專利名稱：：一種電化學(xué)傳感器對微量赭曲霉毒素a進(jìn)行檢測的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及利用電化學(xué)傳感器對赭曲霉毒素A進(jìn)行檢測，特別強(qiáng)調(diào)適體的應(yīng)用、金納米粒子在電化學(xué)中對電子傳遞的促進(jìn)作用，以及該檢測方法的高靈敏度及易操作性，屬于電化學(xué)傳感器
技術(shù)領(lǐng)域：
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背景技術(shù)：
：電化學(xué)傳感器是一種集具高靈敏度、可靠、方便于一體的檢測手段，生物傳感器是指各種生物體成分(酶、抗原、抗體、激素等)或生物體本身(細(xì)胞、細(xì)胞器、組織等)作為敏感元件的傳感器。電化學(xué)生物傳感器則是指由生物材料作為敏感元件，電極作為轉(zhuǎn)換元件，以電勢、電流或電阻為特征檢測信號的傳感器。本發(fā)明把適配體應(yīng)用于電化學(xué)傳感器，并于電極表面修飾上可以促進(jìn)電子傳遞的金納米粒子，大大提高了傳感器的靈敏度，該傳感器以波碳電極作為工作電極，甘汞電極為參比電極，鉑電極為對電極，以亞甲基藍(lán)的循環(huán)伏安圖譜為檢測信號，通過對不同濃度赭曲霉毒素A標(biāo)準(zhǔn)品檢測，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，達(dá)到對含赭曲霉毒素A樣品進(jìn)行定量檢測的目的。
發(fā)明內(nèi)容(—)要解決的技術(shù)問題本發(fā)明旨在發(fā)明一種基于適配體的電化學(xué)傳感器，在波碳電極表面修飾上單鏈DNA，并通過堿基配對將適體、金納米粒子修飾的單鏈DNA修飾到電極表面，進(jìn)而建立赭曲霉毒素A檢測的標(biāo)準(zhǔn)曲線。本發(fā)明旨在建立靈敏度高、可操作性強(qiáng)的赭曲霉毒素A定量檢測方法。(二)技術(shù)解決方案—種電化學(xué)傳感器對微量赭曲霉毒素A進(jìn)行檢測的方法對波碳電極進(jìn)行修飾，做成適配體電化學(xué)傳感器，對赭曲霉毒素A標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行檢測，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，以達(dá)到對含赭曲霉毒素A樣品進(jìn)行定量檢測的目的；步驟為(1)波碳電極的拋光處理將波碳電極依次用1ym、0.3iim、0.05ym的氧化鋁粉末進(jìn)行打磨處理；然后置于1:1乙醇水溶液中超聲5min;(2)金納米粒子修飾的DNA的制備將lmL濃度約為2X10—9mol/L的金納米粒子溶液以10000r/min離心15min，去掉上清液，將金納米粒子再重新分散于50yL雙蒸水中，將重分散后的金納米粒子以10yL/管分裝3管，于3管金納米粒子溶液中分別加入10L、20i!L、30yL巰基修飾的單鏈DNA(購于上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司)，混合均勻，室溫反應(yīng)12h后，加入1iiL2mol/L的NaCl溶液，混合均勻，繼續(xù)室溫反應(yīng)12h;然后將反應(yīng)好的溶液跑電泳確定反應(yīng)效果，沒有反應(yīng)上的金納米粒子遇到電泳液中的鹽會在膠孔中聚沉，呈藍(lán)色，而與DNA反應(yīng)的金納米粒子不會聚沉；(3)波碳電極的修飾將拋光處理好的波碳電極作為工作電極在濃度為20mmol/L的對氨基苯磺酸溶液中，在0.Olv/s下進(jìn)行循環(huán)伏安掃描，對氨基苯磺酸基被修飾到電極表面；將掃描完的電極置于40mmol/LPC15溶液中30min，進(jìn)行活化；(4)適配體電化學(xué)傳感器的制備將于上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司購得的氨基修飾的單鏈DNA6iiL滴加于已完成活化的電極表面，待反應(yīng)2h后，將電極放于清水中清洗5min，再將其置于5ymol/L適體溶液(購于上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司)中反應(yīng)12h，清洗電極，最后置于金納米粒子修飾的DNA中反應(yīng)12h，即制備得該電化學(xué)傳感器。