一種檢測赭曲霉毒素a的方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種檢測赭曲霉毒素A的方法，該方法利用固定在光子晶體微球上的核酸適配體序列與其熒光標(biāo)記互補序列進(jìn)行雜交，通過加入待測樣品，利用芯片掃描儀對加入樣品前后的熒光信號進(jìn)行檢測；根據(jù)測得的熒光信號的變化值對樣品中的赭曲霉毒素A進(jìn)行檢測。該方法對赭曲霉毒素A的檢測限為0.001ng/mL，線性檢測范圍為0.001到1ng/mL之間，僅僅需要2μL試樣。
【專利說明】—種檢測赭曲霉毒素A的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及農(nóng)產(chǎn)品、飼料和食品中的真菌毒素快速、高通量、低成本檢測技術(shù)方法。具體通過谷物中典型的赭曲霉毒素A為檢測對象，利用三維光子晶體微球為載體，通過核酸適配體識別技術(shù)和熒光分析技術(shù)相結(jié)合構(gòu)建液相芯片檢測新技術(shù)。
【背景技術(shù)】
[0002]赭曲霉毒素(Ochratoxin)是曲霉屬和青霉屬等產(chǎn)毒菌株產(chǎn)生的一種有毒的次級代謝產(chǎn)物。自然界中產(chǎn)生赭曲霉毒素的真菌種類繁多，主要以純綠青霉(Penieilliumverrucosum)、赫曲霉(AspergiIIusochraceus)、和碳黑曲霉(Carbonarius)為主。赭曲霉毒素主要包括A、B、C、D等7種結(jié)構(gòu)類似物，其中毒性最強(qiáng)、最為常見、分布最廣的是赭曲霉毒素A(0Chrat0xin A, OTA) ATA對食品污染的范圍較廣，包括谷物及谷物產(chǎn)品、豆類、咖啡豆、葡萄干、葡萄汁和啤酒等。赭曲霉毒素具有腎臟毒性、肝臟毒性、免疫毒性，不但會引起人畜的急、慢性中毒，還具有致癌、致畸、致突變的潛在危害。OTA被認(rèn)為是危害性僅次于黃曲霉毒素的真菌毒素。1993年，國際癌癥研究機(jī)構(gòu)(The International Agencyfor Research on Cancer, IARC)將其定為IIB類致癌物。鑒于OTA的毒性，會給人類和動物的健康帶來巨大威脅，因此世界上許多國家和組織都很重視對OTA的控制，制定了食品、飼料中赭曲霉毒素的相關(guān)法規(guī)和限量標(biāo)準(zhǔn)，并積極研究相關(guān)檢測方法。目前常用的檢測方法有薄層色譜法(TLC)、氣相色譜法(GC)、液相色譜法(HPLC)、毛細(xì)管電泳技術(shù)(CE)、酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)等。這些常用的檢測方法對赭曲霉毒素A的檢測起著非常重要的作用，但是這些方法或多或少存在一些缺陷如:樣品前處理復(fù)雜、儀器昂貴、靈敏度低等，而且隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展以及檢測水平的提高，對食品中的赭曲霉毒素A限量標(biāo)準(zhǔn)的要求也在不斷地提高，傳統(tǒng)的檢測方法已不能滿足現(xiàn)在的檢測需求。因此建立一種快速、高通量、高靈敏度、成本低、特異性好的檢測方法，從而對農(nóng)產(chǎn)品中存在的真菌毒素進(jìn)行有效監(jiān)控十分必要。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003]本發(fā)明目的在于開發(fā)一種高靈敏度、高通量、低成本、檢測時間快、特異性好的檢測食品中赭曲霉毒素A新技術(shù)，以替代傳統(tǒng)色譜技術(shù)或酶聯(lián)免疫法(ELISA)赭曲霉毒素A檢測的方法。
