一種提高免疫力、保護臟器的軟膠囊及其制備方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種提高免疫力、保護臟器的軟膠囊及其制備方法，由軟膠囊體和軟膠囊體內(nèi)的內(nèi)容物組成，特點是：按重量百分比稱量蜂膠15%～35%、葛根提取物10%～18%、輔酶Q1010%～15%、積雪草提取物9%～13%、綠茶提取物8%～15%、蜂王漿4%～8%、亞麻籽油5%～15%、紫蘇籽油3%～7%和蜂蠟3%～7%，經(jīng)過混勻、研磨、脫氣，得內(nèi)容物；按100∶100∶40比例稱量明膠、水、甘油，升溫化料，脫氣，得膠囊體濾液；將膠囊體濾液和內(nèi)容物按重量比1∶2～4的比例進行壓丸，再經(jīng)定型干燥、洗丸、選揀、包裝，即得成品。本發(fā)明軟膠囊功效顯著、制備簡單，具有提高免疫力、降血脂、輔助護肝、調(diào)節(jié)腸道、抗衰老等多功能。
【專利說明】一種提高免疫力、保護臟器的軟膠囊及其制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種以膠囊制劑為特征的醫(yī)藥配置品，尤其一種具有提高免疫力、保護臟器的軟膠囊及其制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002]我們知道，人體所有需要的能量幾乎都是ATP(三磷酸腺苷)提供的:心臟的跳動、肌肉的運動以及各類細胞的各種功能都源于ATP所產(chǎn)生的能量。當(dāng)ATP合成不足缺失時，人體會感覺乏力，并出現(xiàn)心臟功能失調(diào)、肌肉酸痛、肢體僵硬、容易疲勞、免疫功能下降等現(xiàn)象；長時間ATP合成不足，身體的組織和器官就會部分或全部喪失其功能。ATP合成不足持續(xù)時間越長，對身體各器官的影響就越大，尤其影響最大的組織和器官是心臟和骨骼肌。因此，保證心臟和骨骼肌細胞的ATP及時合成是維護心臟和肌肉功能的重要措施。輔酶QlO是一種體內(nèi)自行合成的輔酶，存在于人體細胞中，而輔酶QlO又是唯一一種能把我們?nèi)粘Ｊ秤玫拿住⒚?、肉等營養(yǎng)成分轉(zhuǎn)化成ATP的關(guān)鍵物質(zhì)。人體中輔酶QlO隨著年齡的增長而減少，在人體合成量低于最高值的25%，會造成ATP的合成不足，這樣就造成心臟動力不足。
[0003]采用人工合成的輔酶QlO作為一種強抗氧化劑已經(jīng)得到應(yīng)用，用于抑制自由基對免疫細胞上受體與細胞分化和活性相關(guān)的微管系統(tǒng)的修飾，增強免疫系統(tǒng)，延緩衰老。目前，輔酶QlO制備的保健組合物或膠囊已有報道，例如2012年10月31日公布的CN102754829A中國發(fā)明專利說明書中公開的“一種含輔酶QlO的保健組合物、膠囊制劑及制備方法”，其保健組合物的配料為:2?40份的輔酶Q10、60?98份的乙酯型或甘油三酯型魚油及0.01?10份的輔料；其將輔酶QlO和魚油進行配方組合，能使二者充分發(fā)揮各自功效，協(xié)同起到抗疲勞作用。2010年12月I日公開的CN 101897440A中國發(fā)明專利說明書中公開的“輔酶QlO復(fù)合軟膠囊及其制備方法”，其囊內(nèi)容物由下述原料原料按重量比組成:輔酶QlO:乳酸鋅:亞硒酸鈉:維生素E:玉米油=1: (0.8-1.6): (0.001-0.005):(1.5-3.5): (15-25)?，F(xiàn)有公開的含輔酶QlO的軟膠囊均存在著組份少、療效不理想的不足。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]為了克服現(xiàn)有技術(shù)中含輔酶QlO的軟膠囊均存在著組份少、療效不理想的不足，本發(fā)明提供一種組份科學(xué)、搭配合理、療效好的提高免疫力、保護臟器的軟膠囊及其制備方法。