(5)對赭曲霉毒素A標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行檢測，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線將修飾好的電化學(xué)傳感器置于赭曲霉毒素A標(biāo)準(zhǔn)品溶液中反應(yīng)，標(biāo)準(zhǔn)品溶液濃度依次為0ng/mL、0.lng/mL、lng/mL、5ng/mL、10ng/mL、20ng/mL，每個濃度分別反應(yīng)15min后，將電化學(xué)傳感器置于8X10—5mol/L亞甲基藍(lán)溶液中反應(yīng)10min。反應(yīng)完成后，將電化學(xué)傳感器作為工作電極，在O.lmol/LTris-HCl中掃描循環(huán)伏安圖譜。掃描完成后用超純水洗滌lmin，再進(jìn)行下一個濃度的反應(yīng)，進(jìn)行掃描高電位為O.4v，低電位為0v，掃描速度為0.lv/s。根據(jù)掃描循環(huán)伏安圖譜的氧化還原峰的電流值與對應(yīng)的赭曲霉毒素A標(biāo)準(zhǔn)品濃度建立標(biāo)準(zhǔn)曲線；(6)對含赭曲霉毒素A樣品進(jìn)行定量檢測將修飾好的電化學(xué)傳感器置于含赭曲霉毒素A的待測樣品中反應(yīng)，反應(yīng)15min后，將電化學(xué)傳感器置于8X10—5mol/L亞甲基藍(lán)溶液中反應(yīng)10min，反應(yīng)完成后，將電化學(xué)傳感器作為工作電極，在0.lmol/LTris-HCl中掃描循環(huán)伏安圖譜；掃描完成后用超純水洗滌lmin，進(jìn)行掃描高電位為0.4v，低電位為Ov，掃描速度為0.lv/s;根據(jù)掃描循環(huán)伏安圖譜的氧化還原峰的電流值從標(biāo)準(zhǔn)曲線中求得對應(yīng)的赭曲霉毒素A的濃度。金納米粒子粒徑為25nm。所述的修飾氨基修飾的單鏈DNA是在循環(huán)伏安電流作用下，對氨基苯磺酸反應(yīng)到工作電極表面，氨基修飾的單鏈DNA通過酰胺作用反應(yīng)到電極表面。所述的適體DNA為對赭曲霉毒素A有特異性反應(yīng)的單鏈DNA。所述的金納米粒子修飾的單鏈DNA是與適體DNA的一端互補(bǔ)配對，且用巰基修飾的DNA，金納米粒子與巰基修飾的DNA通過金巰鍵相結(jié)合。所述的建立赭曲霉素A檢測的標(biāo)準(zhǔn)曲線是指該傳感器在與不同濃度的赭曲霉毒素A進(jìn)行反應(yīng)后，再與亞甲基藍(lán)進(jìn)行反應(yīng)，并掃得其循環(huán)伏安圖譜，根據(jù)不同濃度下氧化峰電流值做得標(biāo)準(zhǔn)曲線。(三)有益效果(1)本發(fā)明采用適配體做傳感器，提高了檢測的靈敏度。(2)本發(fā)明把納米粒子修飾到電極表面，有利于電子的傳遞，進(jìn)一步提高了其靈敏度。(3)本發(fā)明采用電化學(xué)作為檢測手段，方便快捷。(4)本發(fā)明方法大大降低了小分子毒素檢測成本。(1)金納米粒子與DNA的偶聯(lián)電泳圖。1、金納米粒子；2、金納米粒子與DNA體積比l:1反應(yīng)；3、金納米粒子與DNA體積比1:2反應(yīng)；4、金納米粒子與DNA體積比1:34反應(yīng)。(2)與不同濃度赭曲霉毒素A反應(yīng)后的循環(huán)伏安掃描圖。圖上由上而下依次為在標(biāo)準(zhǔn)品0ng/mL、0.lng/mL、lng/mL、5ng/mL、10ng/mL、20ng/mL反應(yīng)后的循環(huán)伏安掃描圖。(3)赭曲霉毒素A檢測標(biāo)準(zhǔn)曲線。(4)實際樣品檢測循環(huán)伏安圖譜。具體實施例方式實施例1:電化學(xué)傳感器的制備(1)波碳電極的拋光處理將波碳電極依次用1iim、0.3iim、0.05iim的氧化鋁粉末進(jìn)行打磨處理。然后置于1:1乙醇水溶液中超聲5min。(2)金納米粒子修飾的DNA的制備將lmL濃度約為2X10—9mol/L的金納米粒子溶液以10000r/min離心15min，去掉上清液，將金納米粒子再重新分散于50L雙蒸水中。將重分散后的金納米粒子以10L/管分裝3管，于3管金納米粒子溶液中分別加入10L、20L、30L巰基修飾的單鏈DNA(購于上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司)，混合均勻，室溫反應(yīng)12h后，加入1L2mol/L的NaCl溶液，混合均勻，繼續(xù)室溫反應(yīng)12h。