一種定量谷類生物殘留dna的標(biāo)準(zhǔn)操作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種用于谷類作物的重組蛋白質(zhì)中殘留DNA的定量方法，其特征在于,包括以重組蛋白質(zhì)產(chǎn)品中殘留DNA為模板，以SYBR?Green染料或TaqMan探針采用qPCR方法的定量分析方法。
【專利說明】一種定量谷類生物殘留DNA的標(biāo)準(zhǔn)操作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種定量谷類生物殘留DNA的標(biāo)準(zhǔn)操作方法。
【背景技術(shù)】
[0002]近年來，分子農(nóng)業(yè)用于生產(chǎn)重組藥用蛋白質(zhì)得到快速發(fā)展[1]。從可擴(kuò)展性、安全性和成本效益方面而言，植物為重組藥物蛋白的生產(chǎn)提供了具有前途的平臺(tái)，可能是傳統(tǒng)的如細(xì)菌，酵母，哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)等發(fā)酵系統(tǒng)以外的另一替代性生產(chǎn)平臺(tái)。谷類作物的種子，如水稻、大麥和玉米，都可能有希望成為理想的寄主[2]。最近，水稻種子已成功地表達(dá)了多種重組蛋白，如人類α-抗胰蛋白酶，T細(xì)胞表位肽，霍亂毒素B亞基(CTB)，雞傳染性法氏囊病病毒(IBDV)免疫原VP2，并大規(guī)模生產(chǎn)了人血清白蛋白[3_7]。其中一些蛋白質(zhì)已進(jìn)入臨床研究階段[8’9]。
[0003]作為臨床用途，生物藥物的生產(chǎn)必須牢記的是產(chǎn)自細(xì)胞基質(zhì)的產(chǎn)品所含寄主殘留DNA水平應(yīng)當(dāng)盡可能低。目前的監(jiān)管指引建議，最終產(chǎn)品中寄主殘留DNA的劑量應(yīng)少每劑lOOpg，對(duì)某些寄主而言是每劑10ng[1°’n]。因此，嚴(yán)格控制藥用級(jí)別的重組蛋白質(zhì)藥物中的殘留DNA含量是非常重要的，因?yàn)樗苯雨P(guān)系到人類的安全。定量藥物中殘留DNA的傳統(tǒng)方法包括PicoGreen法,雜交檢測(cè)法,閾值技術(shù)(threshold technology)和qPCR[n4]。這些檢測(cè)方法中，由于其靈敏度，準(zhǔn)確度，精密度和省時(shí)等特點(diǎn)，qPCR分析方法被認(rèn)為是最實(shí)用的殘留DNA定量方法。其已成功地開發(fā)并用于定量大腸桿菌、NSO (小鼠骨髓瘤細(xì)胞)和CHO (中國(guó)倉鼠卵巢細(xì)胞)細(xì)胞的殘留DNA。
[0004]然而，至今仍沒有關(guān)于植物類寄主殘留DNA的定量分析方法。隨著使用植物細(xì)胞，如稻米[3_9]，作為寄主的分子農(nóng)業(yè)的迅速發(fā)展，開發(fā)一種靈敏的分析方法來定量稻米源性藥物的殘留DNA非常有必要。在qPCR分析方法中，已知在較短的時(shí)間內(nèi)，目標(biāo)DNA序列的初始拷貝數(shù)量與達(dá)到閾值信號(hào)是成比例的。因此，為了達(dá)到這個(gè)目的，盡可能選擇基因組中拷貝數(shù)多的內(nèi)參DNA序列是有利的。通常用于殘留DNA分析的多拷貝元件有如LINE-1LINE-2, BI, B2和LTRtl5]。同時(shí)，由于核糖體DNA的多拷貝數(shù)和高度保守，也經(jīng)常被用于評(píng)估殘留DNA基因來進(jìn)行殘留DNA分析[16]。盡管還有其他的現(xiàn)有技術(shù)[17]，大部分研究人員還是依賴于TaqMan探針或SYBR綠色染料進(jìn)行qPCR分析。本發(fā)明致力于開發(fā)一種定量分子農(nóng)業(yè)產(chǎn)品，如水稻重組人血清白蛋白(OsrHSA)的殘留DNA的qPCR分析方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種用于重組蛋白質(zhì)中殘留DNA的定量方法，包括以重組蛋白質(zhì)產(chǎn)品中殘留DNA為模板，以SYBR Green染料或TaqMan探針采用qPCR方法的定量分析方法。進(jìn)一步地，所述重組蛋白質(zhì)是谷類作物的重組蛋白質(zhì)。
[0006]進(jìn)一步地，所述qPCR反應(yīng)包括使用以下引物:
[0007]正向引物5 ’ -CGGATGTAACATTTTCTGTA-3 ’ ；[0008]反向引物5 ’ -CGGGTGTCATTTCTTAAAATAG-3 ’。
[0009]所述TaqMan探針的序列為:
[0010]FAM-5，-TTGCCTGATTCCGAGTCCGT-3，-BHQl。
[0011]所述正向引物的濃度為4-10 μ M，反向引物的濃度為4-10 μ M ;其中所述正向引物的濃度優(yōu)選為10 μ Μ，反向引物的濃度優(yōu)選為4 μ Μ。
