豬薩佩羅病毒實(shí)時(shí)熒光定量rt-pcr檢測(cè)方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種豬薩佩羅病毒實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR檢測(cè)方法。本發(fā)明的方法是：針對(duì)薩佩羅病毒的保守基因片段設(shè)計(jì)兩條引物，準(zhǔn)備RNA樣品，設(shè)置反應(yīng)條件，進(jìn)行熒光定量RT-PCR。通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的制作、特異性驗(yàn)證，結(jié)果顯示該方法的最低檢出限為10拷貝數(shù)的數(shù)量級(jí)；同時(shí)該方法具有高的特異性，可以與豬捷申病毒、豬腸道病毒9、豬口蹄疫病毒、腦心肌炎病毒、豬傳染性腸胃炎、豬流行性腹瀉和豬繁殖與呼吸道綜合癥病毒分離開(kāi)來(lái)。對(duì)63份豬糞便樣品進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)出7分樣品，陽(yáng)性率為11.11%。該方法具有簡(jiǎn)單、準(zhǔn)確、高效、快速、無(wú)污染等特點(diǎn)，非常適合用于豬薩佩羅病毒的檢測(cè)和定量。
【專(zhuān)利說(shuō)明】豬薩佩羅病毒實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR檢測(cè)方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及生物【技術(shù)領(lǐng)域】，是針對(duì)豬薩佩羅病毒的一種高效快速的檢測(cè)方法。
【背景技術(shù)】
[0002]豬薩佩羅病毒(Porcine Sapelovirus)是微RNA病毒科薩佩羅病毒屬的一種豬的病毒。它可以引起豬的神經(jīng)紊亂、繁殖失敗、呼吸衰竭、肺炎以及腹瀉等綜合癥狀。該病毒可以同其他豬的病毒發(fā)生混合感染，給養(yǎng)豬業(yè)帶來(lái)非常巨大的經(jīng)濟(jì)威脅。因此，對(duì)該種病毒的檢測(cè)，是早預(yù)防、早防治以及解除豬群間相互感染的重要措施。本實(shí)驗(yàn)針對(duì)的是中國(guó)第一株薩佩羅病毒(PSV-Csh)(基因編號(hào):HQ875059)，該病毒的基因組全長(zhǎng)是7502個(gè)堿基對(duì)，只有一個(gè)開(kāi)放閱讀框架，編碼一個(gè)多聚蛋白前體，在基因組的5’端和3’端是基因組的非翻譯區(qū) 5’ UTR 和 3’ UTR0
[0003]目前，對(duì)于該病毒的檢測(cè)手段有很多，如病毒的分離、酶聯(lián)免疫吸附法、各種PCR手段。病毒分離和酶聯(lián)免疫吸附法都是最基礎(chǔ)的檢測(cè)方法，但是卻也是最耗時(shí)的檢測(cè)手段，對(duì)于突發(fā)性的疫病的提前診斷，不能做到盡早的檢測(cè)，這樣可能會(huì)耽誤了疫病的控制。分子生物學(xué)的檢測(cè)方法已經(jīng)越來(lái)越受到重視，如RT-PCR已經(jīng)成為一種經(jīng)典的、常規(guī)的檢測(cè)手段。特別是近年來(lái)實(shí)時(shí)熒光定量PCR的發(fā)明，對(duì)于病毒等病原的檢測(cè)來(lái)說(shuō)，實(shí)現(xiàn)了快速、精準(zhǔn)和可視化，同時(shí)實(shí)現(xiàn)了從定性到定量的飛躍。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的是提供一種高效、快速、實(shí)時(shí)檢測(cè)豬薩佩羅病毒的方法，可應(yīng)用于各級(jí)動(dòng)物預(yù)防控制中心、各級(jí)動(dòng)物診所以及企業(yè)。
[0005]為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供的是一種基于SYBR實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR擴(kuò)增技術(shù)來(lái)檢測(cè)豬薩佩羅病毒。