[0004]本發(fā)明的原理如圖1所示，用濃硫酸(98%)與濃過氧化氫溶液(30%)按照體積比7:3混合的洗液清洗光子晶體微球，同時進(jìn)行羥基化修飾，用Y-縮水甘油氧丙基三甲氧基硅烷(GPTMS)對微球表面修飾環(huán)氧基，固定赭曲霉毒素A-核酸適配體，牛血清蛋白(BSA)封閉，加入熒光標(biāo)記互補序列進(jìn)行雜交，加入樣品中赭曲霉毒素A后，使其與核酸適配體的特異性結(jié)合，同時互補雜交的熒光標(biāo)記序列從微球上解離，從而引起熒光信號的變化，利用芯片掃描儀對熒光信號進(jìn)行檢測。
[0005]本發(fā)明所述用單珠光子晶體微球檢測赭曲霉毒素A的方法，是利用固定在光子晶體微球上的核酸適配體序列與其熒光標(biāo)記互補序列進(jìn)行雜交，通過加入待測樣品，利用芯片掃描儀對加入樣品前后的熒光信號進(jìn)行檢測；根據(jù)測得的熒光信號的變化值對樣品中的赭曲霉毒素A進(jìn)行檢測；所述核酸適配體序列是:5' -GAT CGG GTG TGG GTG GCG TAA AGGGAG CAT CGG ACA-NH2I';熒光標(biāo)記互補序列是5' -FITC-TGT CCG ATG CTC CCT TTA CGCCAC CCA CAC CCG ATC-3'。
[0006]只要樣品中存在赭曲霉毒素A，就會與核酸適配體的特異性結(jié)合，同時互補雜交的熒光標(biāo)記序列從微球上解離，從而引起熒光信號的變化，因此只要檢測到加入樣品前后的熒光信號發(fā)生了變化，就表明樣品中含有赭曲霉毒素A。
[0007]進(jìn)一步地，我們可預(yù)先建立熒光信號的變化值與赭曲霉毒素A標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度的關(guān)系作為定量分析指標(biāo)，就可根據(jù)測得的熒光信號的變化值對樣品中的赭曲霉毒素A進(jìn)行定量檢測。
[0008]上述方法包括以下步驟:
[0009](1)光子晶體微球的制備
[0010](2)光子晶體微球表面功能化:通過體積比3:7的雙氧水與濃硫酸對步驟(1)得到的微球表面進(jìn)行羥基化修飾，再用Y-縮水甘油氧丙基三甲氧基硅烷(GPTMS)對微球表面進(jìn)行環(huán)氧基修飾；
[0011](3)固定赭曲霉毒素A-核酸適配體序列:通過化學(xué)鍵合的方法將赭曲霉毒素A-核酸適配體序列 5' -GAT CGG GTG TGG GTG GCG TAA AGG GAG CAT CGG ACA-NH2I'固定于經(jīng)步驟(2)表面修飾的光子晶體微球表面；加入熒光標(biāo)記互補序列5' -FITC-TGT CCG ATGCTC CCT TTA CGC CAC CCA CAC CCG ATC-3'進(jìn)行雜交，
[0012](4)用經(jīng)過步驟(3)處理的單珠的光子晶體微球分別加入不同濃度有赭曲霉毒素A標(biāo)準(zhǔn)溶液，利用芯片掃描儀檢測加入赭曲霉毒素A標(biāo)準(zhǔn)溶液前、后的熒光信號值，加入前所獲得的熒光信號為1，加入之后的熒光強(qiáng)度為Ι，Λ I=Itl-1,建立Λ I與赭曲霉毒素A標(biāo)準(zhǔn)溶液的關(guān)系，作為定量分析指標(biāo)；
[0013](5)用單珠光子晶體微球?qū)Υ郎y樣品進(jìn)行檢測；利用芯片掃描儀檢測熒光信號值，根據(jù)測得的熒光信號的變化值，依據(jù)步驟(4)建立的定量分析指標(biāo)對樣品中的赭曲霉毒素A進(jìn)行定量。
[0014]上述方法中，優(yōu)選的條件是:核酸適配體序列濃度為400ng/mL、互補序列濃度為500ng/mL、雜交溫度為37攝氏度、雜交時間為3h、OTA結(jié)合溫度為37攝氏度、結(jié)合時間為Ih0
[0015]光子晶體微球的制備:將裝有單分散納米二氧化硅乳液的I號注射器及裝有甲基硅油的2號注射器連接到三通管上，利用微流注射泵將水相和油相通過三通管混合包裹，并通過玻璃管流入疏水性的收集器皿中，在界面力的作用下單分散納米二氧化硅乳液形成球狀結(jié)構(gòu)。
