一種靶向性抗腫瘤融合蛋白及其編碼基因與表達質粒的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及醫(yī)藥生物【技術領域】，本發(fā)明提供了一種靶向性抗腫瘤融合蛋白mAnx5-MLT，其編碼基因是膜聯蛋白5的突變體mAnxA5和蜂毒素基因的融合基因mAnxA5-MLT；本發(fā)明還提供了表達質粒pET28a-mAnxA5-MLT以及工程菌DH5α。本發(fā)明的融合蛋白能夠靶向作用于腫瘤細胞外膜的磷脂腺絲氨酸，從而靶向作用于腫瘤部位，能夠顯著提高蜂毒素的抗腫瘤作用，而且減小了蜂毒素用藥量，從而減輕了蜂毒素的毒副作用。本發(fā)明可制備成為靶向抗腫瘤藥物。
【專利說明】一種靶向性抗腫瘤融合蛋白及其編碼基因與表達質粒
【技術領域】
[0001]本發(fā)明涉及醫(yī)藥生物【技術領域】，具體涉及一種靶向性抗腫瘤融合蛋白，及其編碼基因、表達質粒與在制備抗腫瘤藥物中的應用。
【背景技術】
[0002]近年來隨著腫瘤遺傳學和分子生物學的深入研究，人們已經找到了一些腫瘤增殖分化、浸潤轉移的重要分子，在此基礎上，靶向藥物治療逐漸成為是目前腫瘤治療的重要手段。與常規(guī)的放化療藥物不同，靶向藥物能靶向作用于腫瘤細胞，有針對性的殺傷細胞，從而降低用藥量；尤為重要的是，靶向藥物能夠最大限度的減少對正常細胞或組織的損傷，降低副作用，提高療效和改善病人的生存質量。因此，靶向抗腫瘤藥物的研發(fā)成為抗腫瘤藥物的熱點。目前已經有伊馬替尼、厄洛替尼、舒尼替尼、吉非替尼、索拉非尼、達沙替尼、拉帕替尼和尼洛替尼等多種靶向抗腫瘤藥物在臨床得到廣泛應用。
[0003]研制腫瘤靶向藥物，靶點的選擇至關重要。近年來的研究發(fā)現，磷脂酰絲氨酸(Phosphatidylserine, PS)是抗腫瘤治療的重要靶點之一。磷脂酰絲氨酸是磷脂膜的重要組成成分，約占細胞總脂質的 2 — 10% (Vance JE, Steenbergen R (2005) Metabo I ismand functions of phosphatidylserine.Prog Lipid Res44 (4):207-234 引用方式要求是作者，題名，期刊名，期卷頁碼)。在凝血、細胞吞噬和凋亡等特殊的生理狀態(tài)下，磷脂酰絲氨酸外翻，從而容易被吞噬細胞發(fā)現和吞噬。而越來越多的研究證實，腫瘤細胞和腫瘤新生血管內皮細胞的磷脂腺絲氨酸也外翻，從而成為腫瘤顯像和靶向治療的重要靶點(Kristof Schutters, Chris Reutelingsperger(2010)Phosphatidylserine targetingfor diagnosis and treatment of human diseases, Apoptosisl5:1072-1082)。
[0004]目前已經有一些針對磷脂酰絲氨酸的藥物如Diannexin (—種膜聯蛋白A5的同源二聚體，能特異性結合PS)和Bavi`tuximab (PS的單克隆抗體)通過了臨床試驗(http://clinicaltrials, gov)。Diannexin能夠顯著抑制結直腸癌、肺癌移植瘤的生長和腫瘤新生血管的生成(Khalid Al-Nedawia, Brian Meehana, Roberts et al.(2009)Endothelial expression of autocrine VEGF upon the uptake of tumor-derivedmicrovesicles containing oncogenic EGFR PNAS, 1063794-3799)。Bavituximab 已經完成了小細胞肺癌、肝癌、乳腺癌、前列腺癌等多種腫瘤的臨床試驗，發(fā)現Bavituximab和放療聯合使用，能顯著增強放療的效果(Xianming Huang, Dan Ye, Philip E.Thorpe (2011)Enhancing the potency of a whole-cell breast cancer vaccine in mice with anantibody-1L-2immunocytokine that targets exposed phosphatidylserine, Vaccine29,4785-4793)。因此，AnnexinA5可以作為一種“生物導彈”研制祀向抗腫瘤藥物。但有一個問題不容忽視:AnnexinA5的分子量為34kDa(GenBank N0.M18366),所以和腫瘤藥物融合后分子量往往太大，這樣不僅不利于融合蛋白的表達，也導致了其半衰期的縮短。
