牛的基因型，再進(jìn)行關(guān)聯(lián)性分析)，以輔助奶牛遺傳分子育種。應(yīng)用方法為:提取待檢測(cè)奶牛的基因組DNA，利用SEQ ID N0.7和SEQ ID N0.8所示的引物進(jìn)行特異性PCR擴(kuò)增，對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)(通過EcoRI酶切后經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)):若得到片段大小為200bp和29bp的兩條帶，則該待檢測(cè)奶牛的基因型為野生型(CC);若得到片段大小為229bp、200bp和29bp的三條帶，則該待檢測(cè)奶牛的基因型為雜合型(CT);若得到片段大小為229bp的一條帶，則該待檢測(cè)奶牛的基因型為突變型(TT);雜合型(CT)具有較低SCS，具有較強(qiáng)的乳腺炎抗性，選擇基因型為雜合型(CT)的奶牛個(gè)體用于奶牛遺傳分子育種。
[0012]本發(fā)明所檢測(cè)的SNP位點(diǎn)為奶牛⑶46基因第32457位堿基，該處存在C>T的突變(在SEQ ID N0.9的序列上，該突變位點(diǎn)相當(dāng)于第29個(gè)堿基)。本發(fā)明通過設(shè)計(jì)特異性引物對(duì)CD46基因mRNA進(jìn)行擴(kuò)增，測(cè)序發(fā)現(xiàn)奶牛乳腺炎抗性候選基因CD46存在一個(gè)異?？勺兗羟畜w，通過將含不同基因型的DNA序列連入pSPL3外顯子捕獲載體，轉(zhuǎn)染人腎上皮細(xì)胞，提取其mRNA后，通過RT-PCR方法驗(yàn)證SNP對(duì)基因異常剪切的影響，再對(duì)奶牛群體基因型和體細(xì)胞評(píng)分(SCS)進(jìn)行關(guān)聯(lián)性分析，選擇具有乳腺炎抗性的基因型個(gè)體進(jìn)行遺傳育種。其具體步驟如下:
[0013](I)奶牛⑶46基因異?？勺兗羟畜w的鑒定
[0014]利用Primer Premier5引物設(shè)計(jì)軟件，設(shè)計(jì)CD46F和CD46R引物(如SEQ ID N0.1和SEQ ID N0.2所示)擴(kuò)增⑶46基因mRNA序列，電泳結(jié)果顯示除了主轉(zhuǎn)錄本條帶外，還有一條較大片段的條帶，將此條帶膠回收后連入PEASY-T3載體，挑取單克隆測(cè)序，利用DNAMAN比對(duì)軟件將其序列和GenBank公布的轉(zhuǎn)錄本序列(NM_001242561.1)比對(duì)，發(fā)現(xiàn)其為一個(gè)新的轉(zhuǎn)錄本，命名為⑶46-SV ，其保留了⑶46基因內(nèi)含子8中48bp的序列。
[0015](2)導(dǎo)致異?？勺兗羟畜w⑶46-SV產(chǎn)生的功能性SNP鑒定
[0016]以奶牛DNA為模板，設(shè)計(jì)引物IF和IR (如SEQ ID N0.3和SEQ ID N0.4所示)擴(kuò)增⑶46發(fā)生剪切位置附近的DNA序列區(qū)域，通過DNA直接測(cè)序的方法，發(fā)現(xiàn)在GenBank公布的 NC_007314.4 (73736730-73780793)序列中第 32457 位存在一個(gè) SNP (C>T)，利用ESEfinder3.0在線軟件預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)突變后消除了 SRSF2 (SC35)和SRSF5 (SRp40)兩種SR剪切蛋白的結(jié)合位點(diǎn)。
