一種體外誘導(dǎo)擴(kuò)增nkt細(xì)胞的方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明涉及一種體外誘導(dǎo)擴(kuò)增NKT細(xì)胞的方法，該方法由以下步驟組成：a.改造白血病細(xì)胞株K562，使其表達(dá)CD1d、anti-CD28MAb，篩選得到表達(dá)CD1d、anti-CD28MAb的穩(wěn)定細(xì)胞株；b.用穩(wěn)定表達(dá)CD1d、anti-CD28MAb的K562細(xì)胞培養(yǎng)NKT細(xì)胞。本發(fā)明穩(wěn)定表達(dá)CD1d、anti-CD28MAb的K562細(xì)胞株，其表面表達(dá)CD1d分子，限制性的遞呈α-GalCer給NKT細(xì)胞，能夠充分刺激NKT細(xì)胞增殖，其表面表達(dá)的anti-CD28MAb是協(xié)同刺激信號(hào)CD28的單克隆抗體，提供了NKT細(xì)胞增殖的活化信號(hào)；能夠提供同DC細(xì)胞一致的CD1d分子，且能夠大量繁殖，從而避免了DC細(xì)胞不能增殖的缺陷，大大提高了NKT細(xì)胞增殖的高效率；穩(wěn)定表達(dá)CD1d、anti-CD28MAb的K562細(xì)胞共培養(yǎng)的NKT細(xì)胞分泌IFN-γ的能力更強(qiáng)，從而作用于NK細(xì)胞、DC細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞。
【專(zhuān)利說(shuō)明】一種體外誘導(dǎo)擴(kuò)增NKT細(xì)胞的方法
[【技術(shù)領(lǐng)域】]
[0001]本發(fā)明涉及一種免疫學(xué)領(lǐng)域，具體是指一種體外誘導(dǎo)擴(kuò)增NKT細(xì)胞的方法。
[【背景技術(shù)】]
[0002]自然殺傷T細(xì)胞(NKT細(xì)胞)是繼T淋巴細(xì)胞、B淋巴細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞(NK細(xì)胞)之后又一類(lèi)新型的T淋巴細(xì)胞，屬于第4類(lèi)免疫細(xì)胞。作為一種新型的免疫調(diào)節(jié)細(xì)胞，NKT細(xì)胞既表達(dá)T細(xì)胞的表面標(biāo)志，又表達(dá)NK細(xì)胞的表面標(biāo)志，NKT細(xì)胞具有細(xì)胞毒性和免疫調(diào)節(jié)作用。近幾年在其表型特征、分布及發(fā)育、免疫學(xué)效應(yīng)及與疾病關(guān)系、腫瘤治療等方面的研究有了很大進(jìn)展。
[0003]NKT細(xì)胞最顯著的特征是其表達(dá)的TCR和NK細(xì)胞的激活受體，NKT細(xì)胞主要分布于肝、骨髓、胸腺、脾及外周血中，在外臍血中也有NKT細(xì)胞。NKT細(xì)胞最佳刺激效應(yīng)物是α半乳糖神經(jīng)酰胺(glycolipid a -galactosylceramide, a -GalCer),是一類(lèi)來(lái)源于海綿體或者共生微生物的的提取物。最近，許多內(nèi)源性的哺乳動(dòng)物自身的脂質(zhì)體也是CDld的配體，能被NKT識(shí)別。
[0004]在細(xì)胞毒方面，NKT細(xì)胞在自身配體及合成配體的刺激下，其表面的IL-12受體活化，刺激DC細(xì)胞分泌大量的IL-12，并促使未成熟DC細(xì)胞的分化及成熟，而其本身迅速、大量的分泌IFN- Y，同時(shí)IFN- Y作用于NK細(xì)胞促使NK細(xì)胞亦分泌大量的穿孔素，DC細(xì)胞分泌的IL-12作用于初始⑶4T細(xì)胞，使其向Thl極化，上述因素共同作用而介導(dǎo)某些病毒感染、胞內(nèi)寄生菌感染的靶細(xì)胞和腫瘤靶細(xì)胞發(fā)生溶解破壞；也可通過(guò)表達(dá)FasL，經(jīng)Fas/FasL途徑使上述靶細(xì)胞發(fā)生凋亡。在免疫調(diào)節(jié)作用方面:活化NKT細(xì)胞可分泌IL-4和IFN-Y等細(xì)胞因子。IL-4可誘導(dǎo)⑶4+ThO細(xì)胞向⑶4+Th2細(xì)胞分化，參與體液免疫應(yīng)答或超敏反應(yīng)；IFN- Y與IL-12協(xié)`同作用，可使⑶4+ThO細(xì)胞向⑶4+Thl細(xì)胞分化，增強(qiáng)細(xì)胞免疫應(yīng)答。此外NKT細(xì)胞還可分泌多種趨化性細(xì)胞因子等參與炎癥反應(yīng)。