[0005]本發(fā)明解決其技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案是:一種提高免疫力、保護臟器的軟膠囊，其是由軟膠囊體和封入軟膠囊體內(nèi)的內(nèi)容物組成，其特征在于:所述的內(nèi)容物是由下列組分按重量百分比組成:蜂膠15%?35%、葛根提取物10%?18%、輔酶Q1(l10%?15%、積雪草提取物9%?13%、綠茶提取物8%?15%、蜂王漿4%?8%、亞麻籽油5%?15%、紫蘇籽油3%?7%和蜂蠟3%?7%，其組分的重量百分比之和為100% ;所述的軟膠囊體是由明膠、水、甘油按100: 100: 40的比例制成；所述的軟膠囊體與所述的內(nèi)容物的重量比為:1: 2?4。
[0006]所述內(nèi)容物是由下列重量百分比的組分組成:蜂膠25%、葛根15%、輔酶Q1(l13%、積雪草提取物10%、綠茶提取物10%、蜂王漿5%、亞麻籽油10%、紫蘇籽油6%和蜂蠟6%。
[0007]所述的蜂膠中含總黃酮不低于15% ;所述的葛根提取物中所含有的葛根素不低于4%。
[0008]一種提高免疫力、保護臟器的軟膠囊的制備方法，其特征在于:經(jīng)過下列工藝步驟:
(a)過篩:將葛根提取物、積雪草提取物、綠茶提取物分別過100目篩，備用；
(b)粉碎:將蜂膠塊按照比例稱量后，進行粉碎，備用；
(c)配料:按照重量百分比稱量蜂膠15%?35%、葛根提取物10%?18%、輔酶Q1(l10%?15%、積雪草提取物9%?13%、綠茶提取物8%?15%、蜂王漿4%?8%、亞麻籽油5%?15%、紫蘇籽油3%?7%和蜂蠟3%?7%，依次置于配料罐中，溶解并攪拌均勻；
(d)研磨、脫氣:將步驟(c)中攪拌均勻的蜂膠、葛根提取物、輔酶Q1(l、積雪草提取物、綠茶提取物、蜂王漿、亞麻籽油、紫蘇籽油和蜂蠟置于膠體磨中研磨三次，過100目篩，得內(nèi)容物物料；再將內(nèi)容物物料置于真空鍋中，控制真空度-0.06Mpa，脫去物料中的氣體；
(e)囊材的制作:將明膠、水、甘油按100: 100: 40比例稱料，投送到化膠罐中，攪拌升溫至60?75°C，待明膠全部熔化，控制真空度-0.06Mpa，減壓抽真空，過80目篩，得到膠囊體濾液，放入保溫容器內(nèi)，備用；
(f)壓丸:將步驟(e)所得到的膠囊體濾液和步驟(d)所得到的脫氣后的內(nèi)容物物料按照重量比:1: 2?4的比例送入壓丸機中，壓制出軟膠囊；
(g)定型干燥:控制溫度22?26°C，濕度為30?40%，靜態(tài)干燥24小時后，將膠囊出
丸；
(h)洗丸:將步驟(g)所得到的膠囊采用濃度為90%以上的酒精洗去膠囊表面的油潰；
(i)選揀:將洗去表面油潰的膠囊選揀去除非正型丸，得正型軟膠囊；
(j)包裝、成品:將步驟(i)所得到的正型軟膠囊裝瓶、封裝，即成成品。
[0009]本發(fā)明的軟膠囊具有提高免疫力和保護肝臟器官功能的，其封入軟膠囊體內(nèi)的內(nèi)容物選用蜂膠、蜂王漿、蜂蠟、輔酶Q1(l、亞麻籽油、紫蘇籽油進行了合理的配伍，并進一步選取了具有純天然植物葛根、積雪草和綠茶的提取物，各種組分共同作用以達到最佳的提高免疫力效果。其中，
所選取的蜂膠是蜜蜂從植物芽孢或樹干上采集的樹脂。近代研究證明，蜂膠具有抗菌、消炎、止癢、抗氧化、增強免疫、降血糖、降血脂、抗腫瘤等多種功能，能夠分解色素、平復(fù)皺紋、減緩衰老、加快組織細胞的再生，還可強化免疫系統(tǒng)，增加抗體產(chǎn)量，顯著增強細胞免疫功能與體液免疫功能；
所選取的蜂王漿是高蛋白，并含有維生素B類和乙酰膽堿等，具有抗氧化、抗輻射、抗疲勞、養(yǎng)容美顏等多種作用，所含的免疫球蛋白能明顯的提高人體免疫力，所含的癸烯酸(10-HDA)是自然界中其它物質(zhì)所沒有的，具有顯著的刺激機體淋巴細胞的活性、消炎殺菌、防癌抗癌等作用；
所選取的蜂蠟其主要成份有:酸類、游離脂肪酸、游離脂肪醇和碳水化合物。此外，還有類胡蘿卜素、維生素A、芳香物質(zhì)等，中醫(yī)學(xué)上具有收澀、斂瘡、生肌、止痛的功效； 所選取的葛根提取物含有多種黃酮類成分，主要活性成分為大豆素、大豆甙、葛根素、葛根素-7-木糖甙等，能夠擴張血管，改善血液循環(huán)；降低心肌耗氧量，抑制癌細胞；增加冠脈流量，調(diào)整血液微循環(huán)，降低心腦血管疾病危險；提高肝細胞的再生能力，恢復(fù)正常肝臟機能；促進膽汁分泌，防止脂肪在肝臟堆積；促進新陳代謝，加強肝臟解毒功能，防止酒精對肝臟的損傷。經(jīng)大量的文獻證明，葛根提取物具有改善肝臟器官功能；