[0017]為驗(yàn)證所發(fā)現(xiàn)的SNP是否可以導(dǎo)致⑶46-SV異常剪切體的產(chǎn)生，引入pSPL3外顯子捕獲載體，其具有驗(yàn)證未知序列是否為潛在外顯子序列的功能，設(shè)計(jì)帶EcoRI和XhoI酶切位點(diǎn)的引物，上游引物2F的序列如SEQ ID N0.5所示，下游引物2R的序列如SEQ ID N0.6所示，將含不同基因型的48bp序列及其上下游部分DNA序列連入pSPL3外顯子捕獲載體，然后轉(zhuǎn)染人腎上皮細(xì)胞，培養(yǎng)細(xì)胞24小時(shí)后，收集細(xì)胞，提取相應(yīng)的mRNA，進(jìn)行RT-PCR，電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物，結(jié)果發(fā)現(xiàn)CC基因型載體除了產(chǎn)生主轉(zhuǎn)錄本之外，還有一條較大的帶，這正好和可變剪切體CD46-SV結(jié)果一致，而TT基因型載體沒有這條較大的條帶。
[0018]基于上述研究，本發(fā)明利用酶切分型的方法對(duì)奶牛群體SNP進(jìn)行基因分型，然后將奶牛群體基因型和體細(xì)胞評(píng)分SCS進(jìn)行關(guān)聯(lián)性分析，獲得CD46基因抗性有利的基因型，通過選擇具有乳腺炎抗性的基因型個(gè)體留種。
[0019]本發(fā)明通過生物學(xué)相關(guān)技術(shù)鑒定了奶牛乳腺炎抗性候選基因CD46存在一個(gè)異常的可變剪切體及導(dǎo)致異常剪切體的功能性SNP，同時(shí)提供了一個(gè)鑒定奶牛CD46基因功能性SNP的引物和試劑盒，可快速篩選奶牛乳腺炎抗性基因CD46第32457位堿基位點(diǎn)，降低了檢測(cè)成本，提高了奶牛乳腺炎抗性個(gè)體選擇的準(zhǔn)確性，節(jié)省了奶牛乳腺炎抗性遺傳改良時(shí)間，降低奶牛群體乳腺炎的發(fā)病率，減少奶牛業(yè)的經(jīng)濟(jì)損失。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0020]圖1:CD46基因mRNA RT-PCR擴(kuò)增電泳圖。
[0021]圖2:⑶46-SV剪切體結(jié)構(gòu)及第32457位堿基功能性預(yù)測(cè)示意圖，其中，A:剪切體結(jié)構(gòu)不意圖；B:第32457位喊基功能性預(yù)測(cè)意圖。
[0022]圖3:pSPL3外顯子捕獲載體構(gòu)建及細(xì)胞轉(zhuǎn)染后RT-PCR電泳示意圖，其中，A:構(gòu)建示意圖；B:電泳示意圖。
[0023]圖4:第32457位堿基位點(diǎn)經(jīng)EcoRI酶切分型電泳圖。
【具體實(shí)施方式】
[0024]下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的說明。
[0025]實(shí)施例1奶牛乳腺炎抗性基因CD46功能性SNP導(dǎo)致基因異?？勺兗羟畜w產(chǎn)生的的鑒定方法
[0026]1.1⑶46基因可變剪切體的鑒定
[0027]根據(jù)GenBank 登錄號(hào) ΝΜ_001242561.I 序列，利用 Primer Premier5 引物軟件，設(shè)計(jì)特異性引物CD46F和CD46R `(如SEQ ID N0.1和SEQ ID N0.2所示)擴(kuò)增CD46基因mRNA序列，PCR擴(kuò)增條件為:94°C變性4分鐘；94°C變性30s, 52°C~65°C退火30s, 72°C延伸
1.4min,此步進(jìn)行35個(gè)循環(huán)；72°C延伸5min。PCR產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)發(fā)現(xiàn)隨著52°C~65°C間12個(gè)退貨溫度的升高，除了主轉(zhuǎn)錄本電泳條帶外，在其上方還有一條較大片段的條帶，如圖1箭頭所示。將較大的條帶切膠回收后連入PEASY-T3載體，挑取單克隆測(cè)序，利用DNAMAN比對(duì)軟件分析發(fā)現(xiàn)了一個(gè)異?？勺兗羟畜w，其保留了 CD46基因內(nèi)含子8中48bp的序列，命名為CD46-SV，如圖2所示。
