一種植物乳桿菌及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種植物乳桿菌及其應(yīng)用，具體涉及一種新的植物乳桿菌LP45（YMC1005），CGMCC?NO.8072；還涉及植物乳桿菌LP45在降低膽固醇、提高免疫力，抑制腸道有害菌方面的應(yīng)用。
【專利說(shuō)明】一種植物乳桿菌及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種乳桿菌屬的新菌株，更準(zhǔn)確地說(shuō)，本發(fā)明描述了植物乳桿菌(Lactobacillus plantarum)的一個(gè)新菌株LP45,屬于生物【技術(shù)領(lǐng)域】。
【背景技術(shù)】[0002]益生菌對(duì)人類的健康有很大幫助，科學(xué)家們已對(duì)其進(jìn)行了幾十年的研究，現(xiàn)已證明在腸胃調(diào)節(jié)、抗氧化、降膽固醇、預(yù)防胃腸道癌癥、免疫調(diào)節(jié)等方面均起到很好的作用。但是，益生菌的菌株種屬范圍非常廣，即便同一種屬的不同菌株之間個(gè)體差異都非常大，所以篩選工作非常困難，現(xiàn)在益生菌的應(yīng)用中普遍存在攝入人體后生存率不高，對(duì)胃腸的吸附能力不強(qiáng)，在增強(qiáng)人體免疫力和抑制致病菌能力方面的表現(xiàn)不理想。因此，是否研究篩選到益生功能最優(yōu)越的菌株作為益生菌應(yīng)用就成為了如今益生菌研究的關(guān)鍵所在。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003]本發(fā)明的目的是提供一種商業(yè)編號(hào)為L(zhǎng)P45,保藏編號(hào)為YMC1005的植物乳桿菌，它具備在人體胃腸中具有很高的生存率、較強(qiáng)的胃腸粘附力，提高人體免疫力的功能，能顯著抑制胃、腸道致病菌，具備降低膽固醇的潛力，另一方面提供上述新菌株的用途。
[0004]為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明所采取的技術(shù)方案為:
一種植物乳桿菌LP45，該植物乳桿菌已經(jīng)于2013年8月26日在中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物菌種保藏中心進(jìn)行了保藏，保藏號(hào)為:CGMCC N0.8072。
[0005]植物乳桿菌LP45具有胃腸道吸附能力。
[0006]植物乳桿菌LP45具有抑制胃腸道致病菌的功能。
[0007]植物乳桿菌LP45具有降低膽固醇的功能。
[0008]植物乳桿菌LP45具有提高免疫力的功能。
[0009]植物乳桿菌LP45用于制備抑制胃腸道致病菌的藥品或食品。
[0010]植物乳桿菌LP45用于制備降低動(dòng)物或人類體內(nèi)膽固醇濃度的藥品或食品。
[0011]植物乳桿菌LP45用于制備提高免疫力的藥品或食品。
[0012]上述食品主要包括普通食品、減肥食品、保健食品。
[0013]在發(fā)明所提供的體外試驗(yàn)證實(shí)，植物乳桿菌LP45 (YMC1005或L45)具備良好的耐酸性及耐膽鹽性，在胃腸道中生存率較高，并具備較強(qiáng)的胃腸道吸附能力，具備提高免疫力的功能，可有效抑制有害菌的繁殖，本發(fā)明所提供的菌株可顯著降低膽固醇含量，在對(duì)心血管疾病的預(yù)防或治療中具備較大潛力。
【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0014]圖1為本發(fā)明植物乳桿菌LP45 (YMC1005或L45)的基因指紋圖譜。
[0015]在圖1中:Μ為Maker、1為植物乳桿菌LP45 (YMC1005或L45)、2為植物乳桿菌ATCC14917。[0016]菌種保存
本發(fā)明菌種命名為植物乳桿菌(Lactobacillus plantarum) LP45,于2013年8月26日保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物菌種保藏中心，保藏號(hào)為:CGMCCN0.8072。保藏地址為:北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)。
【具體實(shí)施方式】
[0017]下面將結(jié)合附圖和實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步詳細(xì)的說(shuō)明。
[0018]實(shí)施例1菌株的篩選和保藏
本發(fā)明的植物乳桿菌LP45 (YMC1005或L45)是自內(nèi)蒙古烏蘭察布市四子王旗烏蘭哈達(dá)蘇木站烏蘭哈達(dá)嘎查的傳統(tǒng)酸奶酪中分離篩選獲得，具體分離鑒定步驟如下:
將內(nèi)蒙古四子王旗酸奶酪樣品溶解于滅菌生理鹽水試管中，充分震蕩混勻，混勻后使用接菌環(huán)蘸取混合液體并于MRS平板上劃線培養(yǎng)(37°C 72h)，分離菌株。用接菌環(huán)從第一代平板挑取單菌落，在新MRS平板上劃線培養(yǎng)(37°C 72h)，進(jìn)行純化。同樣方法再純化2次，使最終平板上為同一形態(tài)菌落為止。挑取單菌落接菌于MRS液體培養(yǎng)基中37°C培養(yǎng)18h，以備保藏和鑒定使用。
[0019]將液體培養(yǎng)基菌懸液收集至滅菌離心管中，清洗離心2次，進(jìn)行基因組DNA的提取，提取完畢后，利用通用引物27f:5’ -AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’，1495r:5_’ CTACGGCTACCTTGTTACGA-3’ 進(jìn)行 16S rDNA 的 PCR 實(shí)驗(yàn)，完成 PCR 后將最終 PCR 產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序，并將測(cè)序結(jié)果與Gene Bank中相關(guān)序列進(jìn)行比較，比較結(jié)果顯示LP45 (YMC1005或L45)屬于植物乳桿菌。
[0020]將LP45 (YMC1005或L45)及ATCC14917 (植物乳桿菌)菌株的純培養(yǎng)液進(jìn)行清洗離心，將獲得的菌體進(jìn)行基因組DNA的提取，提取完畢后，利用隨機(jī)引物5’ -GACGGATCAG-3’進(jìn)行RAPD實(shí)驗(yàn)，將PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，并進(jìn)行凝膠成像，對(duì)比兩株植物乳桿菌的電泳條帶，結(jié)果顯示，植物乳桿菌LP45 (YMC1005或L45)與植物乳桿菌ATCC14917屬于同一種屬的不同菌株，結(jié)果見(jiàn)附圖1。將植物乳桿菌LP45 (YMC1005或L45)于2013年8月26日保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物菌種保藏中心，保藏號(hào)為:CGMCCN0.8072。
[0021]實(shí)施例2胃腸道生存率試驗(yàn)
采用人工消化液實(shí)驗(yàn)(胃酸抵抗性以及膽汁酸抵抗性)來(lái)研究植物乳桿菌LP45(YMC1005)在人的腸道環(huán)境下的生存性。
[0022]1、耐酸性試驗(yàn)
植物乳桿菌LP45 (YMC1005或L45)由凍存管活化，經(jīng)3次活化(第一次活化24h，第二次活化14h，第三次活化18h)后3%接種于4支pH3.0 (使用鹽酸調(diào)pH)的液體MRS培養(yǎng)基試管，每支試管裝有10ml的液體MRS培養(yǎng)基。取1支pH3.0的液體MRS培養(yǎng)基試管3%接種后用于測(cè)Oh的活菌數(shù)；另三支pH3.0的液體MRS培養(yǎng)基試管3%接種后用于測(cè)4h的0D600，取其中兩支測(cè)活菌數(shù)。
[0023]存活率=4h活菌數(shù)/Oh活菌數(shù)*100%
2、耐膽鹽試驗(yàn)
植物乳桿菌LP45 (YMC1005或L45)由凍存管活化，經(jīng)3次活化(第一次活化24h，第二次活化14h，第三次活化18h)后3%接種于4支0.3%膽鹽(sigma膽鹽)的液體MRS培養(yǎng)基試管，每支試管裝有10ml的液體MRS培養(yǎng)基。取1支0.3%膽鹽的液體MRS培養(yǎng)基試管3%接種后用于測(cè)Oh的活菌數(shù);另三支0.3%膽鹽的液體MRS培養(yǎng)基試管3%接種后用于測(cè)4h的0D600，取其中兩支測(cè)活菌數(shù)。
[0024]存活率=4h活菌數(shù)/Oh活菌數(shù)*100%
結(jié)果和結(jié)論:經(jīng)試驗(yàn)得到LP45(YMC1005或L45)在pH3.0的液體培養(yǎng)基中，4小時(shí)后的存活率達(dá)到了 122.4%，高于競(jìng)品鼠李糖乳桿菌11^ (98.9%)及嗜酸乳桿菌從^11 (51.2%)；在0.3%膽汁酸的液體培養(yǎng)基中，4小時(shí)后生存率達(dá)到了 47.8%。高于競(jìng)品菌株LGG (1.3%)及 NCFM (2.1%)。
[0025]眾所周知，益生菌在被攝取后需經(jīng)受消化液的考驗(yàn)才能到達(dá)腸道，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明了 LP45 (YMC1005或L45)具備較高的胃腸道生存率，也顯示了菌株作為益生菌開(kāi)發(fā)的潛力。[0026]實(shí)施例3胃腸道吸附能力試驗(yàn)