[0005]蜂毒肽(melittin，MLT)是蜂毒的主要成分，其質量占蜂毒干物質45~50 %。蜂毒肽是由26個氨基酸殘基組成的多肽(NM_001011607)，具有潛在膜活性，其寡聚體可在細胞膜上形成親水性小孔，使胞內離子外流，引起滲透性改變，導致細胞溶解，對細胞有極強的殺傷作用(Lazarev VN, Parfenova TM, Gularyan SK, et al.(2002) Inducedexpression of melittin,an antimicrobial peptide,inhibits infection by Chlamydiatrachomatis and Mycoplasma hominis in an Hela cell line.1nt J Antimicrob Agent,19(2):133 — 18)。同時，有大量文獻報道，蜂毒肽能夠通過多種細胞通路抑制細胞的增殖和促進細胞的凋亡(SonD J, Lee J ff, Lee Y H, et al.(2007) Therapeutic applicationof anti — arthritis, pain—releasing, and anti—cancer effects of bee venomandits constituent compounds.Pharmacol Ther, 115(2):246—70)蜂毒妝抗腫瘤作用在基礎研究和臨床實踐中已受到越來越多的重視。但是，蜂毒肽的藥理作用很復雜，除具有抗腫瘤作用外，對人體各大系統都有影響，具有較強的毒副作用:如溶血、呼吸中樞麻痹、心率失常等，大大限制了其在臨床上的應用。
[0006]目如尚無有關AnnexinA5和其他腫瘤藥物制備融合蛋白的相關報道，更無有關AnnexinA5和蜂毒肽構建融合蛋白的相關報道。

【發(fā)明內容】

[0007]本發(fā)明的目的在于提供一種靶向性抗腫瘤融合蛋白，具體為一種AnnexinA5和蜂毒肽構建的融合蛋白，以及該融合蛋白的編碼基因。本發(fā)明的另一目的是提供上述融合蛋白的表達載體。本發(fā)明的第三目的是提供上述融合蛋白、編碼基因、表達載體的應用。
[0008]本發(fā)明的第一方面，是提供一種靶向性抗腫瘤融合蛋白，具體為一種AnnexinA5和蜂毒肽構建的融合蛋白。
[0009]本發(fā)明以腫瘤內皮細胞暴露的磷脂酰絲氨酸為治療靶點，利用mAnxA5作為靶向分子，以蜂毒素為“彈藥”，構建mAnxA5-MLT靶向抗腫瘤分子。
[0010]針對AnnexinA5的分子量為34kDa,與腫瘤藥物融合后分子量過大不利于融合蛋白的表達，也導致了其半衰期的縮短的缺陷；本發(fā)明根據AnnexinA5具有四個同源結構域的特點對AnnexinA5進行了基因改造，得到了一個僅包含第一、第二結構域的序列缺失突變體mAnxA5,其分子量僅為原來的一半,但保留了 AnnexinA5對磷脂酰絲氨酸的祀向能力。
[0011]本發(fā)明提供了一種靶向性抗腫瘤融合蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID N0:4所示。
[0012]MAQVLRGTVTDFPGFDERADAETLRKAMKGLGTDEESILTLLTSRSNAQRQEISAAFKTLFGRDLLDDLKSELTGKFEKLIVALMKPSRLYDAYELKHALKGAGTNEKVLTEIIASRTPEELRAIKQVYEEEYGSSLEDDVRGDTSGYYQRMLVVLLQLKLIGPAGIGAVLKVLTTGLPALISffIKRKRQQ(SEQ ID NO:4)
[0013]本發(fā)明提供了一種上述靶向性抗腫瘤融合蛋白的編碼基因，其核苷酸序列如SEQID NO:3 所示。