[0012]更進(jìn)一步地，本發(fā)明所述使用SYBR Green染料的qPCR方法的反應(yīng)過程為:
[0013]95 0C，10 分鐘，I 個(gè)循環(huán)；93-96 °C 15-30 秒，55-60 °C 25-35 秒，30-40 個(gè)循環(huán)；93-96°C 15-25 秒，55-60。。20-30 秒，I 個(gè)循環(huán)，以 0.7V /s 上升熔化。
[0014]優(yōu)選地，所述使用SYBR Green染料的qPCR方法的反應(yīng)過程為:
[0015]95°C, 10 分鐘，I 個(gè)循環(huán)；95°C 15-30 秒，60°C 25-35 秒，30-40 個(gè)循環(huán)；95°C 15-25秒，60°C 20-30秒，I個(gè)循環(huán)，以0.7°C /s上升熔化。
[0016]本發(fā)明所述使用所述TaqMan探針的qPCR方法的反應(yīng)過程為:
[0017]50-530C 1.5-2.5 分鐘，I 個(gè)循環(huán)；93-96°C 15-25 秒，55-60°C 25-35 秒，30-40 個(gè)循環(huán)。
[0018]優(yōu)選地,所述使用所述TaqMan探針的qPCR方法的反應(yīng)過程為:
[0019]50。。1.5-2.5 分鐘，I 個(gè)循環(huán)；95°C 15-25 秒，60°C 25-35 秒，30-40 個(gè)循環(huán)。
[0020]本發(fā)明還提供了所述qPCR方法優(yōu)選的反應(yīng)體系，包括:
[0021]
【權(quán)利要求】
1.一種用于重組蛋白質(zhì)中殘留DNA的定量方法，其特征在于，包括以重組蛋白質(zhì)產(chǎn)品中殘留DNA為模板，以SYBR Green染料或TaqMan探針采用qPCR方法的定量分析方法。
2.如權(quán)利要求1所述的定量方法，其特征在于，所述重組蛋白質(zhì)是谷類作物的重組蛋白質(zhì)。
3.如權(quán)利要求1所述的定量方法，其特征在于，所述qPCR反應(yīng)包括使用以下引物: 正向引物 5’ -CGGATGTAACATTTTCTGTA-3’ ； 反向引物 5’ -CGGGTGTCAITTCTTAAAATAG-3’。
4.如權(quán)利要求1或2所述的定量方法，其中所述TaqMan探針的序列為:
FAM-5’ -TTGCCTGATTCCGAGTCCGT-3’ -BHQl。
5.如權(quán)利要求2所述的定量方法，其特征在于，所述正向引物的濃度為4-10μ M，反向引物的濃度為4-10 μ Μ。
6.如權(quán)利要求5所述的定量方法，其特征在于，所述正向引物的濃度為ΙΟμΜ，反向引物的濃度為4 μ Μ。
7.如權(quán)利要求1所述的定量方法，其特征在于，使用SYBRGreen染料的qPCR方法的反應(yīng)過程為: 95 °C,10 分鐘，I 個(gè)循環(huán)；93-96 °C 15-30 秒，55-60 °C 25-35 秒，30-40 個(gè)循環(huán)；93-96 °C 15-25 秒，55-60 °C 20-30 秒，I 個(gè)循環(huán)，以 0.7。。/s 上升熔化。
8.如權(quán)利要求7所述的定量方法，其特征在于，使用SYBRGreen染料的qPCR方法的反應(yīng)過程為: 95°C, 10 分鐘，I 個(gè)循環(huán)；95°C 15-30 秒，60°C 25-35 秒，30-40 個(gè)循環(huán)；95°C 15-25 秒，60 0C 20-30秒，I個(gè)循環(huán)，以0.7°C /s上升熔化。
9.如權(quán)利要求1所述的定量方法，其特征在于，使用所述TaqMan探針的qPCR方法的反應(yīng)過程為: 50-530C 1.5-2.5 分鐘，I 個(gè)循環(huán)；93~96V 15-25 秒，55-60。。25-35 秒，30-40 個(gè)循環(huán)。
10.如權(quán)利要求9所述的定量方法，其特征在于，使用所述TaqMan探針的qPCR方法的反應(yīng)過程為: 50V 1.5-2.5 分鐘，I 個(gè)循環(huán)；95°C 15-25 秒，60°C 25-35 秒，30-40 個(gè)循環(huán)。
11.如權(quán)利要求3所述的定量方法，其特征在于，所述qPCR方法的反應(yīng)體系包括:
12.如權(quán)利要求4所述的定量方法，其特征在于，所述qPCR方法的反應(yīng)體系包括:
13.如權(quán)利要求2所述的定量方法，其特征在于，所述谷類作物為選自水稻、小麥和大麥。
14.如權(quán)利要求1所述的定量方法，其特征在于，所述重組蛋白質(zhì)為重組人血清白蛋白。
【文檔編號(hào)】C12Q1/68GK103757099SQ201310686660
【公開日】2014年4月30日 申請(qǐng)日期:2013年12月16日 優(yōu)先權(quán)日:2013年12月16日
【發(fā)明者】楊代常, 陳鎮(zhèn) 申請(qǐng)人:武漢大學(xué)