[0028]1.2驗(yàn)證功能性SNP導(dǎo)致可變剪切體⑶46-SV的產(chǎn)生
[0029]以奶牛DNA為模板，設(shè)計(jì)引物IF和IR(如SEQ ID N0.3和SEQ ID N0.4所示)擴(kuò)增出⑶46發(fā)生異常剪切位置附近的DNA序列，PCR產(chǎn)物經(jīng)DNA直接測(cè)序，分析發(fā)現(xiàn)在保留的48bp序列內(nèi)部有一個(gè) SNP (C>T)，其位于 GenBank 公布的 NC_007314.4 (73736730-73780793)序列中第 32457 位點(diǎn)，申請(qǐng)者利用 ESEfinder3.0 (http://rula1.cshl.edu/cg1-bin/tools/ESE3/esefinder.cgi?process=home) (Cartegni 等,2003)在線軟件預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)突變后參與剪切的序列元件消失，消除了 SSRSF2(SC35)和SRSF5 (SRp40)兩種結(jié)合外顯子剪切序列原件的SR剪切蛋白結(jié)合位點(diǎn)，如圖2所示。
[0030]為驗(yàn)證所發(fā)現(xiàn)的SNP可以導(dǎo)致⑶46-SV異常剪切體的產(chǎn)生，設(shè)計(jì)帶EcoRI和XhoI酶切位點(diǎn)的2F和2R特異性引物(如SEQ ID N0.5和SEQ ID N0.6所示)將含不同基因型的內(nèi)含子8中914bp序列，外顯子9的54bp序列和內(nèi)含子9中453bp序列共同連入pSPL3載體，見圖3。將構(gòu)建好的測(cè)序驗(yàn)證正確后，轉(zhuǎn)染人腎上皮細(xì)胞，培養(yǎng)細(xì)胞24小時(shí)后，提取相應(yīng)的 mRNA，利用 SD6(5’ -TCTGAGTCACCTGGACAACC-3’)和 SA2(5’ -ATCTCAGTGGTATTTGTGAGC-3’ )載體上的序列引物進(jìn)行RT-PCR，用3%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物，發(fā)現(xiàn):空載PSPL3只產(chǎn)生載體剪切供體(SD)和剪切受體(SA)上的263bp序列；含g.324570T-TT基因型DNA片段的pSPL3載體產(chǎn)生317bp序列(包括外顯子9的54bp序列和263bp序列);含g.324570T-CC基因型DNA片段的pSPL3載體除了產(chǎn)生317bp序列外，還產(chǎn)生另一 365bp序列片段(包括外顯子9的54bp序列，263bp序列和48bp保留序列)，這正好和可變剪切體CD46-SV保留了48bp內(nèi)含子序列結(jié)果一致，驗(yàn)證了野生型(CC)可導(dǎo)致⑶46-SV異常剪切體的產(chǎn)生，如圖3所示。
[0031]1.3奶牛群體基因分型及關(guān)聯(lián)分析
[0032]選擇來自濟(jì)南佳寶，青島一牧等山東省規(guī)?；?chǎng)的230頭的中國荷斯坦奶牛，其DHI (Dairy Herd Improvement)數(shù)據(jù)由山東省農(nóng)科院奶牛中心測(cè)定完成。采集其頸靜脈血液，利用常規(guī)的苯酚/氯仿抽提法提取基因組DNA，利用3F和3R引物(如SEQ ID N0.7和SEQ ID N0.8所示)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增片段序列如SEQ ID N0.9所示。PCR產(chǎn)物經(jīng)EcoRI酶切后經(jīng)3%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，野生型個(gè)體酶切后分為200bp和29bp兩條帶(但由于29bp條帶太小，遷移速度較快，電泳檢測(cè)不顯示此帶)，雜合型個(gè)體酶切后分為229bp和200bp兩條帶(29bp電泳條帶不顯示),突變型個(gè)體為229bp—條帶,如圖4所示。利用SAS8.1軟件對(duì)基因分型數(shù)據(jù)和奶牛SCS進(jìn)行關(guān)聯(lián)性分析，結(jié)果顯示CT基因型個(gè)體相比于CC和TT基因型個(gè)體具有較低SCS (P<0.05)，如表1所示。