[0014]ATGGCACAGGTTCTCAGAGGCACTGTGACTGACTTCCCTGGATTTGATGAGCGGGCTGATGCAGAAACTCTTCGGAAGGCTATGAAAGGCTTGGGCACAGATGAGGAGAGCATCCTGACTCTGTTGACATCCCGAAGTAATGCTCAGCGCCAGGAAATCTCTGCAGCTTTTAAGACTCTGTTTGGCAGGGATCTTCTGGATGACCTGAAATCAGAACTAACTGGAAAATTTGAAAAATTAATTGTGGCTCTGATGAAACCCTCTCGGCTTTATGATGCTTATGAACTGAAACATGCCTTGAAGGGAGCTGGAACAAATGAAAAAGTACTGACAGAAATTATTGCTTCAAGGACACCTGAAGAACTGAGAGCCATCAAACAAGTTTATGAAGAAGAATATGGCTCAAGCCTGGAAGATGACGTGCGTGGGGACACTTCAGGGTACTACCAGCGGATGTTGGTGGTTCTCCTTCAGTTGAAACTCATCGGCCCTGCAGGAATTGGAGCAGTTCTGAAGGTATTAACCACAGGATTGCCCGCCCTCATAAGTTGGATTAAACGTAAGAGGCAACAGTAA(SEQ ID NO:3)
[0015]本發(fā)明的第二方面，是提供上述靶向性抗腫瘤融合蛋白的表達載體。
[0016]所述的表達載體為一種含有如SEQ ID NO:3所不核苷酸序列的重組載體。
[0017]所述的表達載體，可采用原核表達載體pET28a，也可采用真核表達載體pLK0.1puro 等構建。
[0018]本發(fā)明的重組載體，進一步轉化大腸桿菌菌株BL21制備的工程菌BL21 (例如pET28a-mAnxA5-MLT ),表達上述祀向性抗腫瘤融合蛋白。
[0019]具體技術方案如下:
[0020]本發(fā)明融合蛋白mAnxA5_MLT是通過基因工程的方法制備的，具體制備過程為:
[0021]1、基因突變體mAnxA5的構建
[0022]mAnxA5基因是以AnnexinA5基因(GenBank N0.M18366)為基礎，通過定點突變和PCR等方法得到。整個構建過程分兩步:
[0023]第一步:進行點突變，將AnnexinA5基因第二結構域中“V_G_D”序列突變?yōu)椤?R-G-D ” 序列
[0024]將纈氨酸(V)突變?yōu)榫彼?R)采用重疊區(qū)基因擴增法，共需合成四條引物，分別為:
[0025]Pl: 5，GCCCATGGATGGCACAGGTTCTCAG3，(SEQ ID NO: 5)
[0026]P2:5? GTCCCC:^CG| CA`CCACGTCATCTTC3，(SEQ ID NO:6)
[0027]P3:5J GTG !CGI) GGGGACACTTCAGGGTAC3J (SEQ ID NO:7)
[0028]P4:5? TTACAGTAGAAGAGGTGTCGACGC3，(SEQ ID NO:8)
[0029]其中:
[0030]Pl與AnnexinA5基因的5’端相一致，并引入Nco I酶切位點CCATGG。
[0031]P2含有精氨酸密碼子的互補核苷酸序列ACG (加框部分)。
[0032]以含有AnnexinA5基因的質粒pUC119_AnxA5為模板，PI, P2為引物擴增，得到的序列稱為P1P2。
[0033]P3含有精氨酸密碼子序列CGT (加框部分)。
[0034]P4同AnnexinA5的3’末端互補。以含有AnnexinA5基因的質粒pUC119_AnxA5為模板，P3, P4為引物擴增，得到的序列稱為P3P4。
[0035]引物P2，P3具有一段互補的序列(引物中劃線的部分)，所以P1P2和P3P4的序列中也存在這一互補序列。將P1P2和P3P4變性后退火，可以在這段互補區(qū)形成雙鏈。提供PCR反應條件，P1P2和P3P4可以互為引物進行擴增，擴增后的產物為P1P4。通過這種方法，將AnnexinA5第二結構域中“V-G-D”序列突變?yōu)椤癛-G-D”序列。
[0036]第二步:PCR擴增P1P4序列中的第一、二結構域，得到突變體基因mAnxA5
