一種可溶性淀粉底物特異性提高的環(huán)糊精糖基轉(zhuǎn)移酶的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種可溶性淀粉底物特異性提高的環(huán)糊精糖基轉(zhuǎn)移酶，屬于遺傳工程和酶工程領(lǐng)域。本發(fā)明將來源于P.macerans?strain?JFB05-01(CCTCC?NO:M208063)的環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶作為原始CGTase，通過在原始CGTase的N端分別融合2種自組雙親短肽，構(gòu)建了兩種融合酶——SAP1-CGTase和SAP2-CGTase。與原始CGTase相比，它們以可溶性淀粉為糖基供體時(shí)，合成AA-2G產(chǎn)量分別提高了約1.33倍和2.36倍。因此，這些融合酶比原始環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶更利于利用可溶性淀粉為糖基供體生產(chǎn)AA-2G。
【專利說明】一種可溶性淀粉底物特異性提高的環(huán)糊精糖基轉(zhuǎn)移酶
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種可溶性淀粉底物特異性提高的環(huán)糊精糖基轉(zhuǎn)移酶，尤其是一種可溶性淀粉底物特異性提高的短肽融合型環(huán)糊精糖基轉(zhuǎn)移酶及制備方法，屬于遺傳工程和酶工程領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】 [0002]L-抗壞血酸(L-AA，維生素C)是水溶性維生素，參與很多體內(nèi)的生理活動(dòng)，在保持和促進(jìn)人體健康中起到重要的作用，是人體無(wú)法自身合成的必需的營(yíng)養(yǎng)元素。但L-AA極不穩(wěn)定，在空氣中易被氧化為脫氫抗壞血酸，破壞分子中的共軛體系，發(fā)生不可逆裂解反應(yīng)，特別是在空氣、光線、熱和金屬離子的存在下，反應(yīng)更迅速，使L-AA的生理活性減弱甚至消失，這使得它在應(yīng)用上受到很大的限制。因此，如何增強(qiáng)L-AA的穩(wěn)定性是目前國(guó)內(nèi)外學(xué)術(shù)界和產(chǎn)業(yè)界所關(guān)注的焦點(diǎn)問題。
[0003]2-0- a -D-吡喃型葡萄糖基_L_抗壞血酸(AA-2G)是L-AA的糖基衍生物，是將一個(gè)糖基以α -1, 4-糖苷鍵連接于L-AA的C2位上。由于L-AA的C2位上有糖基掩蔽，不易發(fā)生氧化反應(yīng)，所以在水溶液中特別穩(wěn)定，并且AA-2G沒有直接還原性，有效地保護(hù)了 L-AA的生物活性。所以AA-2G是迄今發(fā)現(xiàn)的穩(wěn)定性和性能最佳的L-AA替代品。
[0004]目前，AA-2G主要通過糖基轉(zhuǎn)移酶生物催化生成，其中環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶(CGTase)是最常用的催化酶。通常以α _環(huán)糊精或β _環(huán)糊精為糖基供體，將葡萄糖基催化轉(zhuǎn)移到受體L-AA上。然而，若以α-環(huán)糊精為糖基供體，成本太高；若以β-環(huán)糊精為糖基供體，由于它的溶解度較低，酶促反應(yīng)效率受到較大限制。因此，選擇一種既便宜又易溶的糖基供體(如可溶性淀粉)將會(huì)大大減少AA-2G的生產(chǎn)成本，提高其利潤(rùn)。但是，由于目前環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶(CGTase)對(duì)可溶性淀粉的底物特異性(轉(zhuǎn)化率)較低，因此，通過分子改造CGTase技術(shù)提高其對(duì)可溶性淀粉的底物特異性，將推動(dòng)與L-AA糖基衍生物相關(guān)行業(yè)的快速發(fā)展。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供一種可溶性淀粉底物特異性提高的環(huán)糊精糖基轉(zhuǎn)移酶，尤其是一種可溶性淀粉底物特異性提高的短肽融合型環(huán)糊精糖基轉(zhuǎn)移酶；所述短肽融合型環(huán)糊精糖基轉(zhuǎn)移酶的氨基酸序列如SEQ ID N0.1或SEQ ID N0.2所示。
[0006]所述可溶性淀粉底物特異性提高的環(huán)糊精糖基轉(zhuǎn)移酶，是以Genbank AF047363.1所示的環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶基因序列為出發(fā)序列，在該酶的N-末端分別融合了兩種不同的自組雙親短肽，構(gòu)建了兩種短肽融合型環(huán)糊精糖基轉(zhuǎn)移酶=SAPl-CGTase和SAP2_CGTase。
[0007]所述環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶來源于軟化類芽孢桿菌(Peanibacillus macerans)。