所選取的輔酶QlO是人體細胞新陳代謝不可或缺的輔酶，能清除自由基、抵抗氧化，令細胞充滿活力，也可以改善心血管功能，是天然抗氧化劑、自由基清除劑；
所選取的積雪草提取物、綠茶提取物均采用純天然植物提取，富含人體必需營養(yǎng)成分，并具有消炎抗菌等作用，增強人體免疫力，能明顯刺激新生肝細胞的酶合成，改善肝臟器官的自我保護能力，防止自腸道的毒素對肝臟細胞的損壞，產(chǎn)生的酶能夠促進損壞細胞的修復(fù)作用；
所選取的亞麻籽油、紫蘇籽油是一種高不飽和度的天然油脂，所含主要成分為a-亞麻酸，最高含量高達50%?70%，是目前所發(fā)現(xiàn)的所有天然植物油中這種脂肪酸含量最高的，對護肝、降低膽固醇、降血脂等有顯著作用。
[0010]本發(fā)明膠囊內(nèi)容物的組分優(yōu)勢互補，清除自由基、活化細胞、添加純天然植物提取物、促進機體再生，充分發(fā)揮組分間的協(xié)同增效作用，有效地提高了人體的免疫力及改善機體肝臟器官的修復(fù)作用。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的提高免疫力、保護臟器的軟膠囊，其組分科學(xué)、搭配合理，提高免疫力效果好，并具有保護臟器之功能；其制備方法工藝合理，可操作性強，易實現(xiàn)規(guī)模化生產(chǎn)。
【具體實施方式】
[0011]下面結(jié)合本發(fā)明的實施例對本發(fā)明做進一步描述。
[0012]實施例1
一種提高免疫力、保護臟器的軟膠囊的制備方法，經(jīng)過下列工藝步驟:
Ca)過篩:選取市售的葛根提取物、積雪草提取物、綠茶提取物分別過100目篩，備用；
(b)粉碎:將蜂膠塊進行粉碎，備用；
(c)配料:按照重量百分比稱量蜂膠25kg、葛根提取物15kg、輔酶Q1(l13kg、積雪草提取物10kg、綠茶提取物10kg、蜂王楽；5kg、亞麻籽油10kg、紫蘇籽油6kg和蜂臘6kg,置于配料罐中，溶解并攪拌均勻；其中，蜂膠中含總黃酮不低于15% ;葛根提取物中所含有的葛根素不低于4% ；
(d)研磨、脫氣:將步驟(c)中攪拌均勻的蜂膠、葛根提取物、輔酶Qltl、積雪草提取物、綠茶提取物、蜂王漿、亞麻籽油、紫蘇籽油和蜂蠟置于膠體磨中研磨三次，過100目篩，得內(nèi)容物物料；再將內(nèi)容物物料置于真空鍋中，控制真空度-0.06Mpa，脫去物料中的氣體；
Ce)囊材的制作:稱量明膠13.2kg、水13.2kg、甘油5.3kg投送到化膠罐中，攪拌升溫至75°C，待明膠全部熔化，控制真空度-0.06Mpa,減壓抽真空，過80目篩，得到膠囊體濾液，放入保溫桶內(nèi)，備用；
(f)壓丸:將步驟(e)所得到的膠囊體濾液和步驟(d)所得到的脫氣后的內(nèi)容物物料送入壓丸機中，壓制出軟膠囊；
(g)定型干燥:控制溫度26°C，濕度為30%，靜態(tài)干燥24小時后，將膠囊出丸；(h)洗丸:將步驟(g)所得到的膠囊采用濃度為90%以上的酒精洗去膠囊表面的油潰；
(i)選揀:將洗去表面油潰的膠囊選揀去除非正型丸，得正型軟膠囊；
(j)包裝、成品:將步驟(i)所得到的正型軟膠囊裝瓶、封裝，即成成品。
[0013]本實施例中，軟膠囊體內(nèi)的內(nèi)容物的重量百分比分別為:蜂膠25%、葛根提取物15%、輔酶Q1(l13%、積雪草提取物10%、綠茶提取物10%、蜂王漿5%、亞麻籽油10%、紫蘇籽油6%和蜂蠟6% ;軟膠囊體是由明膠、水、甘油按100: 100: 40的比例制成，軟膠囊體與軟膠囊體內(nèi)的內(nèi)容物重量比為:1: 3.15。本發(fā)明所得的軟膠囊組分合理，劑量科學(xué)，提高免疫力效果好，并具有美容、抗衰老、保護臟器的功能；其制備方法工藝合理，可操作性強，易實現(xiàn)規(guī)?；a(chǎn)。
[0014]實施例2
一種提高免疫力、保護臟器的軟膠囊的制備方法，經(jīng)過下列工藝步驟:
(a)過篩:選取市售的葛根提取物、積雪草提取物、綠茶提取物分別過100目篩，備用；
(b)粉碎:將蜂膠塊進行粉碎，備用；