[0037]以P1P4為模板，以P1，P5為引物進行PCR擴增，得到的產物即為本發(fā)明的突變體基因mAnxA5基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。
[0038]P1:5，GCCCATGGATGGCACAGGTTCTCAG3 ’
[0039]P5:5，ACCGCCACCGGATCCGCCACTACCCTGAAGGAGA3，(SEQ ID NO:9)
[0040]Pl與第一步所用的Pl相同，P5與編碼AnnexinA5第154-157位氨基酸殘基的核苷酸序列互補。
[0041]將PCR產物P1P5克隆入質粒Pucl9進行測序，證明所獲得的序列與SEQ ID NO:1
完全相同。
[0042]本發(fā)明所述的融合基因mAnxA5-MLT的構建方法采用重疊區(qū)延伸法連接，詳見圖1o
[0043]本發(fā)明中表達質粒pET28a-mAnxA5_MLT的構建，是利用基因工程手段將融合基因mAnxA5-MLT用EcoR 1、Sal I雙酶切，然后與EcoR 1、Sal I雙酶切的載體pET_28a ( + )連接。酶切結果證實，插入片段在500和750bp之間有一條帶，與預期大小(576bp)相符，核苷酸序列如SEQ ID N0:3所示。
[0044]本發(fā)明人構建的mAnxA5和蜂毒素融合表達質粒能夠在大腸桿菌表達系統中，通過IPTG誘導表達融合蛋白mAnxA5-MLT，融合蛋白序列如SEQ ID N0:4所示。
[0045]本發(fā)明的第三方面，是提供上述靶向性抗腫瘤融合蛋白、其編碼基因以及表達載體在制備抗腫瘤藥物中的應用。
[0046]所述的腫瘤為肝癌等。
[0047]本發(fā)明經實驗結果證明，mAnxA5-MLT保留了 mAnxA5對磷脂酰絲氨酸特異性結合能力，同時對SMMC7721和HepG2增殖具有顯著的抑制作用。
[0048]本發(fā)明的融合蛋白保留mAnxA5對磷脂酰絲氨酸的特異性結合和蜂毒素對腫瘤細胞的抑制作用，從而可得到一種靶向性抗腫瘤藥物。
[0049]由于蜂毒肽除能夠通過多種細胞通路抑制細胞的增殖和促進細胞的凋亡，除具有抗腫瘤作用外，對人體各大`系統都有影響，具有較強的毒副作用:如溶血、呼吸中樞麻痹、心率失常等，而膜聯蛋白mAnxA5因其特異性靶向腫瘤細胞和腫瘤血管內皮細胞表面的磷脂酰絲氨酸，所以可將蜂毒素靶向性地結合在腫瘤細胞和腫瘤血管內皮細胞表面，從而可以大大提高蜂毒素對腫瘤細胞的殺傷作用，而且降低蜂毒素用藥量，減少對正常細胞或組織的損傷，降低副作用，提高療效和改善病人的生存質量。
[0050]本發(fā)明采用誘導型表達載體，可降低大規(guī)模培養(yǎng)時的成本，以利于規(guī)?；a。由于蜂毒肽只有26個氨基酸,而mAnxA5也僅有19kDa,分子量較小，因此本發(fā)明可米用原核表達系統進行表達和純化，根據需要也可采用酵母表達系統或哺乳動物細胞表達系統。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0051]圖1為重疊區(qū)延伸法構建質粒pET28a-mAnxA5-MLT示意圖，
[0052]用PCR的方法分別擴增獲得mAnxA5SEQ ID NO:1和蜂毒素基因SEQ ID NO: 2，然后采用重疊區(qū)延伸法連接，獲得mAnxA5和蜂毒素的融合基因SEQ ID NO: 3，將mAnxA5和蜂毒素的融合基因mAnxA5-MLT通過EcoR I和Sal I位點插入pET_28a ( + )載體的多克隆區(qū)域，獲得表達mAnxA5-MLT融合基因的載體。
[0053]圖2為質粒pET28a-mAnxA5_MLT酶切電泳圖，
[0054]其中:泳道1:質粒 pET28a-mAnxA5_MLT 經 EcoR I 和 Sal I 雙酶切
[0055]泳道2:質粒 pET28a-mAnxA5_MLT 經 EcoR I 和 Sal I 雙酶切
[0056]泳道3:DNA標記。
[0057]圖3為融合蛋白mAnxA5_MLT的表達和純化，[0058]其中:泳道1:誘導前菌體蛋白
[0059]泳道2:誘導后菌體蛋白