[0005]總之，NKT細(xì)胞作為一類(lèi)新型的免疫調(diào)節(jié)細(xì)胞，在抗腫瘤、抗感染、抑制自身免疫性疾病及移植耐受中具有遠(yuǎn)大的應(yīng)用前景。
[
【發(fā)明內(nèi)容】
]
[0006]為了解決現(xiàn)有技術(shù)中的不足，本發(fā)明提供一種體外誘導(dǎo)擴(kuò)增NKT細(xì)胞的方法，該方法誘導(dǎo)擴(kuò)增出的NKT細(xì)胞分泌細(xì)胞因子水平高，殺瘤活性高。
[0007]為實(shí)現(xiàn)上述目的，設(shè)計(jì)一種體外誘導(dǎo)擴(kuò)增NKT細(xì)胞的方法，其特征在于該方法由以下步驟組成:
[0008]a.改造白血病細(xì)胞株K562，使其表達(dá)⑶Id、ant1-⑶28Mab:用淋巴細(xì)胞分離液分離初外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)，采用RT-PCR方法分別從人PBMC中擴(kuò)增⑶ld、anti_ra28MAbcDNA,測(cè)序正確后，⑶Id、ant1-⑶28MAb基因分別克隆至含有不同篩選標(biāo)記的2種真核表達(dá)載體，先后轉(zhuǎn)染K562細(xì)胞，篩選穩(wěn)定表達(dá)的細(xì)胞克隆，構(gòu)建K562穩(wěn)定細(xì)胞株。(K562-CDld-ant1-CD28 MAb)；[0009]b.用IOOGy Y射線輻照K562穩(wěn)定細(xì)胞株，用含有IL-2、IL-15和a -Galcer的培養(yǎng)基調(diào)整人外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)細(xì)胞濃度至I X 106/ml，兩種細(xì)胞混勻后置于37°C、5%的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；每3~4天進(jìn)行補(bǔ)液及傳代，第12天收獲細(xì)胞。
[0010]所述的K562穩(wěn)定細(xì)胞株濃度:外周血單個(gè)核細(xì)胞=1-4:1。
[0011]步驟(b)中，IL-2的濃度為50U/ml。
[0012]步驟(b)中，IL-15的濃度為 50ng/ml。
[0013]步驟(b)中，a-Galcer 的濃度為 50ng/ml-500ng/ml。
[0014]與常規(guī)方法比較僅使用NKT培養(yǎng)液培養(yǎng)的NKT細(xì)胞相比，本發(fā)明的方法有以下優(yōu)點(diǎn):穩(wěn)定表達(dá)⑶IcUant1-⑶28MAb的K562細(xì)胞在a -GalCer存在的情況下可促進(jìn)NKT細(xì)胞大量擴(kuò)增，其效果明顯優(yōu)于單獨(dú)用a-GalCer。
[0015]與常規(guī)僅使用a-GalCer培養(yǎng)NKT細(xì)胞的培養(yǎng)方法相比，本發(fā)明的方法具有以下優(yōu)點(diǎn):
[0016]1.穩(wěn)定表達(dá)^1(1、311衍-^28獻(xiàn)13的1(562細(xì)胞株，其表面表達(dá)^1(1分
[0017]子，限制性的遞呈a -GalCer給NKT細(xì)胞，能夠充分刺激NKT細(xì)胞增殖；
[0018]2.穩(wěn)定表達(dá)CDld、ant1-CD28MAb的K562細(xì)胞株，其表面表達(dá)的anti_CD28MAb是協(xié)同刺激信號(hào)CD28的單克隆抗體，提供了 NKT細(xì)胞增殖的活化信號(hào)；
[0019]3.穩(wěn)定表達(dá)⑶Id、ant1-⑶28MAb的K562細(xì)胞株能夠提供同DC細(xì)胞一致的⑶Id分子，且能夠大量繁殖，從而 避免了 DC細(xì)胞不能增殖的缺陷，大大提高了 NKT細(xì)胞增殖的高效率；
[0020]4.穩(wěn)定表達(dá)⑶Id、ant1-⑶28MAb的K562細(xì)胞共培養(yǎng)的NKT細(xì)胞分泌IFN- Y的能力更強(qiáng)，從而作用于NK細(xì)胞、DC細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞。
[【具體實(shí)施方式】]
[0021]為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案及優(yōu)點(diǎn)更加清楚明白，對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明。本申請(qǐng)中的生產(chǎn)設(shè)備都是本領(lǐng)域的常用設(shè)備，應(yīng)當(dāng)理解，此處所描述的具體實(shí)施例僅用以解釋本發(fā)明，并不用于限定本發(fā)明。
