一種固態(tài)發(fā)酵生產益生菌孢子粉的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種固態(tài)發(fā)酵生產益生菌孢子粉的方法，包括培養(yǎng)基制備、益生菌菌種活化、益生菌菌懸液的制備、益生菌固態(tài)發(fā)酵、益生菌孢子粉干燥、益生菌高孢粉抽提及粉碎和益生菌孢子粉成品質檢及包裝共7個步驟，該方法采用固態(tài)發(fā)酵制備益生菌孢子粉，降低了生產過程中雜菌的污染率，發(fā)酵過程能耗低；產物濃度高，提取工藝簡單；整個生產過程零廢液排放；該方法采用集發(fā)酵、干燥粉碎為一體的臥式固態(tài)生物反應器，簡化操作工序，縮短了生產周期，節(jié)約能耗，提高生產效率。
【專利說明】一種固態(tài)發(fā)酵生產益生菌孢子粉的方法
【技術領域】
[0001]本發(fā)明涉及益生菌發(fā)酵生產【技術領域】，尤其是涉及一種固態(tài)發(fā)酵生產益生菌孢子粉的方法。
【背景技術】
[0002]益生菌是指當攝入充足的數(shù)量后，能對宿主產生一種或多種由論證的功能性健康益處的活的微生物，主要包括乳桿菌屬、雙歧桿菌屬、丙酸菌、芽孢桿菌、埃希氏菌以及酵母屬等。
[0003]益生菌能促進機體微生物菌群和酶的平衡以及刺激特異性和非特異性的免疫機制，達到預防某些疾病、促進發(fā)育、增強體質、延緩衰老和延長壽命的目的。
[0004]CN 103146616 A公開了一種制備復合乳酸菌制劑的方法及應用。所述方法包括農副產品廢渣預處理、菌株擴大培養(yǎng)、復合菌株液態(tài)培養(yǎng)、復合菌株液固態(tài)偶聯(lián)發(fā)酵。該發(fā)明克服了當前益生菌飼料添加劑產品存在的性能穩(wěn)定性差、生產成本高的問題，其不僅使復合乳酸菌制劑產品中的菌株競爭力增強，宿主定植率得到提高，而且，該方法能大幅度減小成本，并有效利用農副產品廢渣資源，使其成為飼料添加劑成分中的重要組成部分，在一定程度上解決了資源浪費和環(huán)境污染等突出問題，可成功應用于飼料方面。但該方法發(fā)酵效率低，成本高，得到的復合乳酸菌制劑的活菌總數(shù)僅達7.8~8.5 X IO9 cfu/ml，無法滿足市場的要求。
[0005]CN 103211085 A公開了一種飼用高效復合益生菌劑及制備方法,屬于生物【技術領域】。所述的復合益生菌劑由地衣芽抱桿菌(Bacilluslicheniformis),嗜熱乳酸鏈球菌{,Streptococcus thermophilus) >11 Mil{Saccharomycerevisiae Hansen)分另lj發(fā)酵培養(yǎng)后按比例混合而成，有效微生物數(shù)目達到8~120 X 108CFU/mL ;所述復合益生菌劑菌株間配伍科學合理，能殺死或抑制動物體內的病原菌，促進飼料的消化吸收，能大大減少飼料中抗生素的使用。但該方法制備工藝復雜，且益生菌含量偏低。
[0006]目前，益生菌制劑應用于養(yǎng)殖生產，然而，在制備工藝上大部分采用液態(tài)發(fā)酵制備，發(fā)酵控制條件苛刻，生產成本高，少數(shù)采用固態(tài)發(fā)酵制備的工藝復雜，得到的益生菌含量低。

【發(fā)明內容】

[0007] 本發(fā)明要解決的技術問題是:提供一種固態(tài)發(fā)酵生產益生菌孢子粉的方法，縮短發(fā)酵周期、降低生產能耗，提高益生菌的發(fā)酵效率，得到含菌量高的復合型益生菌。
[0008]本發(fā)明解決其技術問題采用的技術方案為:一種固態(tài)發(fā)酵生產益生菌孢子粉的方法，包括以下步驟:
a)培養(yǎng)基制備:
茄子瓶培養(yǎng)基:組成成分為馬鈴薯20%、蛋白胨0.5%、葡萄糖或蔗糖2%、磷酸二氫鉀0.05%、硫酸鎂 0.03%、瓊脂 1.5~2%、pH 為 6.5~7.0 ；種子擴大培養(yǎng)的培養(yǎng)基:組成成分為米糠7~10%或麥麩2~10%、花生柏或豆柏2~5%、蛋白胨0.5~1.0%、蔗糖2%、瓊脂2%，pH為6.0~7.0 ；
固體發(fā)酵培養(yǎng)基:由稻殼和麥麩組成，組成比例為3:7~5:5,固體培養(yǎng)基的含水率為50% wt ~60% wt, pH 自然；
b)益生菌菌種活化:將冷凍管中的菌體或斜面培養(yǎng)保存的菌種轉接至茄子瓶內培養(yǎng)；