采用LP45 (YMC1005或L45)菌株吸附Caco_2細(xì)胞來(lái)研究LP45 (YMC1005或L45)菌株對(duì)胃腸道上皮細(xì)胞的吸附能力，發(fā)現(xiàn)LP45 (YMC1005或L45)粘附力為72。
[0027]具體的操作步驟為:
1、將人體腸道細(xì)胞株Caco-2以1ml 0.05%胰島素處理5min后，將細(xì)胞輕輕拍下，分裝于96孔的培養(yǎng)盤中，每個(gè)孔洞中加入lOOOOcells，每天換200 μ 1新鮮的DiffiM培養(yǎng)基。
[0028]2、植物乳酸桿菌LP45 (YMC1005或L45)分別以MRS活化兩次后，接種至5mlMRSbroth進(jìn)行培養(yǎng)，于24小時(shí)后取lml以6000rpm離心10分鐘后，以PBS (pH 7.2)清洗兩次得到乳酸菌菌液。加入20 μ 1乳酸菌菌液于步驟1的細(xì)胞中，接著培養(yǎng)1小時(shí)使乳酸菌附著，
3、乳酸菌附著1小時(shí)后，倒除培養(yǎng)基，以PBS緩沖液洗5次以去除未附著的乳酸菌，加入100μ 1，10%福爾馬林，30分鐘，固定細(xì)胞及細(xì)菌，再以PBS緩沖液洗3次，最后以100 μ 1結(jié)晶紫進(jìn)行染色，五分鐘后以少量75%酒精快速?zèng)_洗，去除細(xì)胞上的染色劑。
[0029]4、利用相位差顯微鏡觀察乳酸菌對(duì)腸道上皮細(xì)胞的吸附性，隨機(jī)在不同的顯微鏡視野下，觀察并計(jì)算50個(gè)細(xì)胞的乳酸菌吸附情形，最后計(jì)算每個(gè)細(xì)胞平均吸附的乳酸菌數(shù)量。
[0030]經(jīng)試驗(yàn)結(jié)果可知，本發(fā)明植物乳桿菌LP45 (YMC1005或L45)的粘附力72，粘附力較強(qiáng)。篩選益生菌的一個(gè)重要指標(biāo)就是其對(duì)胃腸道上皮細(xì)胞和粘膜的粘附力。粘附力強(qiáng)的益生菌在腸粘膜的定殖時(shí)間也相應(yīng)有所延長(zhǎng)，這對(duì)于發(fā)揮益生菌的免疫調(diào)節(jié)作用和刺激修復(fù)腸道損傷部位具有重要意義。
[0031]實(shí)施例4免疫力試驗(yàn)
采用 Caco-2 細(xì)胞，10%FBS 的 RPM1640 培養(yǎng)基在 37°C，5%C02 條件下與 LP45 (YMC1005或L45)菌株共培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)LP45 (YMC1005或L45)菌株無(wú)論是活菌還是加熱失活后都能夠顯著調(diào)節(jié)Caco-2細(xì)胞中IL-6和IL-8的表達(dá)。
[0032]采用小鼠巨噬細(xì)胞(J774.1)，10%FBS的RPM1640培養(yǎng)基在37°C，5%C02條件下與LP45 (YMC1005或L45)菌株共培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)LP45 (YMC1005或L45)菌株明顯促進(jìn)了 IL-6的分泌，使IL-6表達(dá)量由0提高到了 110ng/ml。[0033]由試驗(yàn)結(jié)果可見(jiàn)，植物乳桿菌LP45 (YMC1005或L45)具備增強(qiáng)免疫力的功能。
[0034]實(shí)施例5膽固醇含量測(cè)定試驗(yàn)
1、繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線
精確量取膽固醇標(biāo)準(zhǔn)液 0.2 ml、0.4 ml、0.6 ml、0.8 ml、1.0 ml、1.2 ml、1.4ml、1.6ml
置于干燥試管中，并用無(wú)水乙醇定容至2.0ml，再沿壁緩慢加入2.0ml硫酸鐵銨顯色液，震蕩混勻，待冷卻至室溫，與紫外分光光度計(jì)560nm處測(cè)定吸光度。以膽固醇濃度為橫坐標(biāo)，0D560為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。
[0035]2、膽固醇測(cè)定
a.物乳酸桿菌LP45 (YMC1005)在MRS液體培養(yǎng)基中活化3代，按麥?zhǔn)媳葷岱ㄕ{(diào)菌濃度為3.0 X 109CFU/ml按2%的接種量接種到含膽固醇的MRS液體培養(yǎng)基中37 °C培養(yǎng)，分別培養(yǎng) 24 h、48h。
