一種共表達(dá)l-阿拉伯糖異構(gòu)酶基因和甘露糖-6-磷酸異構(gòu)酶的基因工程菌的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種共表達(dá)L-阿拉伯糖異構(gòu)酶基因和甘露糖-6-磷酸異構(gòu)酶的基因工程菌。該菌株包含SEQIDNO：1和SEQIDNO：2所示的核苷酸序列。本發(fā)明的基因工程菌可以通過催化L-阿拉伯糖生產(chǎn)L-核糖，一步轉(zhuǎn)化，工藝簡單，轉(zhuǎn)化率高，通過本發(fā)明的基因工程菌，L-核糖的轉(zhuǎn)化率達(dá)到25~50%，具有良好的產(chǎn)業(yè)化前景。
【專利說明】一種共表達(dá)L-阿拉伯糖異構(gòu)酶基因和甘露糖-6-磷酸異構(gòu)酶的基因工程菌
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物工程【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種共表達(dá)L-阿拉伯糖異構(gòu)酶基因和甘露糖-6-磷酸異構(gòu)酶基因的基因工程菌構(gòu)建及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]核糖(Ribose，C5HltlO5)是一種典型的五碳糖，是各種核糖核酸(RNA)、核苷酸輔酶、以及ATP、NADP的組成成分，與生物遺傳的關(guān)系密切，對生物體的生理活性具有重要的調(diào)控作用。自然界中的核糖主要以D-核糖形態(tài)存在，D-核糖以呋喃糖型廣泛存在于植物和動物細(xì)胞中，D-核糖也是多種維生素、輔酶以及某些抗生素，如新霉素A、B和巴龍霉素的成分；L-核糖是與D-核糖相對的手性對映異構(gòu)體，在自然界和生物體內(nèi)并不存在，是極為昂貴的稀有糖類。純凈的L-核糖是白色晶體或白色晶體粉末，帶有甜味；可溶于水、乙醇、甲醇、不溶于乙醚、苯和丙酮。L-核糖具有良好的抗腫瘤抗病毒能力且對正常細(xì)胞的毒副作用很小。L-核糖是重要的藥物合成中間體，廣泛用于合成具有抗病毒活性的核苷類化合物，在抗艾滋病、抗病毒中間體方面顯示強(qiáng)大的潛能。L-核糖經(jīng)還原脫氧水解等加工還可生產(chǎn)2-脫氧-L-核糖，該中間體與腺嘌呤等有機(jī)堿形成的核苷衍生物在癌癥、乙肝、丙肝等疾病的治療方面也具有很大的應(yīng)用潛能。
[0003]隨著L-核糖應(yīng)用面的不斷擴(kuò)大，全球L-核糖的需求量逐年增加，人們對制備和開發(fā)適應(yīng)工業(yè)化生產(chǎn)L-核糖方法的興趣日益濃厚。隨著L-核糖應(yīng)用面的不斷擴(kuò)大，全球L-核糖的需求量逐年增加，人們對制備和開發(fā)適應(yīng)工業(yè)化生產(chǎn)L-核糖方法的興趣日益濃厚。
[0004]盡管目前采用化學(xué)法合成L-核糖，在合成步驟與收率等方面均有了較大的提高，但仍存在合成工藝路線復(fù)雜，反應(yīng)步驟繁瑣，試劑昂貴，總收率低，需使用大量有機(jī)溶劑和產(chǎn)生有害的副產(chǎn)物等問題，難以適應(yīng)工業(yè)化生產(chǎn)的要求。通過微生物或酶進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化生產(chǎn)L-核糖已成為國內(nèi)外研究熱點(diǎn)，生物轉(zhuǎn)化合成L-核糖具有立體選擇性好、反應(yīng)條件溫和、污染少等特點(diǎn)。根據(jù)原料不同可分為兩類:以核糖醇為原料和以L-阿拉伯糖為原料，其中值得提到的是近年來研究較多的以L-阿拉伯糖為原料轉(zhuǎn)化為L-核糖需要二步催化，很多研究人員致力于將L-阿拉伯糖異構(gòu)酶和甘露糖-6-磷酸異構(gòu)酶兩種酶作為一個酶催化體系，實(shí)現(xiàn)兩種酶一步催化L-阿拉伯糖生產(chǎn)L-核糖。
[0005]隨著基因工程技術(shù)的迅速發(fā)展，利用分子克隆和外源表達(dá)技術(shù)可以大幅度地提高某種工業(yè)酶在宿主微生物中的表達(dá)量，通過這種方法構(gòu)建的基因工程菌株具有普通微生物難以企及的酶催化效率；利用共表達(dá)基因工程菌株生產(chǎn)L-核糖的工藝在國內(nèi)尚沒有報道，本發(fā)明選擇自篩的發(fā)酵乳桿菌和嗜熱棲熱菌作為分子生物學(xué)操作的出發(fā)菌株，通過PCR技術(shù)從該菌株的基因組上擴(kuò)增得到了 L-阿拉伯糖異構(gòu)酶的編碼基因araA和甘露糖_6_磷酸異構(gòu)酶的編碼基因manA，利用大腸桿菌作為宿主，成功構(gòu)建了能夠高效共表達(dá)L-阿拉伯糖異構(gòu)酶和甘露糖-6-磷酸異構(gòu)酶的基因工程菌。