(c)配料:按照重量百分比稱量蜂膠35kg、葛根提取物10kg、輔酶Q1(l15kg、積雪草提取物9kg、綠茶提取物8kg、蜂王楽；8kg、亞麻籽油5kg、紫蘇籽油7kg和蜂臘3kg,置于配料罐中，溶解并攪拌均勻；其中，蜂膠中含總黃酮不低于15%;葛根提取物中所含有的葛根素不低于4% ；
(d)研磨、脫氣:將步驟(c)中攪拌均勻的蜂膠、葛根提取物、輔酶Q1(l、積雪草提取物、綠茶提取物、蜂王漿、亞麻籽油、紫蘇籽油和蜂蠟置于膠體磨中研磨三次，過100目篩，得內(nèi)容物物料；再將內(nèi)容物物料置于真空鍋中，控制真空度-0.06Mpa，脫去物料中的氣體；
(e)囊材的制作:稱量明膠10.4kg、水10.4kg、甘油4.2kg投送到化膠罐中，攪拌升溫至65°C，待明膠全部熔化，控制真空度-0.06Mpa,減壓抽真空，過80目篩，得到膠囊體濾液，放入保溫桶內(nèi)，備用；
(f)壓丸:將步驟(e)所得到的膠囊體濾液和步驟(d)所得到的脫氣后的內(nèi)容物物料送入壓丸機中，壓制出軟膠囊；
(g)定型干燥:控制溫度24°C，濕度為40%，靜態(tài)干燥24小時后，將膠囊出丸；
(h)洗丸:將步驟(g)所得到的膠囊采用濃度為90%以上的酒精洗去膠囊表面的油潰；
(i)選揀:將洗去表面油潰的膠囊選揀去除非正型丸，得正型軟膠囊；
(j)包裝、成品:將步驟(i)所得到的正型軟膠囊裝瓶、封裝，即成成品。
[0015]本實施例中，軟膠囊體內(nèi)的內(nèi)容物的重量百分比分別為:蜂膠35%、葛根提取物10%、輔酶Q1(l15%、積雪草提取物9%、綠茶提取物8%、蜂王漿8%、亞麻籽油5%、紫蘇籽油7%和蜂蠟3% ;軟膠囊體是由明膠、水、甘油約按100: 100: 40的比例制成，軟膠囊體與軟膠囊體內(nèi)的內(nèi)容物重量比為:1: 4。本發(fā)明所得的軟膠囊組分合理，提高免疫力效果好，并具有保護臟器功能；其制備方法工藝合理，可操作性強，易實現(xiàn)規(guī)?；a(chǎn)。
[0016]實施例3
一種提高免疫力、保護臟器的軟膠囊的制備方法，經(jīng)過下列工藝步驟:
(a)過篩:選取市售的葛根提取物、積雪草提取物、綠茶提取物分別過100目篩，備用；
(b)粉碎:將蜂膠塊進行粉碎，備用；
(c)配料:按照重量百分比稱量蜂膠15kg、葛根提取物18kg、輔酶Q1(l10kg、積雪草提取物13kg、綠茶提取物15kg、蜂王漿4kg、亞麻籽油15kg、紫蘇籽油3kg和蜂蠟7kg，置于配料罐中，溶解并攪拌均勻；其中，蜂膠中含總黃酮不低于15% ;葛根提取物中所含有的葛根素不低于4% ；
(d)研磨、脫氣:將步驟(c)中攪拌均勻的蜂膠、葛根提取物、輔酶Qltl、積雪草提取物、綠茶提取物、蜂王漿、亞麻籽油、紫蘇籽油和蜂蠟置于膠體磨中研磨三次，過100目篩，得內(nèi)容物物料；再將內(nèi)容物物料置于真空鍋中，控制真空度-0.06Mpa，脫去物料中的氣體；
(e)囊材的制作:稱量明膠15kg、水15kg、甘油6kg投送到化膠罐中，攪拌升溫至60°C，待明膠全部熔化，控制真空度-0.06Mpa,減壓抽真空，過80目篩，得到膠囊體濾液，放入保溫桶內(nèi)，備用；
(f)壓丸:將步驟(e)所得到的膠囊體濾液和步驟(d)所得到的脫氣后的內(nèi)容物物料送入壓丸機中，壓制出軟膠囊；
(g)定型干燥:控制溫度22°C，濕度為35%，靜態(tài)干燥24小時后，將膠囊出丸；
(h)洗丸:將步驟(g)所得到的膠囊采用濃度為90%以上的酒精洗去膠囊表面的油潰；
(i)選揀:將洗去表面油潰的膠囊選揀去除非正型丸，得正型軟膠囊；
(j)包裝、成品:將步驟(i)所得到的正型軟膠囊裝瓶、封裝，即成成品。
[0017]本實施例中，軟膠囊體內(nèi)的內(nèi)容物的重量百分比分別為:蜂膠15%、葛根提取物18%、輔酶Q1Q10%、積雪草提取物13%、綠茶提取物15%、蜂王漿4%、亞麻籽油15%、紫蘇籽油3%和蜂蠟7% ;軟膠囊體是由明膠、水、甘油按100: 100: 40的比例制成，軟膠囊體與軟膠囊體內(nèi)的內(nèi)容物重量比為:1: 2.8。本發(fā)明所得的軟膠囊組分合理，劑量科學(xué)，提高免疫力效果好，并具有保護臟器的保健功能；其制備方法工藝合理，可操作性強，易實現(xiàn)規(guī)模化生產(chǎn)。