c)益生菌種懸液的制備:將步驟b)培養(yǎng)好的細菌或真菌按l:10(Tl:50的接種量轉接至種子罐中進行固態(tài)培養(yǎng)，罐壓為0.05MPa,通風量為0.01-0.2vvm,攪拌速度為
0.1-0.2rpm，細菌在34~39°C培養(yǎng)24~36h后轉至適量的無菌水中，使菌懸液含菌量在
1.(Tl.5X107cfu/g ;真菌在25~30°C培養(yǎng)44~60h至適量的無菌水中，使菌懸液含菌量在
3.0~5.0X106cfu/g ；
d)益生菌固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng):
將步驟c)得到的細菌菌懸液按固體發(fā)酵培養(yǎng)基的重量f 2%轉接至固體發(fā)酵培養(yǎng)基中，罐壓為0.02~0.05MPa,通風量為0.2~0.25vvm,攪拌速度為0.8~1.2rpm,培養(yǎng)溫度為34~39°C，物料濕度控制在55~65%，45~55h內每4h取樣檢測物料的含菌量，當含菌量<5.0X 109cfu/g且活菌率高于95%時，停止發(fā)酵；
將步驟c)得到的真菌菌懸液按固體發(fā)酵培養(yǎng)基的重量21%轉接至固體發(fā)酵培養(yǎng)基中，罐壓為0.02~0.05MPa,通風量為0.2~0.25vvm,攪拌速度為0.8~1.2rpm,培養(yǎng)溫度為25~30°C，物料濕度控制在55~65%，57~66h內每2h取樣檢測物料的活菌量，當活菌量<5.0X 108cfu/g且活菌率高于95%時，停止發(fā)酵；
e)益生菌孢子粉干燥及粉碎:在發(fā)酵結束后，將發(fā)酵罐的溫度調至60°C、攪拌速度調至3飛rpm，干燥至孢子粉的含水率低于12%，并通過提高攪拌速度進行粉碎；
f)益生菌高孢粉抽提:采用旋風分離集孢器進行抽提得到高孢粉，然后根據所需的含孢量，并在高孢粉中加入填充料，混合，再根據益生菌孢子粉的配方將細菌和真菌高孢粉按重量比例為8:2飛:5進行混合過篩得到益生菌孢子粉；
g)益生菌孢子粉成品質檢及包裝。
[0009]進一步，步驟a)中的茄子瓶培養(yǎng)基和種子擴大培養(yǎng)的培養(yǎng)基在121°C，0.1MPa滅菌15~20min，固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基在90~95°C，滅菌6(T80min，備用。
[0010]進一步，步驟b)中益生菌活化培養(yǎng)條件為:細菌在32 土 1°C靜置培養(yǎng)24h，真菌在25± 1°C靜置培養(yǎng)48h。
[0011]進一步，步驟c)中菌懸液含菌量采用血球計數(shù)板直接計數(shù)法進行計數(shù)。
[0012]優(yōu)選，步驟c)中細菌的培養(yǎng)時間為24~28h，真菌的培養(yǎng)時間為48飛6h。
[0013]進一步，步驟d)中的發(fā)酵罐為集發(fā)酵、干燥粉碎為一體的臥式固態(tài)生物反應器。
[0014]進一步，步驟drg)中物料的含菌量的檢測方法為:用500ml或250ml三角瓶裝IOOml含蛋白胨0.5%和蔗糖2%的營養(yǎng)液經高壓滅菌冷卻后，放待測益生菌孢子粉0.1g或高孢粉4mg，置于140rpm搖床上28°C 土 TC培養(yǎng)24h，再用無菌水進行梯度稀釋后，取樣制片鏡檢，鏡檢時用血球計數(shù)板進行計數(shù)，記錄每個中格發(fā)芽孢子(孢子膨脹比原孢大I倍或芽長度大于孢子半徑的)與未發(fā)芽孢子數(shù)，含菌量(XlO8 / g)= (4個中格孢子總數(shù)X4X10X稀釋倍數(shù))/ 100 ；
活菌率:物料的活菌率(%)=發(fā)芽孢子數(shù)/ (發(fā)芽孢子數(shù)+未發(fā)芽孢子數(shù))X 100%。[0015]進一步，步驟f)益生菌高孢粉抽提操作為:先打開旋風分離集孢器的抽風機開關進行抽風，使集孢器內形成負壓，然后打開進料口投入步驟e)所得的益生菌孢子粉，關閉進料口后，啟動集孢器，用正、反方向交替攪拌揚孢6~8min，得到高孢粉，打開殘渣出口，將殘渣排出即可。