[0006]本發(fā)明所述的SYBR實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR方法檢測(cè)豬薩佩羅病毒的方法，技術(shù)方案如下:
[0007](I)設(shè)計(jì)引物:
[0008]登錄GenBank，獲取薩佩羅病毒的基因序列，利用軟件Clustal W和DNAstar篩選該病毒基因組的保守片段，借助Primer Premiere.0進(jìn)行引物設(shè)計(jì)和篩選，最后利用GenBank的Blast的功能確定引物的特異性。引物序列送至生工生物工程(上海)有限責(zé)任公司進(jìn)行合成。
[0009](2 ) RNA樣品的準(zhǔn)備:
[0010]采用商品化的RNA/DNA提取試劑盒(天根生化科技(北京)有限公司)提取RNA，提取的RNA放于-80C保存?zhèn)溆谩?br> [0011](3)反應(yīng)體系的配置:
[0012]采用商品化的一步法SYBR熒光定量RT-PCR試劑盒(寶生物工程(大連)有限公司)，根據(jù)試劑盒的說(shuō)明書(shū)進(jìn)行反應(yīng)液的配置，其中，RT-PCR的緩沖液為10微升，大連寶生的Taq HS混液為1.2微升，PrimeScript PLUS RTase混液為0.4微升，ROX參比染料II為0.4ul和無(wú)RNase dH20為4.4微升，同時(shí)加入所述的引物和RNA，引物的終濃度為0.4微升。
[0013](4)反應(yīng)和結(jié)果分析:
[0014]上述反應(yīng)液可以由ABI實(shí)時(shí)定量系統(tǒng)進(jìn)行RT-PCR反應(yīng)條件是:逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng):42C，5分鐘；95C, 10秒；PCR反應(yīng):95C，5秒;60C，34秒；40個(gè)循環(huán)。如果出現(xiàn)擴(kuò)增曲線(xiàn)、Ct值小于35個(gè)循環(huán)且Tm值為85.62±0.11范圍內(nèi)可判斷結(jié)果為陽(yáng)性，否則即為陰性。
[0015](5) RNA標(biāo)準(zhǔn)品制備和標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的制作
[0016]I)擴(kuò)增片段標(biāo)準(zhǔn)品構(gòu)建的引物設(shè)計(jì)；
[0017]2)重組片段的調(diào)??；
[0018]3) PCR產(chǎn)物精制；
[0019]4)體外轉(zhuǎn)錄RNA標(biāo)準(zhǔn)品(以調(diào)取目的基因PCR產(chǎn)物為模板，進(jìn)行RNA標(biāo)
[0020]準(zhǔn)品轉(zhuǎn)錄)；
[0021]5)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的制作。
[0022]根據(jù)以上技術(shù)方案，本發(fā)明提供了一種豬薩佩羅病毒實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR檢測(cè)方法，包括如下步驟:
[0023](I)樣品預(yù)處理
[0024]樣品采用1%的磷酸緩沖液處理后，采用RNA/DNA提取試劑盒提取RNA ；
[0025](2)配制反應(yīng)體系
[0026]采用SYBR熒光定量RT-PCR試劑盒，配置反應(yīng)液，其中，RT-PCR的緩沖液為10微升，大連寶生的Taq HS混液為1.2微升，PrimeScript PLUS RTase混液為0.4微升，ROX參比燃料II為0.4微升和無(wú)RNase dH20為4.4微升，同時(shí)加入引物和待檢樣品RNA ；
[0027]上游引物(5’ -3 ’)為:GGATGGACACAAGGACTT ；
[0028]下游引物(5，-3’)為:GTTCACTGCCTACTCTCC；
[0029]優(yōu)選地，加入上下游引物的量均為0.4微升；
[0030]優(yōu)選地，加入待檢樣品RNA的量均為2微升；
[0031](3)反應(yīng)和結(jié)果分析