【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種生產(chǎn)過程簡單、條件適宜，能大幅度降低生產(chǎn)成本的基因工程菌。
[0007]本發(fā)明還要解決的技術(shù)問題是提供上述基因工程菌的構(gòu)建方法。
[0008]本發(fā)明最后要解決的技術(shù)問題，是提供上述基因工程菌的應(yīng)用。
[0009]為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采用的技術(shù)方案如下:
[0010]一種外源共表達(dá)L-阿拉伯糖異構(gòu)酶和甘露糖-6-磷酸異構(gòu)酶基因工程菌，其特征在于，其為導(dǎo)入了核苷酸序列SEQ ID NO:1 (L-阿拉伯糖異構(gòu)酶的基因序列,araA)和核苷酸序列SEQ ID NO:2 (甘露糖-6-磷酸異構(gòu)酶的基因序列，manA)的重組大腸桿菌。
[0011]上述基因工程菌的構(gòu)建方法，它包括以下步驟:
[0012](1)含有L-阿拉伯糖異構(gòu)酶基因和甘露糖-6-磷酸異構(gòu)酶基因的表達(dá)載體的構(gòu)建:
[0013]根據(jù)Genbank公布的來源于發(fā)酵乳桿菌(Lactobacillus fermentum,保藏號:CGMCC2921)和嗜熱棲熱菌(Thermus thermophilus HB8, ATCC27634)的 L-阿拉伯糖異構(gòu)酶基因和甘露糖-6-磷酸異構(gòu)酶基因的序列，運(yùn)用Vector NTI軟件設(shè)計(jì)下述引物:
[0014]araA-up:5’ GGAATTCCATATGCGTAAGATGCAAG3’ ；
[0015]araA-down:5’ GCGGTACCCTACTTGATGTTGAT3’ ；
[0016]manA-up:5’ ATATATCCATGGGTGGGGCCCCGGGTA3’ ；
[0017]manA-down:5’ AGAATTCTCACGCCCCCTCCTT3’ ；
[0018]分別提取處于對數(shù)生長期的發(fā)酵乳桿菌基因組DNA和嗜熱棲熱菌基因組DNA作為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，分別得到L-阿拉伯糖異構(gòu)酶基因和甘露糖-6-磷酸異構(gòu)酶基因的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；回收所述L-阿拉伯糖異構(gòu)酶基因和所述甘露糖-6-磷酸異構(gòu)酶基因的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，將L-阿拉伯糖異構(gòu)酶基因經(jīng)限制性內(nèi)切酶Nde I和Kpn I雙酶切，與經(jīng)過同樣雙酶切的質(zhì)粒pETDuet-01在T4連接酶的作用下進(jìn)行連接,得到重組質(zhì)粒pETDuet-araA ;將重組質(zhì)粒pETDuet-araA轉(zhuǎn)化至感受態(tài)大腸桿菌BL21 (DE3)中，涂布含有100μ g/mL氨節(jié)青霉素的LB固體培養(yǎng)基，37°C培養(yǎng)12~16h得到單克??；
[0019](2)經(jīng)抗性培養(yǎng)基篩選得到陽性克隆:
[0020]分別挑取單克隆于5mL含有100 μ g/mL氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37°C、200rpm培養(yǎng)過夜，獲得L-阿拉伯糖異構(gòu)酶基因工程菌；
[0021](3)對L-阿拉伯糖異構(gòu)酶基因工程菌進(jìn)行質(zhì)粒提取:
[0022]對(I)中回收的甘露糖-6-磷酸異構(gòu)酶基因用限制性內(nèi)切酶Nco I和EcoR I雙酶切，再與經(jīng)過同樣雙酶切的質(zhì)粒pETDuet-araA在T4連接酶的作用下進(jìn)行連接,得到共表達(dá)質(zhì)粒 pETDuet-araA-manA ；
[0023](4)將共表達(dá)質(zhì)粒pETDuet-araA-manA轉(zhuǎn)化至宿主細(xì)胞中:
[0024]將共表達(dá)質(zhì)粒pETDuet-araA-manA轉(zhuǎn)化至感受態(tài)大腸桿菌BL21 (DE3)中，涂布含有100μ g/mL氨芐青霉素的LB固體培養(yǎng)基，37°C培養(yǎng)12~16h得到單克?。?br> [0025](5)經(jīng)抗性培養(yǎng)基篩選得到陽性克隆:
[0026]分別挑取單克隆于5mL含有100 μ g/mL氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37°C、200rpm培養(yǎng)過夜，獲得共表達(dá)L-阿拉伯糖異構(gòu)酶和甘露糖_6_磷酸異構(gòu)酶的基因工程菌。
[0027] 其中，PCR擴(kuò)增體系為:基因組?ΝΑ2μL, araA-up/manA-up和 araA-down/manAdown各 2 μ L，dNTP4 μ L，10 X Taq 緩沖液 5 μ L，Taq 酶 I μ L，ddH2034 μ L ；
[0028]PCR反應(yīng)程序?yàn)?94°C預(yù)變性2min ;94°C變性30s，然后55°C退火30s，72°C延伸2min，循環(huán)35次；最后72°C延伸IOmin0
[0029]上述的基因工程菌在制備L-核糖中的應(yīng)用。
[0030]利用上述基因工程菌，以L-阿拉伯糖為底物制備L-核糖的工藝如下:
[0031](I)基因工程菌的誘變表達(dá):將所述基因工程菌接種于LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)過夜，然后以0.5~10%(v/v)的接種量轉(zhuǎn)接入LB培養(yǎng)基中，20~40°C發(fā)酵培養(yǎng)I~3h，再加入終濃度0.1~10g/L的乳糖或終濃度0.1~1.5mM的異丙基-β -D-硫代吡喃半乳糖苷，并置于20~40°C下誘導(dǎo)表達(dá)3~48h，離心收集菌體；
[0032]或者將所述基因工程菌接種于LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)過夜，然后以0.5~10%(v/V)的接種量轉(zhuǎn)接入發(fā)酵培養(yǎng)基中，直接于20~40°C下誘導(dǎo)表達(dá)3~48h，離心收集菌體，其中，所述的發(fā)酵培養(yǎng)基包含質(zhì)量比2:1:2的乳糖、蛋白胨或酵母粉和NaCl，pH值為4~10，經(jīng)高壓濕熱滅菌處理；
[0033](2)轉(zhuǎn)化反應(yīng):以25~100g/L L-阿拉伯糖為底物，加入(I)中誘導(dǎo)后的基因工程菌進(jìn)行轉(zhuǎn)化反應(yīng)，用量以濕菌計(jì)為10~100g/L，pH值為5~12，反應(yīng)溫度40~80°C，轉(zhuǎn)化時間12~48h，反應(yīng)結(jié)束后，液相檢測L-核糖的含量；
[0034]或者，以25~100g/L L-阿拉伯糖為底物，加入I~15mmol/L Mn2+離子和0.2~5mmol/L Co2+離子，然后加入(I)中誘導(dǎo)后的基因工程菌進(jìn)行轉(zhuǎn)化反應(yīng)，用量以濕菌計(jì)為10~100g/L，pH值為5~12，反應(yīng)溫度40~80°C，轉(zhuǎn)化時間12~48h，反應(yīng)結(jié)束后，液相檢測L-核糖的含量。
[0035]上述的LB培養(yǎng)基包含質(zhì)量比2:1:2的蛋白胨、酵母粉和NaCl。
[0036]有益效果:本發(fā)明的L-阿拉伯糖異構(gòu)酶和甘露糖-6-磷酸異構(gòu)酶共表達(dá)基因工程菌在適宜條件下可以通過催化L-阿拉伯糖生產(chǎn)L-核糖，一步轉(zhuǎn)化，節(jié)約反應(yīng)時間，轉(zhuǎn)化率高，通過本發(fā)明的基因工程菌，L-核糖的轉(zhuǎn)化率達(dá)到25~60%，具有良好的產(chǎn)業(yè)化前景，低濃度Mn2+和Co2+離子的添加可以大幅度提高酶的酶活力，添加I~15mmol/L Mn2+離子和0.2~5mmol/L Fe2+離子后比不添加金屬離子的對照組酶活提高58%。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0037]圖1araA產(chǎn)物PCR的瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證，泳道I~2為araA產(chǎn)物PCR，3為標(biāo)準(zhǔn)DNA分子量，自上而下的條帶分別為(kb):15.0,10.0,7.5,5.0,2.5，1.0。