[0016]將制備好的液態(tài)微球置于60°C烘箱內(nèi)過夜,使液態(tài)微球中的水分逐漸蒸發(fā)并使單分散納米二氧化硅微球進(jìn)一步自組裝。微球成型后，用正己烷浸泡微球，每次lOmin，直至將甲基硅油洗凈，后用無水乙醇清洗微球3次，將正己烷完全洗凈。將清洗好的微球至于管式爐中煅燒，升溫速度為2V /min，逐漸升至700°C，保溫3小時，后自然降至室溫。
[0017]光子晶體微球表面功能化[0018]修飾羥基:將ImL食人魚洗液(濃硫酸:雙氧水=7:3)加入到光子晶體微球的燒杯中過夜，后用雙蒸水沖洗3次，用氮氣流吹干。經(jīng)過該食人魚洗液處理后，清除掉微球表面的有機(jī)雜質(zhì)，并且使微球表面形成更多的硅羥基。
[0019]修飾環(huán)氧基:將上述處理過的微球浸泡于含5% (v/v) Y -縮水甘油氧丙基三甲氧基硅烷(GPTMS)的甲苯溶液中，37攝氏度搖晃6小時，待反應(yīng)結(jié)束后，用甲苯、無水乙醇以及雙蒸水按順序分別清洗微球3次，后用氮氣流吹干，將微球置于110°C下加熱30min。處理好后的微球用于下一步的毒素檢測。
[0020]谷物試樣的處理:
[0021]將市場上購買的大米、玉米和小麥分別使用中藥粉碎機(jī)粉碎，過200目篩，稱取試樣各5g于已清洗干凈的具塞錐形瓶中，向樣品中添加不同濃度及體積的赭曲霉毒素A-甲醇溶液標(biāo)準(zhǔn)品，充分混合試樣后，將其放入通風(fēng)處內(nèi)，直至溶劑蒸發(fā)完全。向其中加入提取劑(甲醇:水=4:6)15mL，，瓶塞上涂上一層水，將瓶塞蓋緊，防止漏液。在搖床內(nèi)搖晃提取2小時(180r/min),用whatman濾紙過濾,取濾液離心IOmin (4000r/p),取上清液，即為待測樣品。同時做空白試驗。
[0022]對赭曲霉毒素A樣品進(jìn)行檢測:
[0023]將修飾后的微球至于離心管中，每管5球，后加入10 μ L濃度為400ng/mL的赭曲霉毒素A-核酸適配體序列，4°C下過夜。后用TE (Tris-HCl-EDTA)洗液清洗微球3次，后向離心管中加入IOmL 1%牛血清蛋白(BSA)溶液，對微球表面上未結(jié)合位點進(jìn)行封閉，室溫下封閉I小時，后用TE洗液清洗微球3次。向各離心管中加入10 μ L濃度為500ng/mL的熒光標(biāo)記互補序列，37攝氏度雜交反應(yīng)3小時。然后分別用洗脫液A (I X SSC+0.2%SDS)、洗脫液B (0.2 X SSC)、洗脫液C (0.1 X SSC)進(jìn)行洗漆。然后向離心管中加入赭曲霉毒素A毒素標(biāo)準(zhǔn)樣品或提取的谷物試樣，37°C下結(jié)合I小時，用洗脫液A、B、C各清洗微球3次后，最后固定微球于玻片上，放入芯片掃描儀進(jìn)行熒光檢測，并用LuxScan3.0軟件對結(jié)果進(jìn)行分析。未加入OTA標(biāo)準(zhǔn)溶液之前，所獲得的熒光信號為Itl，加入OTA標(biāo)準(zhǔn)品之后的熒光強(qiáng)度為I，Λ I=Itl-1,作為OTA定量分析指標(biāo)。赭曲霉毒素A的標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖2。線性檢測范圍在三個數(shù)量級范圍之內(nèi)見圖3。
[0024]本發(fā)明通過二氧化硅顆粒自組裝技術(shù)，組裝成結(jié)構(gòu)和均一的光子晶體微球。將其浸入食人魚洗液(濃硫酸:雙氧水=7:3)進(jìn)行清洗，同時使其表面硅羥基增多，后用5%的Y -縮水甘油氧丙基三甲氧基硅烷(GPTMS)甲苯溶液浸泡，使其表面修飾環(huán)氧基。試驗通過優(yōu)化赭曲霉毒素A-核酸適配體序列濃度、熒光標(biāo)記互補序列濃度、雜交反應(yīng)溫度和時間、OTA結(jié)合反應(yīng)溫度和時間確定了核酸適配體序列濃度為400ng/mL、互補序列濃度為500ng/mL、雜交溫度為37攝氏度、雜交時間為3h、OTA結(jié)合溫度為37攝氏度、結(jié)合時間為lh。