[0032]上述反應(yīng)體系由ABI實(shí)時(shí)定量系統(tǒng)進(jìn)行RT-PCR ;根據(jù)反應(yīng)的曲線(xiàn)、Ct值和溶解曲線(xiàn)判斷結(jié)果的陰性和陽(yáng)性；
[0033]優(yōu)選地，上述反應(yīng)體系在Applied Biosystems7500/7500Fast Real-Time PCRsystem 進(jìn)行。
[0034]優(yōu)選地，反應(yīng)條件是:逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng):42C，5分鐘；95C，10秒；
[0035]PCR 反應(yīng):95C, 5 秒；60C, 34 秒；
[0036]優(yōu)選地，結(jié)果判斷方法為，現(xiàn)擴(kuò)增曲線(xiàn)、Ct值小于35個(gè)循環(huán)且Tm值為85.62±0.11范圍內(nèi)可判斷結(jié)果為陽(yáng)性，否則即為陰性。
[0037]進(jìn)一步地，本發(fā)明的方法還包括步驟4)，RNA標(biāo)準(zhǔn)品制備和標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的制作:
[0038]I)擴(kuò)增片段標(biāo)準(zhǔn)品構(gòu)建的引物設(shè)計(jì)；
[0039]2)重組片段的調(diào)取；
[0040]3) PCR產(chǎn)物精制；
[0041 ] 4)體外轉(zhuǎn)錄RNA標(biāo)準(zhǔn)品，以調(diào)取目的基因PCR產(chǎn)物為模板，進(jìn)行RNA標(biāo)[0042]準(zhǔn)品轉(zhuǎn)錄；
[0043]5)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的制作。
【專(zhuān)利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0044]圖1是對(duì)RNA標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行系列稀釋后的擴(kuò)增曲線(xiàn)，曲線(xiàn)從左至右依次為5X107拷貝每微升，5 X IO6拷貝每微升，5 X IO5拷貝每微升，5 X IO4拷貝每微升，5 X IO3拷貝每微升，5X IO2拷貝每微升，5X IO1拷貝每微升；5X 10°拷貝每微升和陰性對(duì)照為水平直線(xiàn)。
[0045]圖2為RNA標(biāo)準(zhǔn)品系列稀釋后的溶解曲線(xiàn)，Tm值在85.62 ±0.11范圍內(nèi)。
[0046]圖3為RNA標(biāo)準(zhǔn)品的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)顯示線(xiàn)性關(guān)系良好(R2=0.999，R2>0.98)，擴(kuò)增效率較好(Ε=93.9%，80% < E < 120%)ο
[0047]圖4為豬薩佩羅病毒SYBR實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR的特異性實(shí)驗(yàn)。從圖中顯示，只有薩佩羅病毒出現(xiàn)擴(kuò)增，豬捷申病毒、豬腸道病毒9、豬口蹄疫病毒、腦心肌炎病毒、豬傳染性胃腸炎、豬流行性腹瀉和豬繁殖與呼吸道綜合癥病毒均未出現(xiàn)擴(kuò)增。說(shuō)明引物的特異性較好。
[0048]圖5為圖4結(jié)果的溶解曲線(xiàn)圖。
【具體實(shí)施方式】
[0049]本發(fā)明中生化材料包括生化試劑和核酸標(biāo)準(zhǔn)品均可通過(guò)市售渠道獲得，如無(wú)特殊說(shuō)明，均購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司，其中核酸標(biāo)準(zhǔn)品中的豬口蹄疫病毒核酸標(biāo)準(zhǔn)品購(gòu)買(mǎi)于中國(guó)中牧實(shí)業(yè)股份有限公司。
[0050]實(shí)施例1標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的制作
[0051]I)擴(kuò)增片段標(biāo)準(zhǔn)品構(gòu)建的引物設(shè)計(jì)