然后將反應(yīng)好的溶液跑電泳確定反應(yīng)效果，沒有反應(yīng)上的金納米粒子遇到電泳液中的鹽會在膠孔中聚沉，呈藍(lán)色，而與DNA反應(yīng)的金納米粒子不會聚沉。(3)波碳電極的修飾將拋光處理好的波碳電極作為工作電極在濃度為20mmol/L的對氨基苯磺酸溶液中，在0.Olv/s下進(jìn)行循環(huán)伏安掃描，對氨基苯磺酸基被修飾到電極表面。將掃描完的電極置于40mmol/LPC15溶液中30min，進(jìn)行活化。將于上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司購得的氨基修飾的單鏈DNA6L滴加于已完成活化的電極表面，待反應(yīng)2h后，將電極放于清水中清洗5min，再將其置于5ymol/L適體溶液(購于上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司)中反應(yīng)12h，清洗電極，最后置于金納米粒子修飾的DNA中反應(yīng)12h，這樣該電化學(xué)傳感器即制備好。實施例2:赭曲霉毒素A檢測標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立及實際樣品檢測將修飾好的電化學(xué)傳感器置于赭曲霉毒素A標(biāo)準(zhǔn)品溶液中反應(yīng)，標(biāo)準(zhǔn)品溶液濃度依次為Ong/mL、0.lng/mL、lng/mL、5ng/mL、10ng/mL、20ng/mL，每個濃度反應(yīng)15min后，將傳感器置于8X10—Smol/L亞甲基藍(lán)溶液中反應(yīng)10min。反應(yīng)完成后，將傳感器作為工作電極，在O.lmol/LTris-HCl中掃描循環(huán)伏安圖譜。掃描完成后用超純水洗滌lmin，再進(jìn)行下一個濃度的反應(yīng)。進(jìn)行掃描高電位為0.4v，低電位為Ov，掃描速度為0.lv/s。待6個濃度都掃描完成后，進(jìn)行數(shù)據(jù)整理，繪制曲線。氧化峰值電流值與對應(yīng)濃度值如下表所示<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>赭曲霉毒素A標(biāo)準(zhǔn)品濃度(ng/mL)氧化峰電流值(A)<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>樣品預(yù)處理采用液液萃取法對葡萄酒樣品進(jìn)行預(yù)處理。在50mL酒樣中加入50mL正己烷，振蕩10min。待靜置分層后，棄去上層的正己烷，再用25mL正己烷重復(fù)提取。收集下層，用25mL超純水和25mL三氯甲烷，振蕩10min，靜置分層后，收集下層溶液，上層用25mL三氯甲烷再次振蕩10min，合并三氯甲烷提取液，在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上，于4(TC下進(jìn)行濃縮，快干時加入2mL甲醇，溶解超聲并用0.45iim濾膜過濾，用氮氣吹干，再用lmL30%(V/V)的甲醇水溶液進(jìn)溶解，然后進(jìn)行檢測。檢測得到的實際樣品的循環(huán)伏安圖譜的氧化峰電流值為6.299E-06A，代入標(biāo)準(zhǔn)曲線得到該葡萄酒提取液中的赭曲霉毒素A的濃度為12.34ng/權(quán)利要求一種電化學(xué)傳感器對微量赭曲霉毒素A進(jìn)行檢測的方法，其特征在于對波碳電極進(jìn)行修飾，做成適配體電化學(xué)傳感器，對赭曲霉毒素A標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行檢測，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，以達(dá)到對含赭曲霉毒素A樣品進(jìn)行定量檢測的目的；步驟為(1)波碳電極的拋光處理將波碳電極依次用1μm、0.3μm、0.05μm的氧化鋁粉末進(jìn)行打磨處理；然后置于1∶1乙醇水溶液中超聲5min；(2)金納米粒子修飾的DNA的制備將1mL濃度為2×10-9mol/L的金納米粒子溶液以10000r/min離心15min，去掉上清液，將金納米粒子再重新分散于50μL雙蒸水中，將重分散后的金納米粒子以10μL/管