[0025]利用光子晶體微球比表面積大的特點對赭曲霉毒素A進(jìn)行檢測，微球表面功能化后，固定赭曲霉毒素A-核酸適配體,加入熒光標(biāo)記互補序列進(jìn)行雜交,然后加入樣品中赭曲霉毒素A，使其與核酸適配體的特異性結(jié)合，同時互補雜交的熒光標(biāo)記序列從微球上解離，利用芯片掃描儀對熒光信號進(jìn)行檢測，構(gòu)建農(nóng)產(chǎn)品中赭曲霉毒素A的液相芯片檢測技術(shù)。建立赭曲霉毒素A檢測范圍在1-0.001ng/mL之間，對赭曲霉毒素A在大米、玉米和小麥中的回收率在73.73%~125.17%之間。不同毒素之間無干擾，具有良好的特異性。特異性見圖4。[0026]本發(fā)明中通過對反應(yīng)條件進(jìn)行優(yōu)化，提高熒光信號及熒光信號變化值，從而擴(kuò)大檢測線性范圍。這一技術(shù)對赭曲霉毒素A的檢測靈敏度達(dá)到了 pg/mL，檢測現(xiàn)行范圍到4個數(shù)量級，不同毒素之間不存在明顯的干擾問題，具有良好的檢測選擇。而且，檢測樣品試劑僅僅需要2 μ L/球，節(jié)省了試劑和樣品，將包被雜交好的微球直接用于檢測，檢測時間小于2小時。該技術(shù)可以高通量、快速、靈敏、穩(wěn)定地檢測樣本，成本低廉。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0027]圖1光子晶體微球檢測赫曲霉毒素A原理圖；
[0028]圖2赭曲霉毒素A檢測標(biāo)準(zhǔn)曲線；
[0029]圖3為赭曲霉毒素A檢測線性范圍。
[0030]圖4赭曲霉毒素A檢測的特異性。
【具體實施方式】
[0031]本發(fā)明所用赭曲霉毒素A標(biāo)準(zhǔn)品(0ΤΑ)，四氧乙基硅烷(TEOS)購于Sigma-Aldrich0赭曲霉毒素A-核酸適配體及熒光標(biāo)記互補鏈由上海生工生物工程股份有限公司合成。牛血清蛋白(BSA)購于上海生工有限公司。Y-縮水甘油氧丙基三甲氧基硅烷(GPTMS)購于東京化成工業(yè)株式會社。甲基硅油購于宇諾公司。氨水、無水乙醇購于南京化學(xué)試劑公司。谷物(大米、玉米和小麥)購于南京熱河南路農(nóng)貿(mào)市場。
[0032]實施例1
[0033]將市場上購買的大米、玉米和小麥分別使用中藥粉碎機(jī)粉碎，過200目篩，稱取試樣各5g于已清洗干凈的具塞錐形瓶中，向樣品中添加不同濃度及體積的赭曲霉毒素A-甲醇溶液標(biāo)準(zhǔn)品，充分混合試樣后，將其放入通風(fēng)處內(nèi)，直至溶劑蒸發(fā)完全。向其中加入提取劑 (甲醇:水=4:6)15mL，，瓶塞上涂上一層水，將瓶塞蓋緊，防止漏液。在搖床內(nèi)搖晃提取2小時(180r/min),用whatman濾紙過濾,取濾液離心IOmin (4000r/p),取上清液，即為待測樣品。同時做空白試驗。
[0034]樣品中赭曲霉毒素A的檢測:
[0035]將修飾后的微球至于離心管中，每管5球，后加入10 μ L濃度為400ng/mL的赭曲霉毒素A-核酸適配體序列SEQ ID N0.1，具體是5' -GAT CGG GTG TGG GTG GCG TAA AGGGAG CAT CGG ACA-NH2-3'，4°C下過夜。后用 TE (Tris-Hcl-EDTA)洗液(PH=8.0)清洗微球3次，后向離心管中加入10μ Ll%牛血清蛋白(BSA)溶液，對微球表面上未結(jié)合位點進(jìn)行封閉，室溫下封閉I小時，后用TE洗液清洗微球3次。向各離心管中加入10 μ L濃度為500ng/mL 的熒光標(biāo)記互補序列 SEQ ID N0.2,具體是 5' -FITC-TGT CCG ATG CTC CCT TTA CGC CACCCA CAC CCG ATC-3'，37攝氏度雜交反應(yīng)3小時。然后分別用洗脫液A(I X SSC+0.2%SDS)、洗脫液B (0.2 X SSC)、洗脫液C (0.1 X SSC)進(jìn)行洗漆。然后向離心管中加入赭曲霉毒素A毒素標(biāo)準(zhǔn)樣品或提取的谷物試樣，37°C下結(jié)合I小時，用洗脫液A、B、C各清洗微球3次后，最后固定微球于玻片上，放入芯片掃描儀進(jìn)行熒光檢測，并用LuxScan3.0軟件對結(jié)果進(jìn)行分析。未加入OTA標(biāo)準(zhǔn)溶液之前，所獲得的熒光信號為Itl，加入OTA標(biāo)準(zhǔn)品之后的熒光強(qiáng)度為I，Λ 作為OTA定量分析指標(biāo)。[0036]表1[0037]