[0033]表1牛⑶46基因不同基因型和體細(xì)胞數(shù)(SCS)關(guān)聯(lián)性分析
[0034]
【權(quán)利要求】
1.一對(duì)篩選乳腺炎抗性奶牛的引物，其特征在于:包括上游引物和下游引物，上游引物的序列如SEQ ID N0.7所示，下游引物的序列如SEQ ID N0.8所示。
2.權(quán)利要求1所述的一對(duì)篩選乳腺炎抗性奶牛的引物在制備篩選乳腺炎抗性奶牛的試劑盒中的應(yīng)用。
3.一種篩選乳腺炎抗性奶牛的試劑盒，其特征在于:包括一對(duì)進(jìn)行分型鑒定的引物，包括上游引物和下游引物，上游引物的序列如SEQ ID N0.7所示，下游引物的序列如SEQID N0.8所示，以及PCR擴(kuò)增所需常規(guī)試劑。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的篩選乳腺炎抗性奶牛的試劑盒，其特征在于:是由以下組分組成的:上游引物 100ymol/L ;下游引物 lOOymol/L ;2XTaq PCR MasterMix ；FastDigest酶切緩沖液；FastDigest限制性內(nèi)切酶EcoRI ；ddH20 ；DNA Marker。
5.權(quán)利要求1所述的一對(duì)篩選乳腺炎抗性奶牛的引物在篩選乳腺炎抗性奶牛中的應(yīng)用。
6.權(quán)利要求3、4所述的篩選乳腺炎抗性奶牛的試劑盒在篩選乳腺炎抗性奶牛中的應(yīng)用。
7.根據(jù)權(quán)利要求5或6所述的應(yīng)用，其特征在于:應(yīng)用方式為:提取待檢測(cè)奶牛的基因組DNA，利用SEQ ID N0.7和SEQ ID N0.8所示的引物進(jìn)行特異性PCR擴(kuò)增，對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè):若得到片段大小為200bp和29bp的兩條帶，則該待檢測(cè)奶牛的基因型為野生型(CC);若得到片段大小為229bp、200bp和29bp的三條帶，則該待檢測(cè)奶牛的基因型為雜合型(CT);若得到片段大小為229bp的一條帶，則該待檢測(cè)奶牛的基因型為突變型(TT)。
8.一種篩選乳腺炎抗性奶牛方法，其特征在于:提取待檢測(cè)奶牛的基因組DNA，利用SEQ ID N0.7和SEQ ID N0.8所示的引物進(jìn)行特異性PCR擴(kuò)增，對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè):若得到片段大小為200bp和29bp的兩條帶，則該待檢測(cè)奶牛的基因型為野生型(CC);若得到片段大小為229bp、200bp和29bp的三條帶，則該待檢測(cè)奶牛的基因型為雜合型(CT);若得到片段大小為229bp的一條帶，則該待檢測(cè)奶牛的基因型為突變型(TT);選擇基因型為雜合型(CT)的奶牛個(gè)體用于奶牛遺傳分子育種。
【文檔編號(hào)】C12N15/11GK103757105SQ201410006788
【公開日】2014年4月30日 申請(qǐng)日期:2014年1月7日 優(yōu)先權(quán)日:2014年1月7日
【發(fā)明者】黃金明, 王秀革, 鞠志花, 齊超, 張燕, 李秋玲, 王長法, 高運(yùn)東, 仲躋峰 申請(qǐng)人:山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院奶牛研究中心