[0016]進一步，步驟a)、)中的所述益生菌中的細菌為益生菌中的細菌為枯草芽抱桿菌枯草亞種{Bacillus subtilis、、植物乳桿菌{Lactobacillus plan tarum)和雙歧桿菌{Bifidobacterium)中的一種或多種，益生菌中的真菌為釀酒酵母{Saccharomycere vi siae Hansen)或 / 和米曲霉{Aspergillus Orvzae) 0
[0017]進一步，該方法發(fā)酵得到的益生菌孢子粉以0.05、.15%的劑量添加到獸禽類飼料，或以0.10-θ.20%的劑量添加到獸禽飲水中。
[0018]本發(fā)明一種固態(tài)發(fā)酵生產益生菌孢子粉的方法的有益效果:
1)方法采用固態(tài)發(fā)酵制備益生菌孢子粉，降低了生產過程中雜菌的污染率，發(fā)酵過程能耗低；
2)固態(tài)發(fā)酵過程采用稻殼和麥麩作為培養(yǎng)基，在發(fā)酵結束后還可以作為益生菌的吸附載體，減少益生菌孢子粉制備過程中填充料的用量；
3)產物濃度高，提取工藝簡單；
4)整個生產過程零廢液排放；
5)該方法采用集發(fā)酵、干燥粉碎為一體的臥式固態(tài)生物反應器，簡化操作工序，縮短了生產周期，節(jié)約能耗，提高生產效率； 【專利附圖】

【附圖說明】
[0019]圖1—為本發(fā)明一種固態(tài)發(fā)酵生產益生菌孢子粉的方法采用的集發(fā)酵、干燥粉碎為一體的臥式固態(tài)生物反應器的結構示意圖。
【具體實施方式】
[0020]以下結合附圖及實施例對本發(fā)明作進一步說明。
[0021]參照圖1:集發(fā)酵、干燥粉碎為一體的臥式固態(tài)生物反應器(簡稱臥式固態(tài)生物反應器)I，為雙錐圓筒臥式固態(tài)生物反應器，公稱容積為3000L，裝料系數(shù)為0.6^0.70 ;臥式固態(tài)生物反應器I帶有雙向S型螺旋攪拌槳1-1 ;臥式固態(tài)生物反應器I頂部依次設有料液進口 1-2、排氣口 1-3、壓力表1-4和進氣口 1-5，臥式固態(tài)生物反應器I底部設有排污口1-6，臥式固態(tài)生物反應器I前端右上側設有進料口 1-7，臥式固態(tài)生物反應器I前端左下側設有出料口 1-8，進料口 1-7和出料口 1-8均設有視窗1-9 ;臥式固態(tài)生物反應器I外側設有夾套1-10，夾套1-10的下側設有進水口 1-101，夾套110的上側設有出水孔1-102 ;臥式固態(tài)生物反應器I中部連有濕度計、PH計、溶氧電極和溫度計。
[0022]物料的含菌量的檢測方法為:用500ml或250ml三角瓶裝IOOml含蛋白胨0.5%和
蔗糖2%的營養(yǎng)液經高壓滅菌冷卻后，放待測益生菌孢子粉0.1g或高孢粉4mg，置于140rpm搖床上28°C ±1°C培養(yǎng)24h，再用無菌水進行梯度稀釋后，取樣制片鏡檢，鏡檢時用血球計數(shù)板進行計數(shù)，記錄每個中格發(fā)芽孢子(孢子膨脹比原孢大I倍或芽長度大于孢子半徑的)與未發(fā)芽孢子數(shù)，含菌量(XlO8 / g)= (4個中格孢子總數(shù)X4X10X稀釋倍數(shù))/ 100。[0023]活菌率:物料的活菌率(%)=發(fā)芽孢子數(shù)/ (發(fā)芽孢子數(shù)+未發(fā)芽孢子數(shù))X 100%。
[0024]物料濕度的測定方法:先將玻皿在120°C干燥箱內烘干，15min后取出稱重(用萬分之一的分析天平)，再稱5g孢子粉于皿內，在120°C干燥箱內定溫烘2h，取出立即將樣品和玻皿，一起稱重，每個樣品做三個重復，取其平均值，按公式:物料濕度) = [ (5-烘干后重量)/ 5] X 100%進行計算物料濕度。
[0025]實施例1: a)培養(yǎng)基制備:
茄子瓶培養(yǎng)基:組成成分為馬鈴薯20%、蛋白胨0.5%、葡萄糖2%、磷酸二氫鉀0.05%、硫酸鎂 0.03%、瓊脂 2.0%、ρΗ 為 7.0，121。。，0.1MPa 滅菌 15min，備用；
種子擴大培養(yǎng)的培養(yǎng)基:組成成分為米糠10%、花生柏5%、蛋白胨1.0%、蔗糖2%、瓊脂2%, pH 為 6.5，121。。，0.1MPa 滅菌 20min，備用；
固體發(fā)酵培養(yǎng)基:由稻殼和麥麩組成，組成比例為3:7,固體培養(yǎng)基的含水率為60%wt, pH自然，95°C滅菌60min,備用；