[0038]圖2manA產(chǎn)物PCR的瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證，泳道I為標(biāo)準(zhǔn)DNA分子量，自上而下的條帶分別為(kb): 15.0，10.0，7.5，5.0，2.5，1.0，泳道 2 ~3 為 manA 產(chǎn)物 PCR。
[0039]圖3重組質(zhì)粒pETDuet-araA核酸膠驗(yàn)證,其中泳道I~4為重組質(zhì)粒I~4號對araA的PCR產(chǎn)物，泳道5為標(biāo)準(zhǔn)DNA分子量，自上而下的條帶分別為(kb): 15.0,10.0,7.5，5.0,2.5,1.0o泳道6為空質(zhì)粒pETDuet-01的Nde I單切產(chǎn)物，泳道7~10為重組質(zhì)粒I~4號的Nde I單切產(chǎn)物。
[0040]圖4共表達(dá)質(zhì)粒pETDuet-araA-manA的構(gòu)建示意圖。[0041]圖5共表達(dá)質(zhì)粒pETDuet-araA-manA的PCR驗(yàn)證泳道I~6為共表達(dá)質(zhì)粒I~6號對araA的PCR產(chǎn)物，泳道7~12為共表達(dá)質(zhì)粒I~6對manA的PCR產(chǎn)物，泳道13為標(biāo)準(zhǔn)DNA分子量，自上而下的條帶分別為(kb):15.0，10.0，7.5，5.0，2.5，1.0。
[0042]圖6共表達(dá)質(zhì)粒pETDuet-araA-manA的雙酶切驗(yàn)證，泳道I為標(biāo)準(zhǔn)DNA分子量，自上而下的條帶分別為(kb):15.0，10.0，7.5，5.0，2.5，1.0。泳道2~3分別為共表達(dá)質(zhì)粒2號的Nde I和Kpn I，Nco I和EcoR I雙切產(chǎn)物，泳道4~5分別為共表達(dá)質(zhì)粒3號的NdeI和Kpn I, Nco I和EcoR I雙切產(chǎn)物。
[0043]圖7L-阿拉伯糖異構(gòu)酶和甘露糖-6-磷酸異構(gòu)酶共表達(dá)菌株誘導(dǎo)表達(dá)SDS-PAGE圖，泳道M為標(biāo)準(zhǔn)蛋白分子量，泳道I~2分別為共表達(dá)菌株上清和全細(xì)胞。
[0044]圖8產(chǎn)物混合樣的液相檢測圖譜。
【具體實(shí)施方式】
[0045]根據(jù)下述實(shí)施例，可以更好地理解本發(fā)明。然而，本領(lǐng)域的技術(shù)人員容易理解，實(shí)施例所描述的內(nèi)容僅用于說明本發(fā)明，而不應(yīng)當(dāng)也不會限制權(quán)利要求書中所詳細(xì)描述的本發(fā)明。
[0046]實(shí)施例1:含有L-阿拉伯糖異構(gòu)酶基因和甘露糖-6-磷酸異構(gòu)酶基因的共表達(dá)質(zhì)粒載體的構(gòu)建。
[0047]根據(jù)Genbank上已報道的來源于發(fā)酵乳桿菌(Lactobacillus fermentum,保藏號:CGMCC2921)和嗜熱棲熱菌(Thermus thermophilus HB8, ATCC27634)的 L-阿拉伯糖異構(gòu)酶基因和甘露糖-6-磷酸異構(gòu)酶基因的序列，運(yùn)用Vector NTI軟件設(shè)計(jì)引物，引物序列如表1所示: [0048]表1引物序列
[0049]
引物序列(方向，$10 3)用迂
OGAATTCCATATGCGTAAGATGCAAG ( 1、:)、i Nde I)? ?木?φ)
GCGGTACCCTACTTGATGTTGAT(.、.如線為 Kpn I)'JiPt uraA(araA-down)
ATATATCCATGGGTGGG(X:C:CC:GGGTA (下劃線:)} Nco I)克降 manA {manA-up)
XLAVTTC Il'ACXjCXXXX: ICC I' !' ( 1、.劃線 'k hcoR I)丨 manA (/"<r"7/1-d(nvn )
[0050]按照生產(chǎn)商提供的使用說明書，用Genomic DNA Purification Kit (Takara,大連)抽提處于對數(shù)生長期的發(fā)酵乳桿菌NXTagl (Lactobacillus fermentum,保藏號:CGMCC2921，其公開于專利文獻(xiàn)ZL200910025982.9)和嗜熱棲熱菌(Thermus thermophilus,HB8, ATCC27634)的基因組DNA，并用1% (10g/L)瓊脂糖凝膠電泳對所獲得的基因組DNA進(jìn)行檢測，分別以提取的發(fā)酵乳桿菌基因組DNA和嗜熱棲熱菌基因組DNA作為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。