[0060]泳道3:超聲上清
[0061]泳道4:超聲沉淀
[0062]泳道5-9:純化后蛋白
[0063]泳道10:蛋白 marker。
[0064]圖4為融合蛋白mAnxA5_MLT具有對磷脂酰絲氨酸特異性結合的能力，
[0065]用CCK8的實驗方法驗證了融合蛋白mAnxA5-MLT在肝癌細胞系SMMC-7721中對增殖的影響，分別用濃度為4mg/L、8mg/L、16mg/L、32mg/L和不加藥組(圖中用不同形狀和顏色的線表示)進行細胞處理，分別在0h、24h、48h和72h進行細胞活性檢測。
[0066]圖5為融合蛋白mAnxA5-MLT能夠抑制肝癌細胞系SMMC-7721 (A)和H印G2 (B)中的增殖，
[0067]用CCK8的實驗方法驗證了融合蛋白mAnxA5-MLT在肝癌細胞系SMMC-7721和HepG2中對增殖的影響，分別用濃度為4mg/L、8mg/L、16mg/L、32mg/L和不加藥組進行細胞處理，分別在0h、24h、48h和72h進行細胞活性檢測。 【具體實施方式】
[0068]現結合實施例和附圖，對本發(fā)明作進一步描述，但本發(fā)明的實施并不僅限于此。
[0069]本發(fā)明所用試劑和原料均市售可得或可按文獻方法制備。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件如Sambrook等人《分子克隆:實驗室指南》(NewYork:Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述的條件，或按照常規(guī)條件，或按照制造廠商所建議的條件。
[0070]本發(fā)明中所用的含有mAnxA5全長基因的質粒pUC19_mAnxA5構建詳見上述
【發(fā)明內容】
，或參考本 申請人:已公布的中國專利CN02136158.4，發(fā)明名稱為“兼抗凝溶栓雙重功能的血栓靶向融合蛋白mA5UKB”，申請公布號為CN1401662，mAnxA5基因序列如SEQ ID NO:1所示；
[0071]蜂毒素基因參照蜂毒素cDNA序列(該序列可以在基因數據庫(Genbank)得到，序列號:NM_001011607)，基因序列如SEQ ID NO:2所示；
[0072]原核表達質粒pET28a和宿主菌BL21 (DE3)購自Novagen公司；限制性內切酶、T4DNA連接酶、pfu DNA聚合酶、dNTP均購自TaKaRa公司。引物的合成和核苷酸序列測序均由上海Invitrogen完成。純化用的層析柱及其購自Promoga公司。誘導用IPTG購自Sigma公司。
[0073]實施例1融合基因mAnxA5_MLT的獲得
[0074]見圖1，將編碼膜聯蛋白mAnxA5的基因和編碼蜂毒素的基因分別用PCR方法擴增；然后采用重疊區(qū)延伸法連接，得到融合基因pET28a-mAnxA5-MLT。具體步驟如下:
[0075](I)用引物a和引物b擴增mAnxA5基因的全部編碼基因。其中引物a為5’GCGgAATTCATGGCCTACTGTCGCTCCCT3’,該引物與annexin BI編碼序列的5’端一致，同時引入EcoRI限制性內切酶位點。引物b:5‘TTGAAACTCATCGGCCCTGCA3’。采用高保真pfu DNA聚合酶進行PCR反應，其中dNTP濃度為20 μ M，Mg2+濃度為1.5mM，變性、退火、延伸的溫度分別為94°C、55°C、72°C，時間分別為45s,45s和75s，共進行30個循環(huán)。
[0076](2)用引物c和d擴增蜂毒素(MLT)的序列片斷。引物c為:5’ CTTTGAGTAGCCGGGACGT3’，該引物的5’端與annexin BI的3’端一致及蜂毒素的5’端的序列一致。引物d為:GGCGTCGAC TTA CTG TTG CCT CTT ACGTTT AA。該引物與蜂毒素的3’端序列互補。同時引入Sal I限制性內切酶位點。PCR反應程序同(I)，共進行30個循環(huán)。