b)益生菌菌種活化:將冷凍管中或斜面培養(yǎng)保存的枯草芽孢桿菌枯草亞種CICC20822(.Bacillus)、植物乳桿菌 CICC21790 {Lactobacillus plan tarum)以及釀酒酵母CICC31830 {Saccharomycerevisiae Hansen)轉接至爺子瓶內靜置培養(yǎng)，細菌在34± 1°C靜置培養(yǎng)24h，真菌在27°C ±1°C靜置培養(yǎng)48h;
c)益生菌種懸液的制備:將步驟b)培養(yǎng)好的細菌或真菌按1:100的接種量轉接至種子罐中進行固態(tài)培養(yǎng)，罐壓為0.05MPa,通風量為0.1vvm,攪拌速度為0.2rpm,細菌在34± 1°C培養(yǎng)36h后轉至適量的無菌水中，并采用血球計數(shù)板直接計數(shù)法進行計數(shù)，使菌懸液含菌量在1.15X107 cfu/g ;真菌在27°C ± 1°C培養(yǎng)54h至適量的無菌水中，并采用血球計數(shù)板直接計數(shù)法進行計數(shù)，使菌懸液含菌量在3.0 X 106cfu/g ；
d)益生菌固態(tài)發(fā)酵:
將滅菌好的固體發(fā)酵培養(yǎng)基放入集發(fā)酵、干燥粉碎為一體的臥式固態(tài)生物反應器內，然后分別發(fā)酵步驟c)中的細菌和真菌；
將步驟c)得到的細菌菌懸液按固體發(fā)酵培養(yǎng)基的重量2.0%轉接至固體發(fā)酵培養(yǎng)基中，罐壓為0.02MPa，通風量為0.2vvm，攪拌速度為1.0rpm，培養(yǎng)溫度控制在34土 1°C，物料濕度控制在56± 1.0%，枯草芽孢桿菌枯草亞種在48h取樣檢測物料的含菌量時，含菌量為
6.5X109cfu/g，活菌率為95.2%時，48h停止發(fā)酵；
相同發(fā)酵條件下，植物乳桿菌在46h取樣檢測物料的含菌量時，含菌量為7.2 X IO9Cfu/g，活菌率為96.4%時，46h停止發(fā)酵；
將步驟c)得到的釀酒酵母菌懸液按固體發(fā)酵培養(yǎng)基的重量4.0%轉接至固體發(fā)酵培養(yǎng)基中，罐壓為0.02MPa，通風量為0.2vvm，攪拌速度為0.8rpm，培養(yǎng)溫度為27±1°C，物料濕度控制在60± 1.0%，釀酒酵母在58h取樣檢測物料的活菌量時，活菌量為6.5X108cfu/g,活菌率為96.7%時，58h停止發(fā)酵；
e)益生菌孢子粉干燥及粉碎:在發(fā)酵結束后，將發(fā)酵罐的溫度調至60±1°C、攪拌速度調至5rpm，干燥12h后，孢子粉的含水率為11.70%，然后，通過提高攪拌速度至20rpm進行粉碎；
f)益生菌高孢粉抽提:采用旋風分離集孢器進行抽提得到高孢粉，先打開旋風分離集孢器的抽風機開關進行抽風，使集孢器內形成負壓，然后打開進料口投入步驟e)所得的益生菌孢子粉，關閉進料口后，啟動集孢器，用正、反方向交替攪拌揚孢6~8min，得到高孢粉，打開殘渣出口，將殘渣排出即可；然后根據所需的含孢量，在抽提得到的高孢粉中加入填充料，混合，然后將細菌和真菌的高孢粉按重量5:5進行混合得到益生菌孢子粉；
g)益生菌成品質檢及包裝:對益生菌孢子粉的含菌量、活菌率及含水率進行檢測，并將益生菌孢子粉按規(guī)定規(guī)格進行包裝，包裝袋內應放孢子粉使用說明書，包裝外貼有標簽。標簽內容包括益生菌孢子粉的含菌量、活菌率及含水率、細度、生產日期、檢驗人、使用方法、毛重、凈重、有效期等。
[0026]通過該生產方法得到含4.55X1010cfu/g枯草芽孢桿菌枯草亞種、5.13 X IO10Cfu/g植物乳桿菌和5.21 X 109cfu/g釀酒酵母，含水率為11.70%的益生菌孢子粉。
[0027]實施例2:
a)培養(yǎng)基制備:
茄子瓶培養(yǎng)基:葡萄糖改用蔗糖，其他同實施例1 ;
種子擴大培養(yǎng)的培養(yǎng)基:組成成分為麥麩7%、豆柏3.0%、蛋白胨0.7%、蔗糖2%、瓊脂2%, pH 為 7.0，121。。，0.1MPa 滅菌 20min，備用；
固體發(fā)酵培養(yǎng)基:由稻殼和麥麩組成，組成比例為5:5,固體培養(yǎng)基的含水率為50%wt, pH自然，90°C滅菌80min,備用；
b)益生菌菌種活化:將冷 凍管中或斜面培養(yǎng)保存的枯草芽孢桿菌枯草亞種CICC20822(.Bacillus subtil is、以及釀酒酵母 CICC31380 {Saccharomycere vi siae Hansen)和米曲霉CICC41383 {Aspergillus Orvzae)轉接至茄子瓶內靜置培養(yǎng)，細菌在39± 1°C靜置培養(yǎng)24h，真菌在25°C ±1°C靜置培養(yǎng)48h;