[0018]下面采用動物試驗來說明本發(fā)明的軟膠囊具有提高免疫力、保護臟器的功能。
[0019]1、材料和方法
1.1、受試樣品:按照本發(fā)明實施例一提供的提高免疫力、保護臟器軟膠囊生產(chǎn)工藝，生產(chǎn)出500mg/粒軟膠囊樣品。按照人體推薦攝入量為每日2次，每次2粒，即人體每日推薦量為 2.0g/60kg.bw (33.33mg/kg.bw)。
[0020]1.2、試驗動物與組分:實驗動物由山東大學(xué)動物實驗中心提供的健康SPF昆明種小鼠，生產(chǎn)許可證號為SCXK (魯)20090001。將實驗動物隨機分為4個免疫大組，每大組55只。
[0021]1.3、實驗環(huán)境條件:實驗環(huán)境為屏障環(huán)境。環(huán)境溫度22°C ±2°C，相對濕度50%±10%。實驗動物環(huán)境設(shè)施合格證號為魯動環(huán)字H2002100112號。
[0022]1.4、劑量選擇與受試物給與方式:根據(jù)人體推薦量(33.33mg/日/kg.bw),按相當(dāng)于人體推薦量的5倍、10倍、30倍確定小鼠的低、中、高劑量分別為:0.17g/kg.bw、0.33g/kg.bw、lg/kg.bw,經(jīng)口每日一次灌胃給予小鼠受試物,灌胃體積按10mL/kg.bw。灌胃前用玉米油溶解并稀釋受試物，對照組分別以等體積的蒸餾水和玉米油代替受試物，連續(xù)給予30d后測各項免疫指標(biāo)。
[0023]1.5、主要儀器與試劑
主要儀器:動物天平、分析天平、潔凈工作臺、游標(biāo)卡尺(精密度0.01mm)、微量注射器(25 V- L)、CO2培養(yǎng)箱、恒溫水浴、離心機、紫外分光光度計、酶聯(lián)免疫檢測儀、光學(xué)顯微鏡、微量加樣器(20?200 ii L、100?IOOOii L)。無菌手術(shù)器械、200目篩網(wǎng)、玻璃平皿、紗布、試管、血細胞計數(shù)器、平底細胞培養(yǎng)板、U型細胞培養(yǎng)板、計時器、血色素吸管、玻片架。
[0024]試劑:綿羊紅細胞(SRBC)、生理鹽水、刀豆蛋白A (ConA)、補體(豚鼠血清)、Hank’s液、青鏈霉素、SA緩沖液、瓊脂糖、MTT、小牛血清、PRMI1640培養(yǎng)液、PBS緩沖液、乳酸鈉、硝基氯化四氮唑、吩嗪二甲酯磷酸鹽、氧化型輔酶1、1%冰醋酸、lmol/L HCl,0.1% NP40 (v/v)、酸性異丙醇(96mL 異丙醇加 4mL lmol/L 的 HCl )、YAC-1 細胞、0.2mol/L 的 Tris-HCl 緩沖液、印度墨汁、lg/L Na2CO3、雞紅細胞、甲醇、丙酮Giemsa染液等。
[0025]1.6、實驗方法:
1.6.1、臟器體重比值測定:小鼠稱重后脫白處死，取其胸腺、脾臟，去盡筋膜，用濾紙吸干臟器表面血污并稱重，計算胸腺體重比值與脾臟體重比值。所得數(shù)據(jù)，用PEMS統(tǒng)計軟件進行方差分析。
[0026]1.6.2、遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)(DTH)(足跖增厚法):取羊血，脫去纖維，用生理鹽水洗滌3次，每只小鼠經(jīng)腹腔注射2% (v/v，用生理鹽水配制)壓積SRBC 0.2mL，致敏后4天，測量左足后跖部厚度，同一部位測量三次，取平均值。然后在測量部位皮下注射20%壓積SRBC20 u L，于注射后24h測量左后足跖部厚度，以攻擊前后足跖厚度之差值來表示DTH的程度。
[0027]所得數(shù)據(jù)為計算資料，用PEMS統(tǒng)計軟件進行方差分析，若受試物組攻擊前后足跖厚度的差值高于對照組，且差異有顯著性(P〈0.05)，可判定該受試物有提高小鼠遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)能力的作用。