[0077](3)利用重疊區(qū)延伸法獲得mAnxAl和蜂毒素的融合基因。上述兩步PCR反應得到的產物分別利用1.0%瓊脂糖電泳分離，然后作凝膠回收?；厥蘸蟮漠a物94°C變性5分鐘，將兩次PCR的產物混合后于50°C退火。因為引物b和c具有重疊的部分，因而退火后可以使mAnxA5基因的單鏈和MLT的單鏈配對。添加DNA聚合酶、MgCl2UOXPCR緩沖液、dNTP后，進行PCR擴增。利用這種方法，使兩個基因連接成一個融合基因mAnxA5-MLT SEQ ID N0:3。
[0078]為保證高保真的擴增，整個PCR程序均采用TaKaRa公司的pfu DNA聚合酶，50 μ I反應體系，變性、退火、延伸的溫度分別為94°C、50°C、72°C，時間分別為45s、45s和90s，共進行30個循環(huán)。
[0079]實施例2表達質粒pET28a-mAnxA5_MLT的構建
[0080]利用弓丨物a和d對上述方法擴增得到的融合基因mAnxA5_MLT進行測序(SEQ IDN0:3)。經測序正確后，用EcoR 1、Sal I雙酶切，與EcoR 1、Sal I雙酶切的載體pET_28a(+ )連接。酶切和連接反應的限制性內切酶和T4連接酶均購自TaKaRa公司，反應采用酶說明書所推薦的體系進行。
[0081]本發(fā)明所利用的誘導型表達載體pET_28a ( + )全長5369bp，含有T7啟動子和質粒復制起點(ori)。
[0082]具體反應過程如下:利用EcoR 1、Sal I對上述PCR產物及載體進行雙酶切，反應采用高鹽(H)緩沖體系，37°C酶切3小時`。然后經1.0%瓊脂糖電泳分離后，作凝膠回收。酶切片斷和載體按照5:1的摩爾比混合，加入相應的連接緩沖溶液和T4連接酶，16°C連接12小時。
[0083]實施例3工程菌的制備
[0084]將上述連接后的產物轉化大腸桿菌菌株BL21 (DE3)，得到工程菌BL21(pET28a-mAnxA5-MLT)。
[0085]具體步驟為:先將宿主菌BL21于50ml LB培養(yǎng)基(含1%的胰蛋白胨，0.5%酵母提取物和1%氯化鈉，PH7.0)中，37 °C振蕩培養(yǎng)至OD6tltl為0.4時，在4 °C下，以4000rpm的轉速離心，收集宿主菌；去除上清后，用I~2ml冰預冷的lOOmmol/L的氯化鈣溶液重懸，即得感受態(tài)細菌。將IOOng上述構建的質粒與感受態(tài)細菌于冰浴中冷卻30分鐘，42°C熱休克90秒，然后再于冰浴中冷卻10分鐘。加入0.8ml的LB，于37°C培養(yǎng)I小時后，取0.2ml轉化產物涂布于LB瓊脂平板上，37°C培養(yǎng)12-15小時后，即獲得單克隆的含有重組質粒的宿主菌。抽提宿主菌的質粒，用EcoR 1、Sal I雙酶切能夠切出一條576bp的條帶(見圖2)，該宿主菌即為陽性重組子。
[0086]含有質粒pET28a-mAnxA5-MLT的大腸桿菌菌株BL21為工程菌BL21(pET28a-mAnxA5-MLT)。
[0087]實施例4融合蛋白mAnxA5_MLT的表達和純化[0088]工程菌BL21 (pET28a-mAnxA5-MLT)通過誘導的方式，可以表達膜聯蛋白mAnxA5和蜂毒素的融合蛋白mAnxA5-MLT。蛋白純化后，10%SDS_PAGE電泳，經考馬氏亮藍染色，顯示為單一條帶，分子量為21kDa (見圖3泳道5-9)。
[0089](I)融合蛋白誘導表達
[0090]分別挑取上述工程菌的單菌落至100ml50mg/L的LB培養(yǎng)基中，37°C振搖培養(yǎng)過夜。次日，取100ml菌液接種至50mg/L的IL LB培養(yǎng)基中，繼續(xù)在37°C振蕩培養(yǎng)，至細菌生長到對數期(分光光度計檢測，波長為600nm處吸光值為A_=0.4-0.5)時，加入IPTG濃度至0.3mM于25°C振蕩培養(yǎng)4~7小時，最終A_可增至1.0左右。在低溫誘導條件下，表達蛋白大部分以可溶性蛋白的形式存在。
[0091](3)融合蛋白純化