c)益生菌種懸液的制備:將步驟b)培養(yǎng)好的細菌或真菌按1:80的接種量轉接至種子罐中進行固態(tài)培養(yǎng)，罐壓為0.05MPa,通風量為0.2vvm,攪拌速度為0.2rpm,細菌在39± 1°C培養(yǎng)24h后轉至適量的無菌水中，并采用血球計數(shù)板直接計數(shù)法進行計數(shù)，使菌懸液含菌量在1.5X107 cfu/g;真菌在25°C ±1°C培養(yǎng)60h至適量的無菌水中，并采用血球計數(shù)板直接計數(shù)法進行計數(shù)，使菌懸液含菌量在5.0 X IO6 cfu/g ；
d)益生菌固態(tài)發(fā)酵:
將滅菌好的固體發(fā)酵培養(yǎng)基放入集發(fā)酵、干燥粉碎為一體的臥式固態(tài)生物反應器內，然后分別發(fā)酵步驟c)中的細菌和真菌；
將步驟c)得到的枯草芽孢桿菌枯草亞種菌懸液按固體發(fā)酵培養(yǎng)基的重量1.0%轉接至固體發(fā)酵培養(yǎng)基中，罐壓為0.03MPa，通風量為0.25vvm，攪拌速度為1.2rpm，培養(yǎng)溫度控制在39 ± I °C，物料濕度控制在65 ± 1.0%，枯草芽孢桿菌枯草亞種52h取樣檢測物料的含菌量時，含菌量為8.4X109cfu/g,活菌率為95.8%時，52h停止發(fā)酵；
將步驟c)得到的真菌菌懸液按固體發(fā)酵培養(yǎng)基的重量2.0%轉接至固體發(fā)酵培養(yǎng)基中，罐壓為0.03MPa,通風量為0.23vvm,攪拌速度為1.0rpm,培養(yǎng)溫度為25 ± I °C，物料濕度控制在57± 1.0%，釀酒酵母在61h取樣檢測物料的含菌量時，含菌量為6.9 X 108cfu/g,活菌率為96.1%時，61h停止發(fā)酵；
相同發(fā)酵條件下，米曲霉在65h取樣檢測物料的活菌量時，活菌量為6.5 X 108cfu/g,活菌率為97.3%時，65h停止發(fā)酵；e)益生菌孢子粉干燥及粉碎:在發(fā)酵結束后，將發(fā)酵罐的溫度調至60±1.(TC、攪拌速度調至5rpm,干燥8h后,孢子粉的含水率為11.45%,然后,通過提高攪拌速度至15rpm進行粉碎；
f)益生菌高孢粉抽提:同實例1，然后將細菌和真菌的孢子粉按重量6:4進行混合得到益生菌孢子粉；
g)益生菌成品質檢及包裝:同實例I。
[0028]通過該生產方法得到含5.89X 10lclcfu/g枯草芽孢桿菌枯草亞種、5.92X 109cfu/g釀酒酵母和5.21X109cfu/g米曲霉，含水率為11.45%的益生菌孢子粉。
[0029]實施例3:
a)培養(yǎng)基制備:
爺子瓶培養(yǎng)基:同實施例1 ;
種子擴大培養(yǎng)的培養(yǎng)基:組成成分為麥麩10%、豆柏5.0%、蛋白胨0.5%、蔗糖2%、瓊脂2%, pH 為 6.8，121 °C，0.1MPa 滅菌 20min，備用；
固體發(fā)酵培養(yǎng)基:由稻殼和麥麩組成，組成比例為4:6,固體培養(yǎng)基的含水率為55%wt, pH自然，92°C滅菌70min,備用；
b)益生菌菌種活化:將冷凍管中或斜面培養(yǎng)保存的枯草芽孢桿菌枯草亞種CICC20822(.Bacillus 仰況/7/5.)、植物乳桿菌 CICC21790plan tarum)和雙歧桿菌CICC6185 (Bi fi dobac teri um Breve)以及釀酒酵母 CICC31380 {Saccharomycere vi siaeHansen)和米曲霉CICC41383 Orvzae)轉接至爺子瓶內靜置培養(yǎng),細菌在36±1°C靜置培養(yǎng)24h，真菌在28 °C ±1°C靜置培養(yǎng)48h ；
c)益生菌種懸液的制備:將步驟b)培養(yǎng)好的細菌或真菌按1:50的接種量轉接至種子罐中進行固態(tài)培養(yǎng)，罐壓為0.05MPa,通風量為0.2vvm,攪拌速度為0.15rpm,細菌在36±1°C培養(yǎng)28h后轉至適量的無菌水中，并采用血球計數(shù)板直接計數(shù)法進行計數(shù)，使菌懸液含菌量在1.30X 107 cfu/g ;真菌在28°C ± 1°C培養(yǎng)48h至適量的無菌水中，并采用血球計數(shù)板直接計數(shù)法進行計數(shù)，使菌懸液含菌量在4.50 X IO6 cfu/g ；