[0028]1.6.3、ConA誘導(dǎo)的小鼠脾淋巴細胞轉(zhuǎn)化實驗(MTT法):無菌取脾，置于盛有適量無菌Hank’ s液的小平皿中，制成細胞懸液。用Hank’ s液洗滌2次，每次IOOOrpm離心IOmin0然后將細胞懸液浮于ImL RPMI1640的完全培養(yǎng)液中，計數(shù)活細胞數(shù)，調(diào)整細胞濃度為3X106個/mL。將細胞懸液分兩孔加入培養(yǎng)板中，每孔lmL，在其中一孔加75 ii L ConA液，另一孔作為對照，置于5% C02、37°C孵箱培養(yǎng)68h，每孔加入50 ii L MTT,繼續(xù)培養(yǎng)4h。每孔加入ImL酸性異丙醇，吹打混勻，使紫色結(jié)晶完全溶解，然后將液體移入比色杯中，用紫外分光光度計，在570nm波長處測定其光密度值(0D值)。計算試驗孔OD值和對照孔OD值之差，以此表示淋巴細胞的增殖能力。
[0029]所得數(shù)據(jù)為計算資料，用PEMS統(tǒng)計軟件進行方差分析，若受試物組淋巴細胞的增殖能力高于對照組，且差異有顯著性(P〈0.05)，可判定該受試物有提高ConA誘導(dǎo)的小鼠淋巴細胞轉(zhuǎn)化能力的作用。
[0030]1.6.4、抗體生成細胞測定(Jerne改良玻片法):取羊血，脫去纖維，用生理鹽水洗滌3次，每只小鼠經(jīng)腹腔注射2% (v/v，用生理鹽水配制)壓積SRBC 0.2mL，將SRBC免疫5天后的小鼠處死，取脾，制成細胞懸液。將10g/L瓊脂加熱溶解后，與等量雙倍Hank’s液混合，分裝小試管，每管0.5mL，再向管內(nèi)加10% (v/v，用SA液配制)壓積SRBC 50yL、脾細胞懸液25 yL，迅速混勻后，傾倒于已刷瓊脂糖薄層的玻片上，待瓊脂凝固后，將玻片水平扣放在片架上，放入CO2培養(yǎng)箱孵育1.5h，然后將補體加入玻片架凹槽內(nèi)，繼續(xù)溫育1.5h后，技術(shù)溶血空斑數(shù)。
[0031]所得數(shù)據(jù)為計算資料，用PEMS統(tǒng)計軟件進行方差分析，若受試物組溶血空斑數(shù)高于對照組，且差異有顯著性(P〈0.05)，可判定該受試物有增加小鼠抗體細胞數(shù)的作用。
[0032]1.6.5、小鼠血清溶血素的測定:取羊血，脫去纖維，用生理鹽水洗滌3次，每只小鼠經(jīng)腹腔注射2% (v/v，用生理鹽水配制)壓積SRBC 0.2mL，免疫5天后摘除小鼠眼球，取血于離心管內(nèi)，放置lh，將凝固血與管壁剝離，離心(2000rpm, lOmin),收集血清。用生理鹽水置約lh，將凝固血與管壁剝離，離心(2000rpm，lOmin)，收集血清。用生理鹽水將血清倍比稀釋，將不同稀釋度血清分別置于微量血凝試驗板內(nèi)，每孔100 μ L,再加入0.5% SRBC懸液ΙΟΟμ L，混勻，置于濕盒內(nèi)，于37°C溫箱孵育3h，記錄血球凝集程度。計算抗體積數(shù)。
[0033]血清凝集度分為5級，按以下標(biāo)準(zhǔn)判定。0級:SRBC全部下沉，集中在孔底部形成致敏的圓點狀，四周液體清晰級:SRBC大部分沉積在孔底部形成圓點狀，四周有少量凝集的SRBC ；11級:凝集的SRBC在孔底部形成薄層，中心可以明顯見到一個疏松的紅點；111級:凝集的SRBC均勻地鋪散在孔底成一薄層，中心隱約可見一個紅點；IV級:凝集的SRBC在孔底成一薄層，凝塊有時成卷折狀。
[0034]所得數(shù)據(jù)為計算資料，用PEMS統(tǒng)計軟件進行方差分析，若受試物組血清溶血素抗體積數(shù)高于對照組，且差異有顯著性(p〈0.05)，可判定該受試物有增加小鼠血清溶血素水平的作用。
[0035]1.6.6、小鼠碳廓清實驗:小鼠尾靜脈注射1: 5稀釋的印度墨汁，待墨汁注入，立即計時，注入墨汁后2min、10min，分別從內(nèi)眥靜脈取血20 μ L，并將其加入2mL Na2C03溶液中。用紫外分光光度計在600nm波長處測光密度值，以Na2C03溶液作空白對照。將小鼠處死，取其肝臟和脾臟稱重。按下式計算吞噬指數(shù)a:
K = (lgOD1- lg0D2)/(t2 - ti), a =體重+ (肝重 + 脾重)Xk1/3 ；