[0092]將誘導表達后的培養(yǎng)物離心，收集菌體，按每250ml培養(yǎng)物加入STE溶液12ml的比例重懸菌體。為了便于超聲，將重懸菌液分裝入8個1.5EP管中，4°C、12000rpm離心3min,棄上清，用預冷的STE溶液重懸(Iml/管)，加入lOulPMSF (100umol/L) /管，進行超聲破碎。超聲條件如下:輸出功率50%超聲IOs停30s，超聲25分鐘后，4°C、12000rpm離心lOmin，分別取上清及沉淀加入樣品緩沖液制備電泳樣品，進行SDS-PAGE電泳。 [0093]將超聲上清按10ul/ml的濃度加入PMSF，上樣于預先用10倍柱體積的STE溶液平衡好的GST-resin純化柱，樣品上樣完成后,用10倍柱體積的STE溶液洗柱，用5ml洗脫緩沖液(0.01g還原型谷胱甘肽加入5mlSTE溶液)將樣品從純化柱上洗脫，收集的洗脫液為純化后的融合蛋白。
[0094](4)濃縮蛋白
[0095]將純化好已測定濃度的蛋白從_80°C冰箱取出，置于冰上融化。融化后，倒入濃縮柱子中，配平，3700rpml5min離心棄下層,將上層蛋白取出，以每Iml —個1.5EP管分裝。置于-80°C保存。
[0096]采用考馬斯亮蘭染色法(Bradford法)測定純化蛋白濃度，計算回收率。將所得蛋白冷凍干燥后分裝，置_20°C保存。
[0097]實施例5融合蛋白mAnxA5_MLT生物學活性分析
[0098]鈣磷脂結合實驗分析mAnxA5_MLT對磷脂酰絲氨酸(PS)的特異性結合:首先利用薄膜分散法制備脂質體:分別將0.1g磷脂酰絲氨酸(PS，Sigma, P7769)或磷脂酰膽堿(PC，Sigma，P3834)和0.01g膽固醇(Sigma，C8667)于20ml梨形瓶中，加入2ml乙醚使溶解，在晃動下用氮氣吹干乙醚，在梨形瓶的壁上有一層脂質薄膜形成，加入Iml含CaCl2的醫(yī)用生理鹽水，不斷晃動，充分水化脂質薄膜；水浴超聲5min后，即獲得PS和PC為主的脂質體。在Ca離子和EGTA存在的條件下，分別將PS和PC的脂質體和大腸桿菌表達的GST — AnxBlMLT融合蛋白溫育30min，以低溫超速(16000g)離心20min后分別收集上清和沉淀。10%SDS —PAGE分離，考馬氏亮藍染色，觀察結果。
[0099]結果如圖所示，結果GST-AnxBlMLT與PS脂質體孵育后僅在沉淀中檢測到；而與PC脂質體孵育后僅能在上清中檢測得到(圖4)，這個結果充分說明，GST - AnxBlMLT融合蛋白保留的AnxBl的鈣依賴性磷脂結合活性。
[0100](2)融合蛋白對肝癌細胞的生長抑制活性通過CCK-8試劑盒來檢測融合蛋白對肝癌細胞增殖的影響，實驗分為3組:實驗組(含有細胞的培養(yǎng)基、融合蛋白、CCK-8)，對照組(含有細胞的培養(yǎng)基、CCK-8)，空白組(不含有細胞的培養(yǎng)基、CCK-8)。將培養(yǎng)的肝癌細胞系smmc7721按2 x 103個細胞/孔接種于96孔培養(yǎng)板，每組設置3個復孔，加IOOul含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，實驗組按如下的濃度加入融合蛋白:0、4、8、16、32mg/L，分別在Oh、24h、48h、72h加入CCK-8溶液(5mg/ml)10ul，37°C、5%C02孵箱中繼續(xù)培養(yǎng)1.5h。用全自動酶標儀測定每孔的吸光度(D)值，測定波長450nm。以時間為橫軸，D值為縱軸描繪細胞生長曲線。
[0101]按下列公式計算細胞生長抑制率:抑制率=(1 一 A實驗/ A對照)X100%
[0102]結果如圖5所示，GST - anxBlMLT能顯著抑制smmc7721和!fepG2細胞的增殖，且隨著融合蛋白的濃度增加，抑制效率顯著增加，且具有明顯的劑量依賴效應。
[0103]以上顯示和描述了本發(fā)明的基本原理、主要特征和本發(fā)明的優(yōu)點。本行業(yè)的技術人員應該了解，本發(fā)明不受上述實施例的限制，上述實施例和說明書中描述的只是說明本發(fā)明的原理，在不脫離本發(fā)明精神和范圍的前提下本發(fā)明還會有各種變化和改進，這些變化和改進都落入要求保護的本發(fā)明范圍內。本發(fā)明要求保護范圍由所附的權利要求書及其等同物界定。`
【權利要求】
1.一種靶向性抗腫瘤融合蛋白，其特征在于，所述的靶向性抗腫瘤融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID N0:4所示。