d)益生菌固態(tài)發(fā)酵:
將滅菌好的固體發(fā)酵培養(yǎng)基放入集發(fā)酵、干燥粉碎為一體的臥式固態(tài)生物反應器內，然后分別發(fā)酵步驟c)中的細菌和真菌；
將步驟c)得到的細菌菌懸液按固體發(fā)酵培養(yǎng)基的重量1.5%轉接至固體發(fā)酵培養(yǎng)基中，罐壓為0.05MPa,通風量為0.23vvm,攪拌速度為0.8rpm,培養(yǎng)溫度控制在36 ± I °C，物料濕度控制在60± 1.0%，枯草芽孢桿菌枯草亞種在52h取樣檢測物料的含菌量時，含菌量為
6.7 X 109cfu/g,活菌率為95.6%時，52h停止發(fā)酵；
相同發(fā)酵條件下，植物乳桿菌在45h取樣檢測物料的含菌量時，含菌量為5.95X 109cfu/g，活菌率為97.5%時，45h停止發(fā)酵；
相同發(fā)酵條件下，雙歧桿菌在50h取樣檢測物料的含菌量時，含菌量為7.35X IO9Cfu/g，活菌率為96.3%時，50h停止發(fā)酵；
將步驟c)得到的真菌菌懸液按固體發(fā)酵培養(yǎng)基的重量3.0%轉接至固體發(fā)酵培養(yǎng)基中，罐壓為0.05MPa,通風量為0.25vvm,攪拌速度為0.8rpm,培養(yǎng)溫度為28°C ± I °C，物料濕度控制在64±1.0%，釀酒酵母在61h取樣檢測物料的含菌量時，含菌量為6.45X 108cfu/g,活菌率為97.0%時，61h停止發(fā)酵；
相同發(fā)酵條件下，米曲霉在65h取樣檢測物料的活菌量時，活菌量為5.80X 108cfu/g,活菌率為97.8%時，65h停止發(fā)酵；
e)益生菌孢子粉干燥及粉碎:在發(fā)酵結束后，將發(fā)酵罐的溫度調至60±1.(TC、攪拌速度調至5rpm,干燥IOh后,孢子粉的含水率為11.85%,然后,通過提高攪拌速度至18rpm進行粉碎；
f)益生菌高孢粉抽提:同實例1，然后將細菌和真菌的孢子粉按重量8:2進行混合得到益生菌孢子粉；
g)益生菌成品質檢及包裝:同實例I。
[0030]通過該生產方法得到含4.69 X IOltlCfu/g枯草芽孢桿菌枯草亞種、4.16 X IO10Cfu/g植物乳桿菌、5.27X1010cfu/g雙歧桿菌、5.13X 109cfu/g釀酒酵母和4.78X 109cfu/g米曲霉，含水率為11.85%的益生菌孢子粉。
[0031]實施例4:
a)培養(yǎng)基制備:
茄子瓶培養(yǎng)基:葡萄糖改用蔗糖，其他同實施例1 ;
種子擴大培養(yǎng)的培養(yǎng)基:組成成分為麥麩7%、豆柏3.0%、蛋白胨0.7%、蔗糖2%、瓊脂2%, pH 為 7.0，121。。，0.1MPa 滅菌 20min，備用；
固體發(fā)酵培養(yǎng)基:由稻殼和麥麩組成，組成比例為5:5,固體培養(yǎng)基的含水率為50%wt, pH自然，90°C滅菌80min,備用；
b) 益生菌菌種活化:將冷凍管中或斜面培養(yǎng)保存的枯草芽孢桿菌枯草亞種CICC20822{Bacillus subtilis、、植物乳桿菌 CICC21790 {Lactobacillus plan tarum)、雙歧桿菌CICC6185 (Bi fi dobac teri um Breve)以及米曲霉 CICC41383 045/76?/及_/77"5.CrFzae)轉接至茄子瓶內靜置培養(yǎng)，細菌在37± I°C靜置培養(yǎng)24h，真菌在30°C ±1°C靜置培養(yǎng)48h ；
c)益生菌種懸液的制備:將步驟b)培養(yǎng)好的細菌或真菌按1:60的接種量轉接至種子罐中進行固態(tài)培養(yǎng)，罐壓為0.05MPa，通風量為0.15vvm，攪拌速度為0.lOrpm，細菌在37土 1°C培養(yǎng)26h后轉至適量的無菌水中，并采用血球計數(shù)板直接計數(shù)法進行計數(shù)，使菌懸液含菌量在1.35X IO7 cfu/g ;真菌在30°C ± 1°C培養(yǎng)44h至適量的無菌水中，并采用血球計數(shù)板直接計數(shù)法進行計數(shù)，使菌懸液含菌量在4.75 X IO6 cfu/g ；