[0036]b.取培養(yǎng)液0.2 mL置于干燥離心管中，先加0.8 mL無(wú)水乙醇，搖勻后，再加4 mL無(wú)水乙醇(無(wú)水乙醇分2次加入，目的使蛋白質(zhì)以分散很細(xì)的沉淀析出)，加蓋，快速混勻器混勻，離心(10000 r/min, 15 min)。
[0037]c.用微量移液器準(zhǔn)確移取上清液2 mL加入到比色管內(nèi)，再加入2 mL硫酸鐵銨顯色液，加入時(shí)要沿管壁緩慢加入，使兩液間保持明顯界面，加完后充分振搖混勻(不能邊加邊搖)，以便產(chǎn)生高熱(大于80 °C)促進(jìn)顯色。
[0038]d.將各管放置15 min，待管內(nèi)反應(yīng)液冷卻至室溫，在30~60 min內(nèi)在分光光度計(jì)上于560 nm處測(cè)定吸光度。以2 mL無(wú)水乙醇加2 mL硫酸鐵試劑為空白管，以未接菌的含膽固醇的MRS液體培養(yǎng)A0560為標(biāo)準(zhǔn)值。
[0039]e.膽固醇降解率=(A0560- A560) / A0560X100%。
[0040]結(jié)果和結(jié)論:經(jīng)試驗(yàn)，LP45 (YMC1005或L45)膽固醇降解率為80.2%，略低于競(jìng)品菌株NCFM (89.6%)，高于菌株1^6 (34.7%)，說(shuō)明其具有很強(qiáng)的膽固醇脫除能力。
[0041]實(shí)施例6抑菌試驗(yàn)
包括大腸桿菌、金黃色葡萄球菌的抑菌實(shí)驗(yàn)。大腸桿菌、金黃色葡萄球菌使用LB液體培養(yǎng)基活化18h后，稀釋到105-106cfu/ml取200ul均勻涂抹到LB固體培養(yǎng)基培養(yǎng)皿中，半小時(shí)后擺放牛津杯，每個(gè)培養(yǎng)皿擺放3個(gè),分別標(biāo)為A、B、C, A代表培養(yǎng)液原液、B代表調(diào)pH5.5后的培養(yǎng)液原液、C代表調(diào)pH5.5后的培養(yǎng)液原液稀釋10倍。每個(gè)牛津杯加入300ul，37°C培養(yǎng)24h后測(cè)量抑菌圈。
[0042]經(jīng)檢測(cè)，該菌株大腸桿菌抑菌圈為11.98_，對(duì)金黃色葡萄球菌抑菌圈為24.8_。結(jié)果顯示LP45 (YMC1005或L45)對(duì)大腸桿菌及金黃色葡萄球菌具有較好的抑菌作用。
[0043]以上所述實(shí)施方式僅為本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例，而并非本發(fā)明可行實(shí)施的窮舉。對(duì)于本領(lǐng)域一般技術(shù)人員而言，在不背離本發(fā)明原理和精神的前提下對(duì)其所作出的任何顯而易見(jiàn)的改動(dòng)，都應(yīng)當(dāng)被認(rèn)為包含在本發(fā)明的權(quán)利要求保護(hù)范圍之內(nèi)。
【權(quán)利要求】
1.一種植物乳桿菌LP45，該植物乳桿菌已經(jīng)于2013年8月26日在中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物菌種保藏中心進(jìn)行了保藏，保藏號(hào)為:CGMCC N0.8072。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種菌植物乳桿菌LP45，其具有胃腸道吸附能力。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種菌植物乳桿菌LP45，其具有抑制胃腸道致病菌的功能。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種菌植物乳桿菌LP45，其具有降低膽固醇的功能。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種菌植物乳桿菌LP45，其具有提高免疫力的功能。
6.—種如權(quán)利要求1-5任一項(xiàng)所述的植物乳桿菌LP45的應(yīng)用，其特征在于:用于制備抑制胃腸道致病菌的藥品或食品。
7.—種如權(quán)利要求1-5任一項(xiàng)所述的植物乳桿菌LP45的應(yīng)用，其特征在于:用于制備降低動(dòng)物或人類體內(nèi)膽固醇濃度的藥品或食品。
8.—種如權(quán)利要求1-5任一項(xiàng)所述的植物乳桿菌LP45的應(yīng)用，其特征在于:用于制備提聞免疫力的藥品 或食品。
【文檔編號(hào)】C12R1/25GK103642716SQ201310587738
【公開(kāi)日】2014年3月19日 申請(qǐng)日期:2013年11月21日 優(yōu)先權(quán)日:2013年11月21日
【發(fā)明者】趙林森, 齡南, 葛春美, 馬新穎, 齊世華 申請(qǐng)人:河北一然生物科技有限公司