所得數(shù)據(jù)為計算資料，用PEMS統(tǒng)計軟件進行方差分析，若受試物組的吞噬指數(shù)高于對照組，且差異有顯著性(P〈0.05)，可判定該受試物有增加小鼠單核-巨噬細胞的碳廓清能力的作用。
[0036]1.6.7、小鼠腹腔巨噬細胞吞噬雞紅細胞實驗(半體內(nèi)法):小鼠腹腔注射20%壓積雞紅細胞懸液lmL，間隔30min，脫臼處死，取腹腔巨噬細胞洗液lmL，滴于載玻片上，放入墊有濕紗布的搪瓷盒內(nèi)，移入37°C孵箱溫育30min后，于生理鹽水中漂洗，晾干。以1: 1丙酮甲醇固定，4%Giemsa-磷酸緩沖液染色，再用蒸餾水漂洗晾干。油鏡下計數(shù)，每片計數(shù)100個巨噬細胞，按下式計算吞噬率和吞噬指數(shù):
吞噬率％=吞噬雞紅細胞的巨噬細胞數(shù)/計數(shù)的巨噬細胞數(shù)X 100 ；
吞噬指數(shù)=被吞噬的雞紅細胞總數(shù)/計數(shù)的巨噬細胞數(shù)；
所得數(shù)據(jù)為計算資料，若受試物組的吞噬率或吞噬指數(shù)明顯高于0.000g/kg.bw組，且差異有顯著性(P〈0.05)，可判定該受試物有增加小鼠巨噬細胞吞噬雞紅細胞能力的作用。
[0037]1.6.8、小鼠NK細胞活性測定(乳酸脫氫酶LDT測定法):試驗前24h將YAC-1細胞進行傳代培養(yǎng)，用前以Hank’ s液洗三次，用RPMI1640完全培養(yǎng)液調(diào)整細胞濃度為4X 105個/mL。將小鼠脫臼處死，無菌取脾，制備脾細胞懸液，用Hank’ s液洗三次，每次lOOOrpm離心lOmin。再用2mL含10%小牛血清的RPMI1640完全培養(yǎng)液重懸，用臺酚蘭染色計數(shù)，調(diào)整細胞濃度為2 X107個/mL，使效靶比為50: 1。
[0038]取靶細胞和脾細胞各100 μ L，加入U型培養(yǎng)板，靶細胞自然釋放孔加靶細胞和培養(yǎng)液各100 μ L，靶細胞最大釋放孔加靶細胞和1%ΝΡ40各100 μ L，上述各項均設(shè)三個平行孔，5% C02、37°C培養(yǎng)箱培養(yǎng)4h，將培養(yǎng)板以1500rpm離心5min，每孔取上清液100 μ L置于酶標(biāo)板中，同時加入LDH基質(zhì)液100 μ L，反應(yīng)3min，然后每孔加入lmol/L的HC1 30 μ L終止反應(yīng)，用酶標(biāo)儀在490nm處測定0D值。按下式計算NK細胞活性:NK細胞活性％=(反應(yīng)孔OD-自然釋放孔OD)/ (最大釋放孔OD-自然釋放孔0D) X 100 ； LDH基質(zhì)液的配制:乳酸鋰5X 10_2mol/L

硝基氯化四氮唑6.6 X l(T4mol/L 吩嗪二甲酯硫酸鹽2.8X 10_4mol/L 氧化型輔酶I 1.3Xl(T3mol/L 將上述試劑溶于0.2mol/L的Tris-HCl緩沖液中。
[0039]所得數(shù)據(jù)為計算資料，用PEMS統(tǒng)計軟件進行方差分析，NK細胞活性需按X=SirT1 (P)1/2進行數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換，式中P為NK細胞活性，用小數(shù)表示，若受試物組的NK細胞活性高于對照組，且差異有顯著性(P〈0.05)，可判定該受試物有增加小鼠NK細胞活性能力的作用。
[0040]1.7、實驗數(shù)據(jù)統(tǒng)計:實驗數(shù)據(jù)用PEMS統(tǒng)計軟件對各個實驗原始數(shù)據(jù)進行方差齊性檢驗，滿足“方差齊”要求的數(shù)據(jù)資料用多個實驗組和一個對照組間均數(shù)的兩兩比較方法進行統(tǒng)計處理；對方差不齊的數(shù)據(jù)資料進行適當(dāng)?shù)淖兞哭D(zhuǎn)換，待滿足“方差齊”要求后，用轉(zhuǎn)換所得的數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計處理。