d)益生菌固態(tài)發(fā)酵:
將滅菌好的固體發(fā)酵培養(yǎng)基放入集發(fā)酵、干燥粉碎為一體的臥式固態(tài)生物反應器內，然后分別發(fā)酵步驟c)中的細菌和真菌；
將步驟c)得到的細菌菌懸液按固體發(fā)酵培養(yǎng)基的重量1.2%轉接至固體發(fā)酵培養(yǎng)基中，罐壓為0.04MPa,通風量為0.22vvm,攪拌速度為1.2rpm,培養(yǎng)溫度控制在37土 TC，物料濕度控制在62± 1.0%，枯草芽孢桿菌枯草亞種48h取樣檢測物料的含菌量時，含菌量為
8.7X109cfu/g，活菌率為96.5%時，48h停止發(fā)酵；
相同發(fā)酵條件下，植物乳桿菌在46h取樣檢測物料的含菌量時，含菌量為
7.85X 109cfu/g，活菌率為96.8%時，46h停止發(fā)酵；
相同發(fā)酵條件下，雙歧桿菌在52h取樣檢測物料的含菌量時，含菌量為6.94X IO9Cfu/g，活菌率為97.1%時，52h停止發(fā)酵；將步驟C)得到的米曲霉菌懸液按固體發(fā)酵培養(yǎng)基的重量2.5%轉接至固體發(fā)酵培養(yǎng)基中，罐壓為0.04MPa,通風量為0.23vvm,攪拌速度為0.8rpm,培養(yǎng)溫度為30 ± I °C，物料濕度控制在65 ±1.0%，米曲霉在62h取樣檢測物料的活菌量時，活菌量為7.15X108cfu/g，活菌率為96.4%時，62h停止發(fā)酵；
e)益生菌孢子粉干燥及粉碎:在發(fā)酵結束后，將發(fā)酵罐的溫度調至60±1.(TC、攪拌速度調至5rpm，干燥8h后，孢子粉的含水率為11.27%，然后，通過提高攪拌速度至15rpm進行粉碎；
f)益生菌高孢粉抽提:同實例1，然后將細菌和真菌的孢子粉按重量6:4進行混合得到益生菌孢子粉；
g)益生菌成品質檢及包裝:同實例I。
[0032] 通過該生產方法得到含6.09X1010cfu/g枯草芽孢桿菌枯草亞種、5.47 X IO10Cfu/g植物乳桿菌、4.95X 101Qcfu/g雙歧桿菌和5.36X 109cfu/g米曲霉，含水率為11.27%的益生菌孢子粉。
【權利要求】
1.一種固態(tài)發(fā)酵生產益生菌孢子粉的方法，其特征在于，包括以下步驟: a)培養(yǎng)基制備: 茄子瓶培養(yǎng)基:組成成分為馬鈴薯20%、蛋白胨0.5%、葡萄糖或蔗糖2%、磷酸二氫鉀0.05%、硫酸鎂 0.03%、瓊脂 1.5~2%、pH 為 6.5~7.0 ； 種子擴大培養(yǎng)的培養(yǎng)基:組成成分為米糠7~10%或麥麩2~10%、花生柏或豆柏2飛％、蛋白胨0.5~1.0%、蔗糖2%、瓊脂2%，pH為6.0~7.0 ； 固體發(fā)酵培養(yǎng)基:由稻殼和麥麩組成，組成比例為3:7~5:5,固體培養(yǎng)基的含水率為50% wt ~60% wt, pH 自然； b)益生菌菌種活化:將冷凍管中的菌體或斜面培養(yǎng)保存的菌種轉接至茄子瓶內培養(yǎng)； c)益生菌種懸液的制備:將步驟b)培養(yǎng)好的細菌或真菌按l:100:l:50的接種量轉接至種子罐中進行固態(tài)培養(yǎng)，罐壓為0.05MPa,通風量為0.1-0.2vvm,攪拌速度為0.1-0.2rpm，細菌在34~39°C培養(yǎng)24~36h后轉至適量的無菌水中，使菌懸液含菌量在1.(Tl.5X107cfu/g ;真菌在25~30°C培養(yǎng)44~60h至適量的無菌水中，使菌懸液含菌量在3.0~5.0X106cfu/g ； d)益生菌固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng): 將步驟c)得到的細菌菌懸液按固體發(fā)酵培養(yǎng)基的重量f 2%轉接至固體發(fā)酵培養(yǎng)基中，罐壓為0.02~0.05MPa,通風量為0.2~0.25vvm,攪拌速度為0.8~1.2rpm,培養(yǎng)溫度為34~39°C，物料濕度控制在55~65%，45~55h內每2h取樣檢測物料的含菌量，當含菌量≥5.0X 109cfu/g且活菌率高于95%時，停止發(fā)酵； 