[0008]所述SAPl-CGTase是融合了序列如SEQ ID N0.3所示自主雙親短肽的CGTase，SAPl-CGTase的氨基酸序列如SEQ ID N0.1所示；所述SAP2_CGTase是融合了序列如SEQID N0.4所示自主雙親短肽的CGTase, SAP2_CGTase的氨基酸序列如SEQ ID N0.2所示；。
[0009]產(chǎn)所述短肽融合型環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶的基因工程菌或轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系也為本發(fā)明要求保護(hù)的范圍。
[0010]本發(fā)明要解決的第二個(gè)技術(shù)問題是提供一種產(chǎn)短肽融合型環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶基因工程菌的構(gòu)建方法，具體步驟如下:
[0011]1)采用化學(xué)全合成或PCR方法克隆編碼所述短肽融合型環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶基因;
[0012]2)將步驟1)獲得的短肽融合型環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶基因連接到大腸桿菌表達(dá)載體，得到重組表達(dá)載體；
[0013]3)將步驟2)獲得的重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌Escherichia coli BL21(DE3)得到基因工程菌。
[0014]本發(fā)明要解決的第三個(gè)技術(shù)問題是提供一種所述短肽融合型環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶的生產(chǎn)制備方法，是以產(chǎn)短肽融合型環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶的大腸桿菌基因工程菌為生產(chǎn)菌株，活化后按4%接種量將種子發(fā)酵液接到含100 μ g/mL氨芐青霉素的TB液體培養(yǎng)基；在30°C搖床培養(yǎng)至OD600=0.6，加入0.1mM終濃度的IPTG誘導(dǎo)胞外表達(dá)，并在25°C搖床繼續(xù)培養(yǎng)發(fā)酵90h后，將發(fā)酵液于4°C、1000Orpm離心20min除菌體，收集富含環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶的上清液。上清液中加入70%固體硫酸銨鹽析過夜，40C、1000Orpm離心20min，取沉淀物用適量含20mM磷酸鈉、0.5M氯化鈉、20mM咪唑、pH7.4的緩沖液A溶解，并在緩沖液A中透析過夜后，通過0.22 μ m膜過濾后制成上樣樣品；Ni親和柱用緩沖液A平衡后，將上樣樣品吸入Ni柱，使之完全吸附后，分別用A、含20-480mM咪唑的緩沖液A、含480mM咪唑的緩沖液A的洗脫，流速lmL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)為280nm，分部收集含CGTase酶活的洗脫液；活力組分在50mM磷酸鈉緩沖液(pH=6)中透析過夜后，分別得到純化的融合酶SAPl-CGTase和 SAP2_CGTase。
[0015]來源于軟化類芽孢桿菌(Peanibacillus macerans) JFB05-01的環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶(CGTase)，在CGTase的N-末端分別融合兩種不同的自組雙親短肽，構(gòu)建兩種短肽融合型CGTase =SAPl-CGTase和SAP2_CGTase，它們相比于原始CGTase利用可溶性淀粉為糖基供體生產(chǎn)AA-2G時(shí)，產(chǎn)量分別提高約1.33倍和2.36倍。
[0016]本發(fā)明的有益效果:本發(fā)明構(gòu)建了 2種短肽融合型環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶，均實(shí)現(xiàn)了環(huán)糊精糖基轉(zhuǎn)移酶對(duì)可溶性淀粉的底物特異性的提高，以此為糖基供體所產(chǎn)AA-2G產(chǎn)量均高于原始CGTase，更利于AA-2G工業(yè)化生產(chǎn)。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0017]圖1 融合酶 SAP-CGTase 的構(gòu)建示意圖；(1):重組質(zhì)粒 pET_22b (+)/SAP-CGTase ；
(2)SAP-CGTase的詳細(xì)示意圖；SAP——自組雙親短肽；CGT——CGTase基因。
【具體實(shí)施方式】
[0018]實(shí)施例1底物特異性提高的短肽融合型環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶
[0019]本發(fā)明的短肽融合型環(huán)糊精糖基轉(zhuǎn)移酶是在GenBank AF047363.1公布的糊精糖基轉(zhuǎn)移酶的N-末端分別融合了六種不同的自組雙親短肽(SAP)(見表1)，構(gòu)建了六種融合酶:SAPl-CGTase到SAP6_CGTase?？梢酝ㄟ^化學(xué)全合成或融合PCR的方式構(gòu)建上述六種融合酶。短肽融合型環(huán)糊精糖基轉(zhuǎn)移酶來源于軟化類芽孢桿菌(P.macerans)JFB05-0KCCTCCNO:M208063)o
[0020]表1六種不同的自組雙親短肽的序列
【權(quán)利要求】
1.一種可溶性淀粉底物特異性提高的環(huán)糊精糖基轉(zhuǎn)移酶，是在環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶N-末端融合了自組雙親短肽，構(gòu)建短肽融合型環(huán)糊精糖基轉(zhuǎn)移酶。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的環(huán)糊精糖基轉(zhuǎn)移酶，其特征在于，是以GenbankAF047363.1所示的環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶基因序列為出發(fā)序列，在該酶的N-末端融合自組雙親短肽，構(gòu)建短肽融合型環(huán)糊精糖基轉(zhuǎn)移酶。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的環(huán)糊精糖基轉(zhuǎn)移酶，其特征在于，所述短肽融合型環(huán)糊精糖基轉(zhuǎn)移酶的氨基酸序列如SEQ ID N0.1或SEQ ID N0.2所示。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的環(huán)糊精糖基轉(zhuǎn)移酶，其特征在于，所述自組雙親短肽的氨基酸序列如SEQ ID N0.3或SEQ ID N0.4所示。
5.攜帶編碼權(quán)利要求1所述環(huán)糊精糖基轉(zhuǎn)移酶的基因的質(zhì)粒、基因工程菌和轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系。
6.一種產(chǎn)權(quán)利要求1所述酶的基因工程菌的構(gòu)建方法，具體步驟如下: 1)采用化學(xué)全合成或PCR方法克隆編碼所述短肽融合型環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶基因； 2)將步驟I)獲得的短肽融合型環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶基因連接到大腸桿菌表達(dá)載體，得到重組表達(dá)載體； 3)將步驟2)獲得的重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌Escherichiacoli BL21(DE3)得到基因工程菌。
7.一種應(yīng)用權(quán)利要求6所述方法構(gòu)建得到的大腸桿菌基因工程菌。
8.一種應(yīng)用權(quán)利要求7所述基因工程菌發(fā)酵生產(chǎn)環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶的方法，以產(chǎn)短肽融合型環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶`霉素的TB液體培養(yǎng)基；在30°C搖床培養(yǎng)至0D_=0.6，加入0.1mM終濃度的IPTG誘導(dǎo)胞外表達(dá)，并在25°C搖床繼續(xù)培養(yǎng)發(fā)酵90h后，將發(fā)酵液于4°C、1000Orpm離心20min除菌體，收集富含環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶的上清液。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于，向所述上清液中加入70%固體硫酸銨鹽析過夜，4°C、1000Orpm離心20min，取沉淀物用含20mM磷酸鈉、0.5M氯化鈉、20mM咪唑、pH7.4的緩沖液A溶解，并在緩沖液A中透析過夜后，通過0.22 μ m膜過濾后制成上樣樣品；Ni親和柱用緩沖液A平衡后，將上樣樣品吸入Ni柱，使之完全吸附后，分別用A、含20-480mM咪唑的緩沖液A、含480mM咪唑的緩沖液A的洗脫，流速lmL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)為280nm，分部收集含CGTase酶活的洗脫液；活力組分在50mM磷酸鈉緩沖液(pH=6)中透析過夜后，分別得到純化的融合酶 SAPl-CGTase 和 SAP2_CGTase。
10.權(quán)利要求1所述環(huán)糊精糖基轉(zhuǎn)移酶在生產(chǎn)2-0-a -D-吡喃型葡萄糖基-L-抗壞血酸中的應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】C12N15/70GK103589699SQ201310542063
【公開日】2014年2月19日 申請(qǐng)日期:2013年11月5日 優(yōu)先權(quán)日:2013年11月5日
【發(fā)明者】陳堅(jiān), 堵國(guó)成, 劉龍, 李江華, 韓瑞枝 申請(qǐng)人:江南大學(xué)