2.一種如權利要求1所述的靶向性抗腫瘤融合蛋白的編碼基因，其特征在于，所述的編碼基因的核苷酸序列如SEQ ID N0:3所示。
3.—種如權利要求1所述的靶向性抗腫瘤融合蛋白的表達載體。
4.根據權利要求3所述的表達載體，其特征在于，該表達載體為含有如SEQID NO: 3所示核苷酸序列的重組載體。
5.根據權利要求4所述的表達載體，其特征在于，所述的表達載體為原核表達載體pET28a。
6.根據權利要求5所述的表達載體,其特征在于,該表達載體的構建方法如下: A、基因突變體mAnxA5的構建 第一步:進行點突變，將AnnexinA5基因第二結構域中“V_G_D”序列突變?yōu)椤癛-G-D”序列 將纈氨酸突變?yōu)榫彼岵捎弥丿B區(qū)基因擴增法，共需合成四條引物，分別為:
Pl:5，GC CCATGGATGGCACAGGTTCTCAG3，(SEQ ID NO:5)
P2:5’GTCCCCACGCACCACGTCATCTTC3’ (SEQ ID NO:6)
P3:5’GTGCGTGGGGACACTTCAGGGTAC3’ (SEQ ID NO:7)
P4:5’ TTACAGTAGAAGAGGTGTCGACGC3’ (SEQ ID NO:8) 其中: Pl與AnnexinA5基因的5’端相一致，并引入Nco I酶切位點CCATGG ； P2含有精氨酸密碼子的互補核苷酸序列ACG ； 以含有AnnexinA5基因的質粒pUC119-AnxA5為模板，PI, P2為引物擴增，得到的序列稱為P1P2 ； P3含有精氨酸密碼子序列CGT ； P4同AnnexinA5的3’末端互補，以含有AnnexinA5基因的質粒pUC119_AnxA5為模板，P3, P4為引物擴增，得到的序列稱為P3P4 ； 弓丨物P2，P3具有一段互補的序列，所以P1P2和P3P4的序列中也存在這一互補序列，將P1P2和P3P4變性后退火，可以在這段互補區(qū)形成雙鏈；提供PCR反應條件，P1P2和P3P4可以互為引物進行擴增,擴增后的產物為P1P4 ;通過這種方法，將AnnexinA5第二結構域中“ V-G-D ”序列突變?yōu)椤?R-G-D ”序列； 第二步:PCR擴增P1P4序列中的第一、二結構域，得到突變體基因mAnxA5以P1P4為模板，以PI，P5為引物進行PCR擴增，得到的產物即突變體基因mAnxA5基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示；
Pl: 5，GCCCATGGATGGCACAGGTTCTCAG3，(SEQ ID NO: 5)
P5:5’ACCGCCACCGGATCCGCCACTACCCTGAAGGAGA3’ (SEQ ID NO:9) Pl與第一步所用的Pl相 同，P5與編碼AnnexinA5第154-157位氨基酸殘基的核苷酸序列互補； 將PCR產物P1P5克隆入質粒Pucl9進行測序，證明所獲得的序列與SEQ ID NO:1完全相同；B、融合基因mAnxA5-MLT的構建方法采用重疊區(qū)延伸法連接，MLT的核苷酸序列如SEQID NO:2 所示； C、表達質粒pET28a-mAnxA5-MLT的構建 利用基因工程手段將融合基因mAnxA5-MLT用EcoR 1、Sal I雙酶切，然后與EcoR 1、Sal I雙酶切的載體pET-28a ( + )連接，酶切結果證實，插入片段在500和750bp之間有一條帶，與預期大小相符，核苷酸序列如SEQ ID N0:3所示。
7.—種如權利要求1所述的靶向性抗腫瘤融合蛋白在制備抗腫瘤藥物中的應用。
8.—種如權利要求2所述的編碼基因在制備抗腫瘤藥物中的應用。
9.一種如權利要求3、4、5或6所述的表達載體在制備抗腫瘤藥物中的應用。
10.一種如權利要求7所 述的靶向性抗腫瘤融合蛋白在制備抗腫瘤藥物中的應用，其特征在于，所述的腫瘤為肝癌。
【文檔編號】C12N15/62GK103755813SQ201410006518
【公開日】2014年4月30日 申請日期:2014年1月7日 優(yōu)先權日:2014年1月7日
【發(fā)明者】顏宏利, 鄧安梅, 孫小波, 方超平 申請人:中國人民解放軍第二軍醫(yī)大學