將步驟c)得到的真菌菌懸液按固體發(fā)酵培養(yǎng)基的重量21%轉接至固體發(fā)酵培養(yǎng)基中，罐壓為0.02~0.05MPa,通風量為0.2~0.25vvm,攪拌速度為0.8~1.2rpm,培養(yǎng)溫度為25~30°C，物料濕度控制在55~65%，57~66h內每2h取樣檢測物料的活菌量，當活菌量≥5.0X 108cfu/g且活菌率高于95%時，停止發(fā)酵； e)益生菌孢子粉干燥及粉碎:在發(fā)酵結束后，將發(fā)酵罐的溫度調至60°C、攪拌速度調至3飛rpm，干燥至孢子粉的含水率低于12%，并通過提高攪拌速度進行粉碎； f)益生菌高孢粉抽提:采用旋風分離集孢器進行抽提得到高孢粉，然后根據所需的含孢量，并在高孢粉中加入填充料，混合，再根據益生菌孢子粉的配方將細菌和真菌高孢粉按重量比例為8:2飛:5進行混合過篩得到益生菌孢子粉； g)益生菌孢子粉成品質檢及包裝。
2.如權利要求1所述一種固態(tài)發(fā)酵生產益生菌孢子粉的方法，其特征在于，所述步驟a)中的茄子瓶培養(yǎng)基和種子擴大培養(yǎng)的培養(yǎng)基在121°C，0.1MPa滅菌15~20min，固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基在90~95°C，滅菌6(T80min，備用。
3.如權利要求1所述一種固態(tài)發(fā)酵生產益生菌孢子粉的方法，步驟b)中所述的益生菌活化培養(yǎng)條件為:細菌在32±1°C靜置培養(yǎng)24h，真菌在25±1°C靜置培養(yǎng)48h。
4.如權利要求1所述一種固態(tài)發(fā)酵生產益生菌孢子粉的方法，步驟c)中所述的菌懸液含菌量采用血球計數(shù)板直接計數(shù)法進行計數(shù)。
5.如權利要求1所述一種固態(tài)發(fā)酵生產益生菌孢子粉的方法，所述步驟c)中細菌的培養(yǎng)時間為24~28h，真菌的培養(yǎng)時間為48~56h。
6.如權利要求1所述一種固態(tài)發(fā)酵生產益生菌孢子粉的方法，步驟d)中所述的發(fā)酵罐為集發(fā)酵、干燥粉碎為一體的臥式固態(tài)生物反應器。
7.如權利要求1所述一種固態(tài)發(fā)酵生產益生菌孢子粉的方法，所述步驟d)、)中物料的含菌量的檢測方法為:用500ml或250ml三角瓶裝100ml含蛋白胨0.5%和蔗糖2%的營養(yǎng)液經高壓滅菌冷卻后，放待測益生菌孢子粉0.1g或高孢粉4mg，置于140rpm搖床上28°C ± 1°C培養(yǎng)24h，再用無菌水進行梯度稀釋后，取樣制片鏡檢，鏡檢時用血球計數(shù)板進行計數(shù)，記錄每個中格發(fā)芽孢子(孢子膨脹比原孢大1倍或芽長度大于孢子半徑的)與未發(fā)芽孢子數(shù)，含菌量(X108 / g)= (4個中格孢子總數(shù)X4X10X稀釋倍數(shù))/ 100 ； 活菌率:物料的活菌率(%)=發(fā)芽孢子數(shù)/ (發(fā)芽孢子數(shù)+未發(fā)芽孢子數(shù))X 100%。
8.如權利要求1所述一種固態(tài)發(fā)酵生產益生菌孢子粉的方法，步驟f)所述的益生菌高孢粉抽提操作為:先打開旋風分離集孢器的抽風機開關進行抽風，使集孢器內形成負壓，然后打開進料口投入步驟e)所得的益生菌孢子粉，關閉進料口后，啟動集孢器，用正、反方向交替攪拌揚孢6~8min，得到高孢粉，打開殘渣出口，將殘渣排出即可。
9.如權利要求廣8任一項所述一種固態(tài)發(fā)酵生產益生菌孢子粉的方法，其特征在于，步驟a)-e)中的所述益生菌中的細菌為枯草芽孢桿菌枯草亞種{Bacillus植物乳桿菌{Lactobacillus plantarum)和雙歧桿菌{Bifidobacterium)中的一種或多種，益生菌中的真菌為釀酒酵母{Saccharomycerevisiae Hansen)或/和米曲霉{AspergillusOrvzae)。
10.如權利要求1-8任一項所述一種固態(tài)發(fā)酵生產益生菌孢子粉的方法，其特征在于，所述方法發(fā)酵得到的益生菌孢子粉以0.05-0.15%的劑量添加到獸禽類飼料，或以0.10-0.20%的劑量添加到獸禽飲水中。
【文檔編號】C12R1/25GK103468630SQ201310464827
【公開日】2013年12月25日 申請日期:2013年10月9日 優(yōu)先權日:2013年10月9日
【發(fā)明者】向洋, 向夢蘭 申請人:長沙理工大學