[0022]實(shí)施例1
[0023]機(jī)采PBMC，將采集的血樣轉(zhuǎn)至離心管；700g，IOmin離心，吸取上層血漿培養(yǎng)時(shí)備用；血樣標(biāo)本還原至原體積，混勻；稀釋血緩慢加在Ficoll上,離心力900g,離心20min ;吸取分離液界面乳白色單個(gè)核細(xì)胞層；離心洗滌2次；用IOOGy Y射線輻照K562穩(wěn)定細(xì)胞株，用含有50U/ml IL-2、50ng/ml IL-15和100ng/ml a -Galcer的培養(yǎng)基調(diào)整人外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)細(xì)胞濃度至lX106/ml，兩種細(xì)胞混勻后置于37°C、5%的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng);
[0024]每3~4天進(jìn)行補(bǔ)液及傳代，每天觀察細(xì)胞的生長(zhǎng)和死亡情況，第12天收獲細(xì)胞；
[0025]實(shí)施例2
[0026]兩組培養(yǎng)方法NKT細(xì)胞增殖倍數(shù)的比較:
[0027]分別取a -GalCer單獨(dú)培養(yǎng)和穩(wěn)定表達(dá)CDlcU anti_CD28 MAb的K562細(xì)胞與a-GalCer共培養(yǎng)組的NKT細(xì)胞，IOOul加入FITC標(biāo)記的TCRVβ 11單克隆抗體，避光孵育20min，加入0.3mlPBS，測(cè)定人外周血培養(yǎng)的NKT細(xì)胞擴(kuò)增后效應(yīng)細(xì)胞的比較(如表一所示)。
[0028]表一兩種培養(yǎng)方法NKT細(xì)胞擴(kuò)增后效應(yīng)細(xì)胞的擴(kuò)增比較
【權(quán)利要求】
1.一種體外誘導(dǎo)擴(kuò)增NKT細(xì)胞的方法，其特征在于該方法由以下步驟組成: a.改造白血病細(xì)胞株K562，使其表達(dá)⑶Id、ant1-⑶28MAb，用淋巴細(xì)胞分離液分離出外周血單個(gè)核細(xì)胞，采用RT-PCR方法分別從人PBMC中擴(kuò)增⑶Id、ant1-⑶28MAbcDNA,測(cè)序正確后，⑶Id、ant1-⑶28MAb基因分別克隆至含有不同篩選標(biāo)記的2種真核表達(dá)載體，先后轉(zhuǎn)染K562細(xì)胞，篩選穩(wěn)定表達(dá)的細(xì)胞克隆，構(gòu)建K562穩(wěn)定細(xì)胞株K562-CDld-ant1-CD28MAb ； b.用IOOGyY射線輻照K562穩(wěn)定細(xì)胞株，用含有IL-2、IL-15和a -Galcer的培養(yǎng)基調(diào)整人外周血單個(gè)核細(xì)胞濃度至I X 106/ml，兩種細(xì)胞混勻后置于37°C、5%的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；每3~4天進(jìn)行補(bǔ)液及傳代，第12天收獲細(xì)胞。
2.如權(quán)利要求1或2或3所述的體外誘導(dǎo)擴(kuò)增NKT細(xì)胞的方法，其特征在于所述的培養(yǎng)基的為RPMI 1640加入10%人血清或10%胎牛血清；或AM-V加入10%人血清或10%胎牛血清。
3.如權(quán)利要求3所述的體外誘導(dǎo)擴(kuò)增NKT細(xì)胞的方法，其特征在于所述的K562穩(wěn)定細(xì)胞株濃度:外周血單個(gè)核細(xì)胞=1-4: I。
4.如權(quán)利要求3所述的體外誘導(dǎo)擴(kuò)增NKT細(xì)胞的方法，其特征在于所述的IL-2的濃度為 50U/ml。
5.如權(quán)利要求3所述的體外誘導(dǎo)擴(kuò)增NKT細(xì)胞的方法，其特征在于所述的IL-15的濃度為 50ng/ml。
6.如權(quán)利要求3所述的體外誘導(dǎo)擴(kuò)增NKT細(xì)胞的方法，其特征在于所述的a-Galcer的濃度為 50ng/ml-500ng/ml。
【文檔編號(hào)】C12N5/0783GK103756961SQ201310683048
【公開(kāi)日】2014年4月30日 申請(qǐng)日期:2013年12月13日 優(yōu)先權(quán)日:2012年12月13日
【發(fā)明者】唐田娟, 李迎年, 蘇國(guó)新, 葉永清 申請(qǐng)人:上?？氯R遜生物技術(shù)有限公司