一種檢測血管內(nèi)皮生長因子c在真核細胞cho 中的表達方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種檢測血管內(nèi)皮生長因子C在真核細胞CHO中的表達方法。根據(jù)人VEGF-CcDNA的序列,設計合成一對特異性引物,用RT-PCR法克隆乳腺癌細胞MCF-7VEGF-C基因的cDNA,回收PCR產(chǎn)物連接于克隆載體。本發(fā)明的有益效果是，基因測序能夠證實RT-PCR產(chǎn)物包含VEGF-CcDNA全長。重組pcDNA3.1(-)中含有VEGF-CcDNA全長序列,Western-blotting檢測到細胞培養(yǎng)上清中以及細胞內(nèi)有VEGF-C蛋白存在。結論:成功構建了人類VEGF-C真核表達載體并檢測到載體在真核細胞中的表達。
【專利說明】—種檢測血管內(nèi)皮生長因子C在真核細胞CHO中的表達方法
【技術領域】
[0001]本發(fā)明涉及一種生化的檢測方法，具體來說，一種檢測血管內(nèi)皮生長因子C在真核細胞CHO中的表達方法。
【背景技術】
[0002]血管內(nèi)皮生長因子C(VEGF -C)屬VEGF/PDGF家族成員，其受體為VEGFR -2，VEGFR -3。VEGF通過VEGFR -2調(diào)節(jié)血管和淋巴管的增生，而VEGFR-3表達則局限于淋巴管內(nèi)皮，VEGF -C為VEGFR-2的結合，產(chǎn)生生物學效應的所需濃度遠高于VEGFR -C，因此，VEGFR -3是淋巴管增生特異性調(diào)節(jié)因子，用VEGF -C轉基因鼠實驗證實，VEGF-C的高表達可以選擇性地引起淋巴管增生[2]，經(jīng)研究，VEGF -C表達與腫瘤淋巴管增生和轉移的關系是VEGF -C高表達可促進腫瘤的淋巴轉移，其機理是VEGF -C促進了腫瘤周圍及間質(zhì)的淋巴管生長以及腫瘤組織中淋巴管增生。為進一步研究VEGF -C在淋巴管增生中的作用及其機制，我們構建了攜帶人VEGF -C cDNA的基因片段的真核表達載體，研究了它在真核細胞內(nèi)的表達，為探討VEGF -C與淋巴管增生的關系，VEGF -C基因用于治療淋巴水腫和某些癌腫的可行性提供實驗依據(jù)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003]為克服上述技術問題，我們提出了以下技術方案:
一種檢測血管內(nèi) 皮生長因子C在真核細胞CHO中的表達方法，根據(jù)人VEGF -C CDNA的序列，設計合成一對特異性引物，用RT -PCR法克隆乳腺癌細胞MCF - 7VEGF -C基因的cDNA，回收PCR產(chǎn)物連接于克隆載體。
[0004]本發(fā)明中，在所述步驟之后要擴增，質(zhì)粒提取，酶切鑒定并進行基因序列鑒定；酶切回收VEGF -C cDNA全長的基因片段，與真核表達載體pcDNA3.1(-)連接稱重組質(zhì)粒進行酶切鑒定；采用脂質(zhì)體轉染法將構建的pcDNA3.1(-)/VEGF -C轉染至CHO細胞中，G418加壓篩選培養(yǎng)；最后用Western -blotting法檢測細胞培養(yǎng)上清以及裂解細胞中的VEGF -C蛋白。
[0005]本發(fā)明的有益效果是，基因測序能夠證實RT -PCR產(chǎn)物包含VEGF -C cDNA全長。重組pcDNA3 ? 1(-)中含有VEGF -C cDNA全長序列，Western -blotting檢測到細胞培養(yǎng)上清中以及細胞內(nèi)有VEGF -C蛋白存在。結論:成功構建了人類VEGF -C真核表達載體并檢測到載體在真核細胞中的表達。
【具體實施方式】
[0006]根據(jù)人VEGF -C cDNA的序列，設計合成一對特異性引物，用RT -PCR法克隆乳腺癌細胞MCF - 7VEGF -C基因的cDNA，回收PCR產(chǎn)物連接于克隆載體。擴增，質(zhì)粒提取，酶切鑒定并進行基因序列鑒定。酶切回收VEGF -C cDNA全長的基因片段，與真核表達載體pcDNA3.1(-)連接稱重組質(zhì)粒進行酶切鑒定。采用脂質(zhì)體轉染法將構建的pcDNA3.l(-)/VEGF -C轉染至CHO細胞中，G418加壓篩選培養(yǎng)。最后用Western -blotting法檢測細胞培養(yǎng)上清以及裂解細胞中的VEGF -C蛋白。
[0007]以上所述，僅為本發(fā)明較佳的【具體實施方式】，但本發(fā)明的保護范圍并不局限于此，任何熟悉本【技術領域】的技術人員在本發(fā)明披露的技術范圍內(nèi)，根據(jù)本發(fā)明的技術方案及其發(fā)明構思加以等同替換或改變，都應涵蓋在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。
【權利要求】
1.一種檢測血管內(nèi)皮生長因子C在真核細胞CHO中的表達方法，其特征在于，根據(jù)人VEGF -C cDNA的序列，設計合成一對特異性引物，用RT -PCR法克隆乳腺癌細胞MCF -7VEGF -C基因的cDNA，回收PCR產(chǎn)物連接于克隆載體。
2.如權利要求1所述的一種檢測血管內(nèi)皮生長因子C在真核細胞CHO中的表達方法，其特征在于，在所述步驟之后要擴增，質(zhì)粒提取，酶切鑒定并進行基因序列鑒定；酶切回收VEGF -C cDNA全長的基因片段，與真核表達載體pcDNA3.1 (_)連接稱重組質(zhì)粒進行酶切鑒定；采用脂質(zhì)體轉染法將構建的pcDNA3.1(-)/VEGF -C轉染至CHO細胞中，G418加壓篩選培養(yǎng)；最后用Western -blotting法檢測細胞培養(yǎng)上清以及裂解細胞中的VEGF -C蛋白。
【文檔編號】C12Q1/68GK103614460SQ201310519068
【公開日】2014年3月5日 申請日期:2013年10月29日 優(yōu)先權日:2013年10月29日
【發(fā)明者】王景文 申請人:王景文