【權(quán)利要求】
1.一種檢測赭曲霉毒素A的方法，其特征在于，利用固定在光子晶體微球上的核酸適配體序列與其熒光標(biāo)記互補序列進(jìn)行雜交，通過加入待測樣品，利用芯片掃描儀對加入樣品前后的熒光信號進(jìn)行檢測；根據(jù)測得的熒光信號的變化值對樣品中的赭曲霉毒素A進(jìn)行檢測； 所述核酸適配體序列是:5' -GAT CGG GTG TGG GTG GCG TAA AGG GAG CAT CGGACA-NH2-3'； 熒光標(biāo)記互補序列是 5' -FITC-TGT CCG ATG CTC CCT TTA CGC CAC CCA CAC CCGATC-3'。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，預(yù)先建立熒光信號的變化值與赭曲霉毒素A標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度的關(guān)系作為定量分析指標(biāo)，再根據(jù)測得的熒光信號的變化值對樣品中的赭曲霉毒素A進(jìn)行定量。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，包括以下步驟: (O光子晶體微球的 制備； (2)光子晶體微球表面功能化:通過體積比3:7的雙氧水與濃硫酸對步驟(1)得到的微球表面進(jìn)行清洗及羥基化修飾，再用Y-縮水甘油氧丙基三甲氧基硅烷對微球表面進(jìn)行環(huán)氧基修飾； (3)DNA固定與雜交:通過化學(xué)鍵合方法將赭曲霉毒素A的核酸適配體序列5' -GATCGG GTG TGG GTG GCG TAA AGG GAG CAT CGG ACA-NH2I'固定于經(jīng)過步驟(2)表面修飾的微球表面，再與其熒光互補序列5' -FITC-TGT CCG ATG CTC CCT TTA CGC CAC CCA CACCCG ATC-3'進(jìn)行雜交結(jié)合； (4)用經(jīng)步驟(3)處理的單珠光子晶體微球分別加入不同濃度有赭曲霉毒素A標(biāo)準(zhǔn)溶液，利用芯片掃描儀檢測加入赭曲霉毒素A標(biāo)準(zhǔn)溶液前、后的熒光信號值，加入前所獲得的熒光信號為1，加入之后的熒光強(qiáng)度為I，Λ I=Itl-1,建立Λ I與赭曲霉毒素A標(biāo)準(zhǔn)溶液的關(guān)系，作為定量分析指標(biāo)； (5)用單珠光子晶體微球?qū)Υ郎y樣品進(jìn)行檢測；利用芯片掃描儀檢測熒光信號值，根據(jù)測得的熒光信號的變化值，依據(jù)步驟(4)建立的定量分析指標(biāo)對樣品中的赭曲霉毒素A進(jìn)行定量。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于步驟(2)中Y-縮水甘油氧丙基三甲氧基硅烷對微球表面進(jìn)行環(huán)氧基修飾時，110°C下烘干30min。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于所述赭曲霉毒素A的核酸適配體序列的包被濃度為400ng/mL,其互補序列濃度為500ng/mL。
【文檔編號】C12Q1/68GK103525927SQ201310473777
【公開日】2014年1月22日 申請日期:2013年10月11日 優(yōu)先權(quán)日:2013年10月11日
【發(fā)明者】李建林, 孫越, 徐坤, 李瑋, 徐杰, 蔣云坤, 曹斌, 鄭鐵松 申請人:南京師范大學(xué)