[0041]1.8、結(jié)果判定:在細胞免疫功能、體液免疫功能、單核-巨噬細胞功能、NK細胞活性四個方面任兩個方面結(jié)果陽性，可判定該受試樣品具有增強免疫力功能作用。其中細胞免疫功能測定項目中的兩個實驗結(jié)果均為陽性，或者任一實驗的一個以上劑量組結(jié)果陽性，可判定細胞免疫功能測定結(jié)果陽性。體液免疫功能測定項目中的兩個實驗結(jié)果均為陽性，或者任一實驗的一個以上劑量組結(jié)果陽性，可判定體液免疫功能測定結(jié)果陽性。單核-巨噬細胞功能測定項目中的兩個實驗結(jié)果均為陽性，或者任一實驗的一個以上劑量組結(jié)果陽性，可判定單核-巨噬細胞功能測定結(jié)果陽性。NK細胞活性實驗的一個以上劑量組結(jié)果陽性，可判定NK細胞活性測定結(jié)果陽性。
[0042]2、 結(jié)果
2.1、軟膠囊對小鼠體重的影響:見表1 表1 軟膠囊對小鼠體重的影響 (;±SD)
【權(quán)利要求】
1.一種提高免疫力、保護臟器的軟膠囊，其是由軟膠囊體和封入軟膠囊體內(nèi)的內(nèi)容物組成，其特征在于:所述的內(nèi)容物是由下列組分按重量百分比組成:蜂膠15%?35%、葛根提取物10%?18%、輔酶Q1(l10%?15%、積雪草提取物9%?13%、綠茶提取物8%?15%、蜂王漿4%?8%、亞麻籽油5%?15%、紫蘇籽油3%?7%和蜂蠟3%?7%，其組分的重量百分比之和為100%;所述的軟膠囊體是由明膠、水、甘油按100: 100: 40的比例制成；所述的軟膠囊體與所述的內(nèi)容物的重量比為:1: 2?4。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種提高免疫力、保護臟器的軟膠囊，其特征在于:所述內(nèi)容物是由下列重量百分比的組分組成:蜂膠25%、葛根15%、輔酶Q1Q13%、積雪草提取物10%、綠茶提取物10%、蜂王漿5%、亞麻籽油10%、紫蘇籽油6%和蜂蠟6%。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的一種提高免疫力、保護臟器的軟膠囊，所述的蜂膠中含總黃酮不低于15% ;所述的葛根提取物中所含有的葛根素不低于4%。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種提高免疫力、保護臟器的軟膠囊的制備方法，其特征在于:經(jīng)過下列工藝步驟:(a)過篩:將葛根提取物、積雪草提取物、綠茶提取物分別過100目篩，備用；(b)粉碎:將蜂膠塊按照比例稱量后，進行粉碎，備用；(c)配料:按照重量百分比稱量蜂膠15%?35%、葛根提取物10%?18%、輔酶Q1(l10%?15%、積雪草提取物9%?13%、綠茶提取物8%?15%、蜂王漿4%?8%、亞麻籽油5%?15%、紫蘇籽油3%?7%和蜂蠟3%?7%，依次置于配料罐中，溶解并攪拌均勻；(d)研磨、脫氣:將步驟(c)中攪拌均勻的蜂膠、葛根提取物、輔酶Q1(l、積雪草提取物、綠茶提取物、蜂王漿、亞麻籽油、紫蘇籽油和蜂蠟置于膠體磨中研磨三次，過100目篩，得內(nèi)容物物料；再將內(nèi)容物物料置于真空鍋中，控制真空度-0.06Mpa，脫去物料中的氣體；(e)囊材的制作:將明膠、水、甘油按100: 100: 40比例稱料，投送到化膠罐中，攪拌升溫至60?75°C，待明膠全部熔化，控制真空度-0.06Mpa,減壓抽真空，過80目篩，得到膠囊體濾液，放入保溫容器內(nèi)，備用；(f)壓丸:將步驟(e)所得到的膠囊體濾液和步驟(d)所得到的脫氣后的內(nèi)容物物料按照重量比:1: 2?4的比例送入壓丸機中，壓制出軟膠囊；(g)定型干燥:控制溫度22?26°C，濕度為30?40%，靜態(tài)干燥24小時后，將膠囊出丸；(h)洗丸:將步驟(g)所得到的膠囊采用濃度為90%以上的酒精洗去膠囊表面的油潰；(i)選揀:將洗去表面油潰的膠囊選揀去除非正型丸，得正型軟膠囊；(j)包裝、成品:將步驟(i)所得到的正型軟膠囊裝瓶、封裝，即成成品。
【文檔編號】A23L1/29GK103734696SQ201310587779
【公開日】2014年4月23日 申請日期:2013年11月21日 優(yōu)先權(quán)日:2013年11月21日
【發(fā)明者】王麗娜 申請人:榮成百合生物技術(shù)有限公司