[0051]PCR (聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng))的擴(kuò)增體系為:基因組DNA2 μ L，引物araA-up (manA-up)和引物 araA-down (manAdown)各 2 μ L, dNTP4 μ L, 10 X Taq 緩沖液 5 μ L, Taq 酶 I μ L，ddH2034 μ L ；
[0052]PCR反應(yīng)程序?yàn)?94°C預(yù)變性2min ;94°C變性30s，然后55°C退火30s，72°C延伸2min，循環(huán)35次；最后72°C延伸IOmin ；
[0053]將PCR產(chǎn)物于1% (10g/L)瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證，結(jié)果見圖1和圖2。發(fā)現(xiàn)分別與預(yù)期分子量(1424bp和900bp)大小相符的DNA條帶后分別用Axygen公司的柱式割膠回收試劑盒回收。
[0054]用預(yù)先設(shè)計(jì)在引物序列中酶切位點(diǎn)所對應(yīng)的限制性內(nèi)切酶對(2)中獲得的PCR產(chǎn)物araA進(jìn)行酶切反應(yīng)。所用的限制性內(nèi)切酶是EcoRI和Hind III。酶切體系為:PCR產(chǎn)物12.5 μ L, Nde Il μ L, Kpn Il μ L，IOXM 緩沖液 2.5 μ L，ddH208 μ L,總體積 25 μ L。將酶切后的PCR產(chǎn)物經(jīng)過DNA純化試劑盒純化。
[0055]使用同樣的限制性內(nèi)切酶和酶切體系對pETDuet-01質(zhì)粒進(jìn)行酶切，由于所選用的兩個酶切位點(diǎn)在pETDuet-01質(zhì)粒的多克隆位點(diǎn)(Multiple Cloning Site, MCS)上相距很近(約20bp)，因此酶切之后的質(zhì)粒只需要經(jīng)過DNA純化試劑盒即可達(dá)到純化的目的。
[0056]將經(jīng)過純化的PCR產(chǎn)物和pETDuet-01質(zhì)粒進(jìn)行連接。連接反應(yīng)體系為:酶切純化的PCR產(chǎn)物6 μ L，酶切純化的pETDuet-01質(zhì)粒2 μ L，T4連接酶I μ L，10ΧΤ4連接酶緩沖液I μ L。在37°C連接2h后即可獲得重組質(zhì)粒pETDuet-araA。
[0057]重組質(zhì)粒pETDuet-araA轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌細(xì)胞使用氯化鈣法:
[0058](I)取 10 μ L 重組質(zhì)粒 pETDuet-araA 于 5O μ L 大腸桿菌 Escherichia coliBL21 (DE3)感受態(tài)細(xì)胞中，冰浴30min。
[0059](2) 42°C水浴熱激90s，快速置于冰上2~3min。
[0060](3)加入新鮮LB液體培養(yǎng)基800 μ L，于37°C振蕩培養(yǎng)45min。
[0061](4)取200 μ L菌體涂布于含有100 μ g/mL氨芐青霉素的LB固體培養(yǎng)基表面。37 °C培養(yǎng)12~16h至單菌落出現(xiàn)。
[0062]重組子pETDuet-araA的鑒定:將單菌落接種于含有氨節(jié)青霉素(100 μ g/mL)的LB液體培養(yǎng)基中37°C過夜培養(yǎng)并分別提取質(zhì)粒，對各質(zhì)粒進(jìn)行菌落PCR驗(yàn)證，再按照“限制性酶切反應(yīng)，純化及連接反應(yīng)”中的酶切體系和條件用Nde I對空質(zhì)粒pETDuet-01和重組質(zhì)粒pETDuet-araA分別進(jìn)行單酶切，將菌落PCR產(chǎn)物和酶切產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳鑒定，結(jié)果如圖3所示。實(shí)驗(yàn)結(jié)果說明獲得的重組質(zhì)粒pETDuet-araA是正確的。
[0063]經(jīng)電泳結(jié)果證實(shí),該陽性克隆菌落含有DNA片段插入質(zhì)粒pETDuet-araA,含此重組質(zhì)粒PETDuet-araA的重組大腸桿菌即為轉(zhuǎn)化的重組大腸桿菌BL21_araA。測序結(jié)果顯示插入片段含有一個長1424bp的開放閱讀框架(Open Reading Frame, 0RF)。