[0052]在目的基因上設(shè)計(jì)構(gòu)建引物，并在構(gòu)建的上游引物的5’端加上Τ7啟動(dòng)子，構(gòu)建的下游引物的3’端加上25個(gè)Τ，使構(gòu)建的目的基因標(biāo)準(zhǔn)品RNA有Poly㈧尾。Τ7啟動(dòng)子序列如下:ACTAATACGACTCACTATAGGG
[0053]具體引物設(shè)計(jì)的位置關(guān)系如下序列顯示(間隔線(xiàn)部分為構(gòu)建引物區(qū)，下劃線(xiàn)部分為熒光定量RT-PCR引物區(qū)，波浪線(xiàn)部分分別為T(mén)7啟動(dòng)子和Poly(A)尾，箭頭表示轉(zhuǎn)錄起始位置)。
[0054]
【權(quán)利要求】
1.一種豬薩佩羅病毒實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR檢測(cè)方法，包括如下步驟: 1)樣品預(yù)處理 樣品采用1%的磷酸緩沖液處理后，采用RNA/DNA提取試劑盒提取RNA ； 2)配制反應(yīng)體系 采用SYBR熒光定量RT-PCR試劑盒，配置反應(yīng)液，其中，RT-PCR的緩沖液為10微升，大連寶生的Taq HS混液為1.2微升，PrimeScript PLUS RTase混液為0.4微升，ROX參比染料II為0.4微升和無(wú)RNase dH20為4.4微升，同時(shí)加入引物和待檢樣品RNA ； 3)反應(yīng)和結(jié)果分析 上述反應(yīng)體系由ABI實(shí)時(shí)定量系統(tǒng)進(jìn)行RT-PCR ;根據(jù)反應(yīng)的曲線(xiàn)、Ct值和溶解曲線(xiàn)判斷結(jié)果的陰性和陽(yáng)性。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其中步驟2)中，引物具體序列如下: 上游引物(5，- 3，)為:GGATGGACACAAGGACTT ； 下游引物(5，-3，)為:GTTCACTGCCTACTCTCC。
3.如權(quán)利要求2所述的方法，其中步驟2)中，加入上下游引物的量均為0.4微升。
4.如權(quán)利要求2所述的方法，其中步驟2)中，加入待檢樣品RNA的量為2微升。
5.如權(quán)利要求1所述的方法，其中步驟3)中，所述反應(yīng)體系在AppliedBiosystems7500/7500Fast Real-Time PCR system 進(jìn)行。
6.如權(quán)利要求1所述的方法，其中步驟3)中， 反應(yīng)條件是:逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng):42C，5分鐘；95C，10秒；
PCR 反應(yīng):95C, 5 秒；60C, 34 秒。
7.如權(quán)利要求1所述的方法，其中步驟3)中，結(jié)果判斷方法為，出現(xiàn)擴(kuò)增曲線(xiàn)、Ct值小于35個(gè)循環(huán)且Tm值為85.62±0.11范圍內(nèi)可判斷結(jié)果為陽(yáng)性，否則即為陰性。
8.如權(quán)利要求1所述的方法，其中還包括步驟4)RNA標(biāo)準(zhǔn)品制備和標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的制作: (1)擴(kuò)增片段標(biāo)準(zhǔn)品構(gòu)建的引物設(shè)計(jì)； (2)重組片段的調(diào)?。? (3)PCR產(chǎn)物精制； (4)體外轉(zhuǎn)錄RNA標(biāo)準(zhǔn)品，以調(diào)取目的基因PCR產(chǎn)物為模板，進(jìn)行RNA標(biāo)準(zhǔn)品轉(zhuǎn)錄； (5)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的制作。
【文檔編號(hào)】C12Q1/06GK103525948SQ201310465050
【公開(kāi)日】2014年1月22日 申請(qǐng)日期:2013年10月8日 優(yōu)先權(quán)日:2013年10月8日
【發(fā)明者】崔立, 王春艷, 郁達(dá)義, 劉雨瀟, 華修國(guó) 申請(qǐng)人:上海交通大學(xué)