分裝3管，于3管金納米粒子溶液中分別加入10μL、20μL、30μL巰基修飾的單鏈DNA，混合均勻，室溫反應(yīng)12h后，加入1μL2mol/L的NaCl溶液，混合均勻，繼續(xù)室溫反應(yīng)12h；然后將反應(yīng)好的溶液跑電泳確定反應(yīng)效果，沒有反應(yīng)上的金納米粒子遇到電泳液中的鹽會在膠孔中聚沉，呈藍(lán)色，而與DNA反應(yīng)的金納米粒子不會聚沉；(3)波碳電極的修飾將拋光處理好的波碳電極作為工作電極在濃度為20mmol/L的對氨基苯磺酸溶液中，在0.01v/s下進(jìn)行循環(huán)伏安掃描，對氨基苯磺酸基被修飾到電極表面；將掃描后的電極置于40mmol/LPCl5溶液中30min，進(jìn)行活化；(4)適配體電化學(xué)傳感器的制備將氨基修飾的單鏈DNA6μL滴加于已完成活化的電極表面，待反應(yīng)2h后，將電極放于清水中清洗5min，再將其置于5μmol/L適配體溶液中反應(yīng)12h，清洗電極，最后置于金納米粒子修飾的DNA中反應(yīng)12h，即制得電化學(xué)傳感器；(5)對赭曲霉毒素A標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行檢測，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線將修飾好的電化學(xué)傳感器置于赭曲霉毒素A標(biāo)準(zhǔn)品溶液中反應(yīng)，標(biāo)準(zhǔn)品溶液濃度依次為0ng/mL、0.1ng/mL、1ng/mL、5ng/mL、10ng/mL、20ng/mL，每個濃度分別反應(yīng)15min后，將電化學(xué)傳感器置于8×10-5mol/L亞甲基藍(lán)溶液中反應(yīng)10min，反應(yīng)完成后，將電化學(xué)傳感器作為工作電極，在0.1mol/LTris-HCl中掃描循環(huán)伏安圖譜；掃描完成后用超純水洗滌1min，再進(jìn)行下一個濃度的反應(yīng)，進(jìn)行掃描高電位為0.4v，低電位為0v，掃描速度為0.1v/s；根據(jù)掃描循環(huán)伏安圖譜的氧化峰的電流值與對應(yīng)的赭曲霉毒素A標(biāo)準(zhǔn)品濃度建立標(biāo)準(zhǔn)曲線；(6)對含赭曲霉毒素A樣品進(jìn)行定量檢測將修飾好的電化學(xué)傳感器置于含赭曲霉毒素A的待測樣品中反應(yīng)，反應(yīng)15min后，將電化學(xué)傳感器置于8×10-5mol/L亞甲基藍(lán)溶液中反應(yīng)10min，反應(yīng)完成后，將電化學(xué)傳感器作為工作電極，在0.1mol/LTris-HCl中掃描循環(huán)伏安圖譜；掃描完成后用超純水洗滌1min，進(jìn)行掃描高電位為0.4v，低電位為0v，掃描速度為0.1v/s；根據(jù)掃描循環(huán)伏安圖譜的氧化峰的電流值從標(biāo)準(zhǔn)曲線中求得對應(yīng)的赭曲霉毒素A的濃度。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于金納米粒子粒徑為25nm。全文摘要一種電化學(xué)傳感器對微量赭曲霉毒素A進(jìn)行檢測的方法，屬于電化學(xué)傳感器
技術(shù)領(lǐng)域：
。本發(fā)明對波碳電極進(jìn)行修飾，做成適配體電化學(xué)傳感器，對赭曲霉毒素A標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行檢測，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，以達(dá)到對含赭曲霉毒素A樣品進(jìn)行定量檢測的目的；本發(fā)明旨在發(fā)明一種基于適配體的電化學(xué)傳感器，在波碳電極表面修飾上單鏈DNA，并通過堿基配對將適體、金納米粒子修飾的單鏈DNA修飾到電極表面，進(jìn)而建立赭曲霉毒素A定量檢測的標(biāo)準(zhǔn)曲線。本發(fā)明旨在建立靈敏度高、可操作性強(qiáng)的赭曲霉毒素A定量檢測方法。文檔編號G01N27/48GK101699277SQ20091021320公開日2010年4月28日申請日期2009年10月21日優(yōu)先權(quán)日2009年10月21日發(fā)明者劉麗強(qiáng),彭池方,胥傳來,許定花,金征宇,陳偉申請人:江南大學(xué)