[0064]manA基因的限制性酶切反應(yīng),純化及連接反應(yīng):用預(yù)先設(shè)計(jì)在引物序列中酶切位點(diǎn)所對應(yīng)的限制性內(nèi)切酶對獲得的PCR產(chǎn)物manA和重組質(zhì)粒pETDuet-araA進(jìn)行酶切反應(yīng)。所用的限制性內(nèi)切酶是Nco I和EcoR I。酶切體系為:PCR產(chǎn)物12.5yL，Nco IlyL,EcoR IlyL, 10XM緩沖液2.5 μ L, ddH208 μ L，總體積25 μ L。將酶切后的PCR產(chǎn)物和重組質(zhì)粒經(jīng)過DNA純化試劑盒純化。
[0065]將經(jīng)過純化的PCR產(chǎn)物和pETDuet-araA重組質(zhì)粒進(jìn)行連接。連接反應(yīng)體系為:酶切純化的PCR產(chǎn)物5 μ L，酶切純化的pETDuet-araA質(zhì)粒3 μ L，T4連接酶I μ L，10 X Τ4連接酶緩沖液I μ L。在37°C連接2h后即可獲得共表達(dá)質(zhì)粒pETDuet-araA-manA,其主要結(jié)構(gòu)如圖4所示。
[0066]共表達(dá)質(zhì)粒pETDuet-araA-manA轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌細(xì)胞使用氯化鈣法,方法同上述重組質(zhì)粒pETDuet-araA轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌細(xì)胞使用的氯化鈣法。
[0067]重組子pETDuet-araA-lacZ的鑒定:將單菌落接種于含有氨節(jié)青霉素(100 μ g/mL)的LB液體培養(yǎng)基中37 °C過夜培養(yǎng)并分別提取質(zhì)粒，對各質(zhì)粒進(jìn)行菌落PCR驗(yàn)證，再按照上述的限制性酶切、純化及連接反應(yīng)中的酶切體系和條件分別用Nde I和ΚρηΙ，NcoI和EcoRI對共表達(dá)質(zhì)粒pETDuet-araA-manA進(jìn)行雙酶切，將菌落PCR產(chǎn)物和雙酶切產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳鑒定。鑒定結(jié)果見圖5和圖6，實(shí)驗(yàn)結(jié)果說明獲得的共表達(dá)質(zhì)粒pETDuet-araA-manA3 號是正確的。
[0068]經(jīng)電泳結(jié)果證實(shí)，如圖5和圖6所示，該陽性克隆菌落含有DNA片段插入質(zhì)粒pETDuet-araA-manA,含此共表達(dá)質(zhì)粒pETDuet-araA-manA的重組大腸桿菌即為轉(zhuǎn)化的重組大腸桿菌BL21-araA-manA。測序結(jié)果顯示插入片段含有一個長1424bp的開放閱讀框架(Open Reading Frame, ORF)和一個長900bp的開放閱讀框架。
[0069]實(shí)施例2:基因工程菌的誘導(dǎo)表達(dá)。
[0070]采用兩種方式對實(shí)施例1中獲得的基因工程菌誘導(dǎo)表達(dá):
[0071 ] (I)配制種子液1L，培養(yǎng)基為LB液體培養(yǎng)基(蛋白胨10g/L、酵母粉5g/L、NaCl IOg/L，經(jīng)121°C高壓濕熱滅菌30min后裝入數(shù)個500mL廣口三角瓶中。用接種針向種子液接入一環(huán)實(shí)施例1中基因工程菌菌種，并置于37°C搖床以200rpm的轉(zhuǎn)速過夜培養(yǎng)。配制含有蛋白胨10g/L、酵母粉5g/L、NaC110g/L的LB培養(yǎng)基1000mL,分裝于容量500mL的廣口三角瓶中，每瓶的裝液量為IOOmL ;將`上述LB培養(yǎng)基于121 °C高壓濕熱滅菌30min。待培養(yǎng)基冷卻后接入過夜培養(yǎng)的種子液lmL，將三角瓶置于37°C搖床以200rpm的轉(zhuǎn)速培養(yǎng)，約1.5h后加入終濃度為0.1~10g/L的乳糖或者終濃度為ImM的IPTG (異丙基-β -D-硫代吡喃半乳糖苷)，并置于37°C搖床以200rpm轉(zhuǎn)速進(jìn)行誘導(dǎo)作用6h，得到共表達(dá)基因工程菌發(fā)酵液A，發(fā)酵液離心收集得到共表達(dá)基因工程菌菌體A。
[0072](2 )配制種子液1L，培養(yǎng)基為LB液體培養(yǎng)基(蛋白胨10g/L、酵母粉5g/L、NaCl IOg/L，用NaOH調(diào)節(jié)pH值為7.0)，經(jīng)121°C高壓濕熱滅菌30min后裝入數(shù)個500mL廣口三角瓶中。用接種針向種子液接入一環(huán)基因工程菌菌種，并置于37°C搖床以200rpm的轉(zhuǎn)速過夜培養(yǎng)。配制含有乳糖10g/L、蛋白胨(或酵母粉)5g/L、氯化鈉10g/L的發(fā)酵培養(yǎng)基lOOOmL，分裝于容量500mL的廣口三角瓶中，每瓶的裝液量為IOOmL ;將上述發(fā)酵培養(yǎng)基于121°C高壓濕熱滅菌30min。待培養(yǎng)基冷卻后接入過夜培養(yǎng)的種子液lmL，將三角瓶置于25°C搖床以200rpm的轉(zhuǎn)速培養(yǎng)，乳糖既作碳源又作為誘導(dǎo)劑，進(jìn)行誘導(dǎo)作用22h，得到共表達(dá)基因工程菌發(fā)酵液B。發(fā)酵液離心收集，得到共表達(dá)基因工程菌菌體B，通過SDS-PAGE檢測，結(jié)果如圖7所示。
[0073]實(shí)施例3:金屬離子種類及濃度對共表達(dá)L-阿拉伯糖異構(gòu)酶和甘露糖-6-磷酸異構(gòu)酶基因工程菌株酶活的影響。
[0074]向ImLlOOmM磷酸鈉緩沖溶液(pH6.5)中添加L-阿拉伯糖至終濃度為IOOmM,再加入共表達(dá)基因工程菌菌體12mg，各金屬離子的添加終濃度為ImM或者10mM，65°C水浴20min,通過HPLC測定生成的L-核糖的生成量，測定結(jié)果如表2所示(以未添加金屬離子組為對照，設(shè)定酶活為100%)。
[0075]表2不同金屬離子及濃度對共表達(dá)基因工程菌株酶活力的影響
【權(quán)利要求】
1.一種共表達(dá)L-阿拉伯糖異構(gòu)酶基因和甘露糖-6-磷酸異構(gòu)酶的基因工程菌，其特征在于，其為導(dǎo)入了核苷酸序列SEQ ID NO:1和核苷酸序列SEQ ID NO:2的重組大腸桿菌。
2.權(quán)利要求1所述的基因工程菌的構(gòu)建方法，其特征在于，它包括以下步驟: (1)含有L-阿拉伯糖異構(gòu)酶基因和甘露糖-6-磷酸異構(gòu)酶基因的表達(dá)載體的構(gòu)建: 根據(jù)Genbank公布的來源于發(fā)酵乳桿菌和嗜熱棲熱菌的L-阿拉伯糖異構(gòu)酶基因和甘露糖-6-磷酸異構(gòu)酶基因的序列,運(yùn)用Vector NTI軟件設(shè)計(jì)下述引物: araA-up:5’ GGAATTCCATATGCGTAAGATGCAAG3’ ； araA-down:5’ GCGGTACCCTACTTGATGTTGAT3’ ； manA-up:5’ ATATATCCATGGGTGGGGCCCCGGGTA3’ ； manA-down:5’ AGAATTCTCACGCCCCCTCCTT3’ ； 分別提取處于對數(shù)生長期的發(fā)酵乳桿菌基因組DNA和嗜熱棲熱菌基因組DNA作為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，分別得到L-阿拉伯糖異構(gòu)酶基因和甘露糖-6-磷酸異構(gòu)酶基因的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；回收所述L-阿拉伯糖異構(gòu)酶基因和所述甘露糖-6-磷酸異構(gòu)酶基因的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，將L-阿拉伯糖異構(gòu)酶基因經(jīng)限制性內(nèi)切酶Nde I和Kpn I雙酶切，與經(jīng)過同樣雙酶切的質(zhì)粒pETDuet-ΟΙ在T4連接酶的作用下進(jìn)行連接,得到重組質(zhì)粒pETDuet-araA ;將重組質(zhì)粒pETDuet-araA轉(zhuǎn)化至感受態(tài)大腸桿菌BL21 (DE3)中，然后涂布于含有100yg/mL氨芐青霉素的LB固體培養(yǎng)基，37°C培養(yǎng)12~16h得到單克??； (2)經(jīng)抗性培養(yǎng)基篩選得到陽性克隆: 分別挑取單克隆于5mL含有IOOy g/mL氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37°C、200rpm培養(yǎng)過夜，獲得L-阿拉伯糖異構(gòu)酶基因工程菌；` (3)對L-阿拉伯糖異構(gòu)酶基因工程菌進(jìn)行質(zhì)粒提取: 對(I)中回收的甘露糖-6-磷酸異構(gòu)酶基因用限制性內(nèi)切酶Nco I和EcoR I雙酶切，再與經(jīng)過同樣雙酶切的質(zhì)粒pETDuet-araA在T4連接酶的作用下進(jìn)行連接,得到共表達(dá)質(zhì)粒 pETDuet-araA-manA ； (4)將共表達(dá)質(zhì)粒pETDuet-araA-manA轉(zhuǎn)化至宿主細(xì)胞中: 將共表達(dá)質(zhì)粒pETDuet-araA-manA轉(zhuǎn)化至感受態(tài)大腸桿菌BL21 (DE3 )中，涂布于含有100 μ g/mL氨芐青霉素的LB固體培養(yǎng)基，37°C培養(yǎng)12~16h得到單克隆； (5)經(jīng)抗性培養(yǎng)基篩選得到陽性克隆: 分別挑取單克隆于5mL含有100 μ g/mL氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37°C、200rpm培養(yǎng)過夜，獲得共表達(dá)L-阿拉伯糖異構(gòu)酶和甘露糖-6-磷酸異構(gòu)酶的基因工程菌。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的基因工程菌的構(gòu)建方法，其特征在于，其中PCR擴(kuò)增體系為:基因組 DNA2 μ L, araA-up/ manA-up 和 araA-down/manAdown 各 2 μ L, dNTP4 yL,10XTaq 緩沖液 5 μ L, Taq 酶 I μ L, ddH2034 μ L ； PCR反應(yīng)程序?yàn)?94°C預(yù)變性2min ;94°C變性30s，然后55°C退火30s，72°C延伸2min，循環(huán)35次；最后72°C延伸lOmin。
4.權(quán)利要求1所述的基因工程菌在制備L-核糖中的應(yīng)用。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的應(yīng)用，其特征在于，利用基因工程菌，以L-阿拉伯糖為底物制備L-核糖的工藝如下: (I)基因工程菌的誘變表達(dá):將所述基因工程菌接種于LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)過夜，然后以0.5~10%(v/v)的接種量轉(zhuǎn)接入LB培養(yǎng)基中，20~40°C發(fā)酵培養(yǎng)I~3h，再加入終濃度終濃度0.1~10g/L的乳糖或者0.1~1.5mM的異丙基-β -D-硫代吡喃半乳糖苷，并置于20~40°C下誘導(dǎo)表達(dá)3~48h,離心收集菌體； 或者將所述基因工程菌接種于LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)過夜，然后以0.5~10%(v/v)的接種量轉(zhuǎn)接入發(fā)酵培養(yǎng)基中，于20~40°C下誘導(dǎo)表達(dá)3~48h，離心收集菌體，其中，所述的發(fā)酵培養(yǎng)基包含質(zhì)量比2:1:2的乳糖、蛋白胨或酵母粉和NaCl，pH值為4~10，經(jīng)高壓濕熱滅菌處理； (2)轉(zhuǎn)化反應(yīng):以25~100g/L L-阿拉伯糖為底物，加入(I)中誘導(dǎo)后的基因工程菌進(jìn)行轉(zhuǎn)化反應(yīng)，用量以濕菌計(jì)為10~100g/L，pH值為5~12，反應(yīng)溫度40~80°C，轉(zhuǎn)化時間12~48h，反應(yīng)結(jié)束后，液相檢測L-核糖的含量； 或者，以25~100g/L L-阿拉伯糖為底物，加入I~15mmol/L Mn2+離子和0.2~5mmol/L Co2+離子，然后加入(I)中誘導(dǎo)后的基因工程菌進(jìn)行轉(zhuǎn)化反應(yīng)，用量以濕菌計(jì)為10~100g/L，pH值為5~12，反應(yīng)溫度40~80°C，轉(zhuǎn)化時間12~48h，反應(yīng)結(jié)束后，液相檢測L-核糖的含量。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的應(yīng)用，其特征在于，步驟(1)中所述的LB培養(yǎng)基包含質(zhì)量比為2:1:2的蛋白胨、酵母粉和NaCl。
【文檔編號】C12R1/19GK103555646SQ201310519792
【公開日】2014年2月5日 申請日期:2013年10月29日 優(yōu)先權(quán)日:2013年10月29日
【發(fā)明者】徐虹, 詹伊婧, 徐錚, 李莎, 馮小海 申請人:南京工業(yè)大學(xué)